Bestämning av myosin ATPas med NADH-
kopplade mätsystem jämfört med in vitro
motilitet med isolerat myosin och aktin
Rahaf Soudan
Biomedicinsk laborationsvetenskap Grundnivå
Bestämning av myosin ATPas med NADH-kopplade mätsystem jämfört med in vitro motilitet med isolerat myosin och aktin
Rahaf Soudan
Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15hp Filosofie Kandidatexamen
Handledare:
Marko Ušaj Institutionen för kemi och biomedicin, Linnéuniversitetet
391 82 Kalmar Examinator:
Sven Tågerud Institutionen för kemi och biomedicin, Linnéuniversitetet
391 82 Kalmar
Examensarbetet ingår i biomedicinska analytikerprogrammet 180 hp
Sammanfattning
Syftet med denna studie var att jämföra NADH-kopplade mätsystem och in vitro motilitets-analys (IVMA) för att bestämma aktiviteten hos isolerat myosin. Från NADH-kopplade analysmätningar bestämdes tre parameter: den maximala hastigheten med vilken myosin hydrolyserar ATP i frånvaro av F-aktin (V0), den maximala ATPas- hastigheten för myosin i närvaro av mättande aktin (kcat) och den koncentration av aktin som behövs för att nå halv maximal aktivering av myosin ATPas-aktivitet (KATPas). Från in vitro-motilitetsanalys (IVMA) bestämdes två parametrar: fraktion av rörliga filament (FMF) och totala antalet rörliga filament (TMF). Från detta kunde vi uppskatta den fraktion av aktiva huvuden i myosinpreparationer som behövs för en lyckad IVMA.
Myosin är ett protein som tillsammans med aktin är ansvarigt för muskelkontraktionen.
I denna studie används två myosin preparationer (HMM-fragment) som vi betecknade
”bra HMM” och ”dåligt HMM” på grund av deras kvalitet för aktin motilitet. Först mättes ATPas-aktiviteten hos myosinmotorer med hjälp av ett NADH-kopplat mätsystem som bygger på övervakning av förändringen i absorbans av NADH.
Därefter bestämdes V0, kcat, och KATPas för aktin-beroende av myosin-ATPast genom att mäta myosinaktivitet vid olika aktinkoncentrationer, följt av anpassning av data till Michaelis-Menten ekvationen.
Parallellt utfördes IVMA-studier genom att HMM immobiliserades på ett objektglas som derivatiserats med trimetylklorsilan. Sedan observerades när HMM flyttar fram fluorescensmärkta aktinfilament i närvaro av ATP.
Under samma förhållanden gav resultaten för basalt myosin ATPas aktivitet V0 värden som var ~0,03 ATP s-1 myosinhuvud -1 for både dåligt och bra HMM.
I en jämförelse mellan de två HMM vid olika F-aktin-koncentrationer var hastighet i ATP-förbrukningen högre för bra än för dåligt HMM.
Anpassning av data till Michaelis-Menten-ekvationen gav kcat på 7,18 ATP s-1 myosinhuvud-1 för dåligt HMM jämfört med 11,21 ATP s-1 myosinhuvud-1 för bra HMM (35 % högre). KATPas (Km) för dåligt HMM var lite högre jämfört med den för bra HMM. Vid IVMA-studierna var FMF och TMF 80 % respektive 98 % lägre för dåligt än bra HMM. Slutsatsen var att de två metoderna karakteriserar HMM-funktionen på olika sätt och med olika känslighet.
Om man antar att bra HMM har nästan 100 % aktiva huvuden och eftersom man vet att uppmätt kcat är direkt proportionellt mot antalet aktiva myosinhuvuden ser man från dessa mätningar att mycket mer än 65 % av totalt myosin måste vara aktivt för att ge god aktinmotilitet i en IVMA.
Nyckelord
Myosin, Actomyosin, heavy meromyosin, NADH-kopplade mätsystem, in vitro- motilitetsanalys (IVMA).
Abstract
The purpose of this study was to compare an NADH-linked ATPas assay and an in vitro motility assay (IVMA) in determination of myosin activity and estimation of the
fraction of active heads in myosin preparations needed for a successful IVMA.
Myosin is a protein that together with actin is responsible for muscle contraction and relaxation. In this study, steady-state ATPas activity of myosin motors was measured with the NADH-linked measurement system based on monitoring the change in absorbance of NADH and measuring ATP consumption based on the amount of ADP formed. We used proteolytic motor fragments in the form of heavy meromyosin (HMM) from two myosin preparations. One HMM with high (“good HMM”) and one with low (“bad HMM”) activity was studied.
Then the maximum rate at which myosin hydrolyzes ATP in the absence of F-actin (V0), the maximum ATPas rate of myosin in the presence of saturating actin (kcat) and the concentration of actin needed to achieve half maximal activation of myosin ATPas activity (KATPas) were determined to characterize the actin concentration-dependence of the myosin ATPas based on fits of the Michaelis-Menten equation to the data.
In parallel, IVMAs were performed by attaching HMM to a slide derivatized with trimethylchlorosilane. In this assay the surface adsorbed HMM propels the fluorescently labeled actin filaments in the presence of ATP, which provides the ability to determine the sliding speed and its ATP dependence.
Under the same conditions, the results for basal myosin ATPas activity gave V0 values that were ~ 0.03 ATP s-1 head -1 for both poor and good HMM.
In a comparison between the two HMMs with different F-actin concentrations, the rate of ATP consumption for the good HMM was higher.
The kcat for good HMM was thus 11.21 ATP s-1 head-1 compared to 7.18 ATP s-1 head-1 for the bad HMM.
For the IVMA method, the fraction of motile filaments (FMF) was 80 % lower for the bad than the good HMM and the total number of motile filament (TMF) was 98 % lower for the bad HMM.
The conclusion was that the two methods characterize the HMM function in different ways and with different sensitivity. The NADH-linked measurement system method allowed quantification of differences in the number of active myosin heads between preparations while the IVMA method was highly sensitive to the fraction of non- functional dead myosin heads. Assuming that good HMM has almost 100% active heads and since it is known that measured kcat is directly proportional to the number of active myosin heads, it is seen from these measurements that much more than 65% of total myosin must be active to provide good actin motility in IVMA.
Förkortningar
ADP Adenosin 5’-difosfat ATP Adenosin 5’-trifosfat CP Kreatinfosfat
CK Kreatinkinas Pi Oorganiskt fosfat DTT Ditiotreitol
F-aktin Filament aktin (polymer) G-aktin Globulär aktin (monomer) GOX Glukosoxidas
HMM Heavy meromyosin IVMA In vitro motility assay LISS Låg jonstyrka lösning LDH Laktatdehydrogenas
NADH Nikotinamidadenin-dinukleotid PK Pyruvatkinas
PEP Phospho (enol) pyruvat RhPh Rhodamine-Phalloidin TMCS Trimethylchlorosilane
Innehållsförteckning
INTRODUKTION
... 1Skelettmuskel ... 1
Myosin ... 2
Heavy meromyosin (HMM) ... 3
Aktin ... 3
ATPas reaktion ... 4
Metoder i studien ... 5
NADH kopplat mätsystem ... 5
Michaelis–Menten-ekvationen ... 6
In vitro motilitet ssay (IVMA) ... 6
SYFTE
... 7MATERIAL OCH METOD
... 71-NADH kopplat mätsystem ... 7
Buffert och stamlösningar ... 7
Assay-buffertar (AB) ... 8
5X- Cocktail lösning: ... 8
Experiment med myosin ... 8
Experiment med aktomyosin ... 9
Beräkning av reaktionshastighet ... 9
2- In vitro motilitet ssay (IVMA) ... 9
Buffer och lösninger ... 10
Wash buffer (9ml) ... 10
Spädning av rodamin falloidinmärkta aktin-filament (RhPh AF) till 10 nM ... 10
Spädning av HMM till 120µg/ml ... 10
Assay solution: A60 (1200µ) ... 10
Steg för motilitetsanalys på flödescellen ... 10
Etiska aspekter ... 11
RESULTAT ... 11
DISKUSSION ... 16
Etiska aspekter ... 19
Slutsats ... 19
TACKORD ... 20
REFERENSER ... 21
BILAGA 1 ... I
INTRODUKTION
Biomolekylära motorproteiner (såsom aktin-myosin-systemet) har många speciella egenskaper, inklusive hög kraftproduktionskapacitet och förmåga att skapa rörelse med hög hastighet. Detta görs genom hydrolys av ATP som energikälla där kemisk energi omvandlas till mekaniskt arbete (1).
Skelettmuskel
Skelettmuskler är tvärstrimmiga muskler som sitter fast i skelettet och fungerar som
”biologiska motorer” för viljemässiga rörelser. Muskelfibrer är enskilda celler i
skelettmuskulaturen, som består av tusentals myofibriller ordnade parallellt. Den minsta funktionella enheten i myofibrillerna är sarkomeren, som är de sammandragande
enheterna i tvärstrimmiga muskler. Sarkomeren definieras som området mellan två Z- band (Figur1), och det består av tjocka trådar som framför allt utgörs av
myosinmolekyler, och tunna filament som i sin tur består av aktin, tropomyosin och troponin. De tjocka trådarna ansluts till Z-banden via stora tunna elastiska proteiner som kallas för titin, som håller de tjocka filamenten centrerade i sarkomeren medan de tunna filamenten är direkt anslutna till Z-banden. Sarkomererna är de sammandragande enheterna av tvärstrimmiga muskler. De är ca 2 µm långa och ligger efter varandra i varje myofibrill som byggs upp av tusentals sarkomerer i en serie (2, 3).
Figur 1: Struktur av skelettmuskler som innehåller många muskelfibrer med myofibriller. Figur från referens (2). Detta arbete är licensierat under Creative Commons Attribution 4.0
International License. För att se en kopia av denna licens,
besök http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ eller skicka ett brev till Creative Commons, PO Box 1866, Mountain View, CA 94042, USA.
H-bandet är området runt M-linjen där det inte finns koppling mellan tjocka och tunna filamenten. I-bandet är den del av sarkomeren som ligger närmast Z-bandet utan myosins tjocka filament, medan A-bandet är det totala avståndet längs sarkomerer med myosins tjocka filament (Figur 2) (3).
Figur 2: Schematisk bild av sarkomerstruktur. Glidingen av tjocka filament (myosin) förbi överlappande tunna trådar (Aktin) leder till förkortning av sarkomeren utan att längden av
myosin eller aktin ändras; H- zonen och I-bandet reduceras emellertid i längd.
Myosin
Myosin är ett motorprotein som omvandlar kemisk energi (genom ATP-hydrolys) till mekanisk energi. Tillsammans med aktin är det ansvarigt för muskelkontraktion, eftersom dess huvudsakliga funktion (tillsammans med aktin) är att generera styrka och rörelse (3, 4).
Myosin II är en klass av myosinfamiljen och finns i hjärtat, skelettmuskler, glatta muskler och som även ligger bakom förmågan hos icke-muskelceller att röra sig (5).
Myosin är en stor asymmetrisk molekyl med två globulära huvuden och en lång svans (bestående av en ”coiled-coil”). De två huvuden har ett bindningsställe för aktin och ett bindningsställe för ATP. Myosins huvuddomän använder ATP-hydrolys för att generera energi och flytta sig längs filamenten. Myosin II innehåller två tunga kedjor, som utgörs av en huvuddomän respektive en svansdomän. Var och en av dessa tunga kedjor
innehåller en N-terminal huvuddomän och en C-terminal svans. Den C-termnala
svansen utgörs av en -helix som också bildar en spiralformad dubbelhelix tillsammans med en annan tung kedja och sammanfogar dessa. Halsdomänen bildar en vinkel mellan huvudet och svansen och deltar aktivt i muskelsammandragningen (6).
De långa lindade svansarna i de enskilda myosinmolekylerna sammanfogas och bildar de tjocka filamenten i musklerna mitt emellan Z-banden som avgränsar varje sarkomer.
De kraftproducerande huvuddomänerna sticker ut från sidan av det tjocka filamentet för
att binda till aktinfilament och glida över det. Denna process involverar hydrolys av ATP till ADP och alstring av en mekanisk kraft när myosinmotordomäner interagerar med aktinfilamenten i en cyklisk process (3).
Heavy meromyosin (HMM)
Myosin kan klyvas i ”lätt meromyosin” (LMM) och ”tungt meromyosin” (HMM) med hjälp av ett proteolytiskt enzym såsom trypsin, eller a-chymotrypsin (Figur 3).
Fragmentet HMM änvänds i stor utsträckning för studier av isolerat myosin in vitro bland annat på grund av högre löslighet. Det har också visat sig transportera
aktinfilament med högre hastighet än då myosin i full längd används i IVMA-studier (7).
Figur 3: Schematisk bild av myosinmolekyl som klyves med användning av a-chymotrypsin för att erhålla HMM- och LMM-domäner.
Aktin
Aktin är en familj av globulära proteiner som polymeriseras till trådar med ca 10 nm diameter. Aktin finns således i två olika former: monomerer som kallas G-aktin och polymera filament som kallas F-aktin (ett filament som består av många G-
aktinmonomerer) (8).
Aktin är involverat i många viktiga cellulära processer, såsom muskelkontraktion och cellrörelse. Hos ryggradsdjur har tre huvudtyper av aktinisoformer identifierats, nämligen α, β och γ. Det alfa-aktin som finns i hjärta, skelettmuskelceller och glatt muskulatur är viktigt i muskelkontraktion. De två parallella kedjorna av F-aktin kopplas till varandra så att de bildar en dubbel helixstruktur. G-aktin har en globulär struktur som består av två lober separerade av en slits. Denna struktur representeras av "ATPas vecket", som är det enzymatiska katalysatorcentret som binder ATP och Mg 2+ och bryter ned det förstnämnda till ADP och oorganiskt fosfat (Pi). Den ATP-bundna formen av aktin dominerar i celler när aktin är närvarande i fritt tillstånd, och hydrolys av ATP destabiliserar polymeren (8).
En F-aktinpolymer har strukturell polaritet: änden som visar dess ATP-bindningsställe kallas "(-) -änden", medan den motsatta änden där slitsen är riktad mot en annan intilliggande monomer kallas "(+) -änden". Under fysiologiska förhållanden
polymeriseras G-aktin till F-aktin med ATP bundet till det aktiva sätet (Figur4) (9).
Figur 4: Schematisk bild av ATP-hydrolys hos aktin. Aktinmonomerer (G-monomerer, orange) bär ATP, som hydrolyseras till ADP strax efter att monomererna kopplats in i växande F-aktin
(rosa monomerer). ADP-molekylerna i aktinfilamentet kan inte bytas ut mot ATP förrän aktinenheten som bär dem dissocieras från filamentet.
ATPas reaktion
Ett ATPas är ett enzym som katalyserar hydrolysen av en fosfatbindning i
adenosintrifosfat (ATP) till adenosindifosfat (ADP), fria fosfatjoner (Pi), och energi.
Den energi som frigörs från nedbrytningen av fosfatbindningen används i cellulära reaktioner. Under muskelkontraktion ansluter myosinmotordomäner cykliskt till aktinfilament och bildar så kallade aktomyosin-tvärbryggor som användar energi som lagras i ATP för att flytta aktinfilament (3).
När aktionspotentialen aktiverar muskeln, frigörs kalcium (Ca2+ ) till cytosolen i muskelcellen och binder till troponin på aktinfilamenten. Detta gör att tropomyosin rör sig bort från sin blockerande position i filamentet och exponerar bindningsställen för myosinbryggan på aktin (A). De aktiverade myosin-tvärbryggorna (M) på de tjocka filamenten binder till aktin i en process: A + M. ADP. Pi → A. M. ADP. Pi Detta resulterar i frisättning av ATP-hydrolysprodukter från myosin, associerat med en ökad affinitet mellan myosin och aktinfilamentet, och produktion av en vinkelrörelse för varje tvärbrygga som leder till förflyttning av de tjocka och tunna filamenten relativt varandra: A. M. ADP. Pi → A. M + ADP + Pi.
Sedan binder ATP åter till myosin vilket kraftigt minskar affiniteten mellan myosin och aktin och möjliggör att tvärbryggorna dissocierar från aktin och initierar en ny cykel: A.
M + ATP →A + M. ATP.
Upprepering av dessa steg ger rörelse (glidning) av tunna filamenten förbi de tjocka filamenten med förkortning av hela muskeln. Så länge Ca2+ fortfarande är bundet till troponin kommer dessa rörelsecykler att fortsätta. Avlägsnande av Ca2+ från troponin
kan återställa den blockerande effekten av tropomyosin och muskelfibrerna slappnar då av. Frånvaro av ATP leder till att tvärbryggor blir fast bunda mellan myosin och aktin något som sker då ATP tar slut efter döden (3, 10).
För att förstå myosinmotorns kinetiska egenskaper är det viktigt att bestämma basal och aktinaktiverad steady-state ATPas-aktivitet. Detta kan göras genom att mäta
ansamlingen av produkterna från ATP-hydrolysen (ADP eller oorganiskt fosfat (Pi)) som en funktion av tiden (10).
Utifrån dessa mätningar kan man sedan beräkna den maximala hastigheten med vilken myosin hydrolyserar ATP i frånvaro av F-aktin (V0), den maximala ATPas-hastigheten för myosin i närvaro av mättande koncentration aktin (kcat) och den koncentration av aktin som behövs för att nå halv maximal aktivering av myosin ATPas-aktivitet (KATPas
dvs. skenbar KM för aktin) (11).
Detta görs genom att mäta myosin ATPas-aktiviteten vid olika aktinkoncentrationer och anpassa data till Michaelis-Menten-ekvationen (11).
Metoder i studien
NADH kopplat mätsystem
ATPas-aktiviteten hos myosinmotorn kan mätas indiretkt genom användandet av ett NADH-kopplat mätsystem. Analysen ger detektering i realtid, god känslighet och förmågan att regenerera ATP från bildat ADP. Denna analys bygger på övervakning av förändring i absorbans eller fluorescens som är kopplad till oxidationen av NADH genom en serie kopplade enzymatiska reaktioner som beskrivs i schema 1.
ADP (som är ATP-hydrolysprodukt) kommer från myosin och aktomyosin ATPas reaktioner. Principen är att pyruvat kinase (PK) omvandlar ADP till ATP med användning av phospho (enol) pyruvat (PEP). Därefter omvandlas pyruvat till laktat katalyserat av laktatdehydrogenas (LDH) med användning av nikotinamidadenin- dinukleotid (NADH) som kofaktor som då oxideras till NAD+ (10, 11).
Schema 1: Serierna av enzymatiska reaktioner i ett NADH-kopplat mätsystem.
NADH absorberar ljus vid (340 nm) medan NAD+ inte absorberar ljus. Detta innebär att reaktionshastigheten kan mätas utifrån minskning i absorbans vid 340 nm. En NADH- molykel konsumeras per ADP, och koncentrationen av ADP molekyler i våra studier är lika med koncentrationen av ATP som hydrolyserats av myosin. På detta sätt kan reaktionshastigheten V0 (ATP s-1 myosinhuvud-1) bestämmas (11).
I en spektrometer anpassad för mätning av små volymer (60 µl kyvetter) mättes förändringen i NADH-absorbans vid 340 nm. Den ändringen i absorbans anpassades med en linjär funktion där linjens lutning (k) kan omvandlas till hastigheten för förändring av ATP-koncentration (µM s-1) och slutligen konverteras till (V0 eller kcat; ATP s-1 myosinhuvud-1) med användning av NADH-extinktionskoefficienten (6220 M-1 cm-1) och myosinkoncentrationen (11).
Michaelis–Menten-ekvationen
Michaelis–Menten-ekvationen (Km; Michaelis–Menten -konstanten) beskriver hur enzymers arbetstakt är relaterad till koncentrationen av substrat och enzymets maximala hastighet (d.v.s. enzymkinetiken). Ekvationen är V = Vmax [S] / ([S] + Km). Här är Vmax. den maximala reaktionshastigheten när enzymet är mättat med substrat, Km är
substratkoncentrationen vid vilken reaktionshastigheten är 50% av Vmax, och [S] är koncentrationen av substratet S (12).
Bestämning av myosins ATPas aktivitet kan ge insikter i myosinets funktion vid sammandragning av hjärta och kroppsmuskler. Förändring eller mutation i myosin kan vara en anledning till olika sjukdomar. Till exempel är hypertrofisk kardiomyopati (HCM) en av de vanligaste ärftliga hjärtsjukdomarna, orsakad av mutationer i gener som myosin som kodar för hjärtmuskelns molekylära motor (11, 13).
In vitro motilitets-analys (IVMA)
In vitro motilitetsanalys (IVMA) är en metod som ofta används i grundläggande muskelforskning och som kan hjälpa till att hitta behandlingsalternativ för kardiovaskulära eller neuromuskulära sjukdomar (14).
Metoden bygger på registrering av glidrörelsen av fluorescerande märkta aktinfilament över en matta med myosinmolekyler eller snarare HMM. Glidhastigheten visualiseras vanligen via ett inverterat fluorescensmikroskop (5).
Glidhastigheten för aktin är relaterad till myosin-ATPas-hastigheten, samt beror på myosintypen och myosindensiteten. Experimentet utförs i en flödescell konstruerad av ett TMCS (eller nitrocelulosa)-derivatiserat täckglas som satts ihop med ett annat täckglas med hjälp av en remsa dubbelsidig tejp längs varje kant av glasen. På så sätt bildar volymen mellan täckglasen och mellan de två tejpbitarna en flödescell (Figur 5) (15, 16).
Först inkuberas flödescellerna med myosinmotorfragment. följt av BSA för att blockera fria glasytor. Sedan tvättas flödescellen med tvättbuffert, och inkuberas med rodamin- falloidinmärkta aktinfilament. Därefter tvättas flödescellen igen och slutligen tillsätts analysbufferten (15).
Figur 5: Den vänstra delen av bilden representerar en flödescell med ett täckglas som fästs på ett TMCS-derivatiserat (eller nitrocelulosa-täckt) -glas via två dubbelsidiga tejper. Den högra delen av bilden illustrerar transporten av aktinfilament av adsorberade myosinmotorfragment på en TMCS (eller nitrocelulosa) -derivatiserad yta (grön färg). Bilden från referens (16). Detta arbete är licensierat under Creative Commons Attribution 4.0 International License. För att se en kopia av denna licens, besök http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ eller skicka ett brev till
Creative Commons, PO Box 1866, Mountain View, CA 94042, USA.
SYFTE
Syftet med denna studie var att jämföra NADH-kopplade ATPas mätsystem med IVMA för bestämning av myosin-funktionen och att uppskatta fraktion av aktiva huvuden i myosinpreparationer som behövs för en lyckad IVMA.
MATERIAL OCH METOD
I studien användes aktinfilament (F-aktin) och det lösliga motorfragmentet ”heavy meromyosin” (HMM) från skelettmuskelmyosin. Dessa proteiner har tidigare isolerats från kaninskelettmuskler och har därefter förvarats vid -80 oC.
1-NADH kopplat mätsystem Buffert och stamlösningar
Först bereddes stamlösningar: 1M KOH (Sigma, USA) (50 ml), 1M MOPS (Sigma, USA) (50 ml), 100 mM EGTA (Sigma, Tyskland) i 1M KOH (1ml), och 1M MgCl2
(Fisher BioReagents, India) (50 ml). Utifrån dessa bereddes sedan 500 ml av en lösning med låg jonstyrka (LISS) i pH 7,4. LISS består av 1mM MgCl2, 10 mM MOPS, 0,1 mM EGTA (upplöst i 1M KOH), sedan tillsattes KOH för att justera pH till 7,4.
3M KCl (Sigma, Tyskland) stamlösning i LISS (50 ml) bereddes därefter, samt 2X LISS som består av 2mM MgCl2, 20 mM MOPS, 0,2 mM EGTA (upplöst i 1M KOH).
Avslutningsvis justerades pH med KOH till 7,4. Alla beskrivna buffertar och stamlösningar förvarades vid 4 °C (11).
Förutom dessa förbereddes olika enzymer som behövdes för NADH-enzym-kopplade mäningar enligt följande: 10,000 U/ml av pyruvate kinase (PK) (Sigma, P-9136) i LISS med 50% glycerol, 4000 U/ml av lactat dehydrogenase (LDH) (Sigma, L-1254), i LISS med 50 % glycerol, 100 mM av phospho (enol) pyruvate (PEP) (Sigma, P-7127) i LISS
och slutligen, 100 mM av ADP-lösning i LISS (pH justerad till 7.4 med KOH). Exakt ADP-koncentration bestämdes genom mätning av absorbansen vid 259 nm med användning av millimolär extinktionskoefficient 15,4 O.D. Enzymlösningarna
förvarades i frys vid -20 °C i små eppendorfrör. Inför varje experement placerades ett av de små rören med respektive enzym på is där det behölls under experimentet (11).
Assay-buffertar (AB)
För beredning av10 ml av en assay buffert (AB) var startpunkten LISS med ett tillskott av 10 mM KCl och 1mM DTT. Första steget var att filtrera (0,2 µm) 15 ml LISS och avlufta denna lösning under 30 min i en vakuumkolv som stängdes med en kork.
Avluftningen utfördes med hjälp av en vakuumkolv med en slang ansluten till sidarmen, medan den andra sidan av slangen var ansluten till en luftvakuumkälla. Därefter
bereddes 1 mM ditiotreitol (DTT) (Sigma, USA) i 250 µl avluftad LISS. Sedan
förbereddes 10 ml assay buffert (AB) genom att tillsätta 10 mM KCl och 1mM DTT till LISS (slutkoncentrationer). Dessa lösningar placerades på is under experimentet.
Experimenten med myosin och aktomyosin uppreperades många dagar, och för varje experiment bereddes ny AB-buffert (11).
5X- Cocktail lösning:
En lösning med 15 mM NADH i avluftad LISS (2 mg i 200 µl LISS) bereddes och absorbansen bestämdes spektrofotometriskt (UV-1800) vid 340 nm (22 °C), följt av spädning till ca 0,75 mM i en kyvett. För att bestämma exakt koncentration av NADH i en 5X-cocktaillösning användes extinktionskoefficienten för NADH (ε340 = 6220 M-1 cm-1). En 5X cocktaillösning innehöll: 500 U/ml PK, 2,5 mM PEP, 100 U/ml LDH, och 500 µM NADH. 5X cocktaillösning förbereddes i 250 µl AB-buffert (11).
Experiment med myosin
Den första HMM preparationen som användes i experiment hade koncentration 438 μg/ml (”bra HMM”) och den andra HMM preparationen hade 670 μg/ml (”dåligt HMM”). De två HMM preparationerna hade frampreparerats från kanin-skelettmuskel.
De fanns förvarade vid -80 °C och var färdiga att använda.
Basal myosin ATPas-aktivitet mättes vid olika HMM-koncentrationer (”bra HMM”) eller vid en koncentration för ”dåligt HMM” (se resultat).För varje experement
förbereddes nya avluftade LISS-, DTT-, NADH-, ATP-, 5X-cocktail-lösningar och AB- buffertar på det sätt som beskrivs ovan.
En lösning med MgATP, 5mM (Sigma, Tyskland) (5X) förbereddes genom att tillsätta (5mM ATP och 5mM MgCl2) till 250 µl AB-buffert.
Absorbansen mättes i spektrometer vid 340 nm vid ca 22 °C genom att tillsätta 60µl av dessa olika lösningarna och HMM till en liten kyvett, (se vidare tabell I, Bilaga 1). En negativ kontroll utan HMM analyserades också (11).
Experiment med aktomyosin
Experimentet utfördes med 100 µM F-aktin stamlösning där aktinet hade renats fram vid Linnéuniversitetet från skelettmuskel från kanin. Aktinet var färdigt att använda och
lagrades vid -80 °C. Detta aktin användes för att analysera koncentrationer av aktin upp till 70 µM. En annan F-aktin stamlösning med koncentrationen 238 µM köptes från Hypermol (Bielefeld, Tyskland) och användes för att analysera koncentrationer av aktin upp till 100 µM.
Innan experimentet dialyserades först F-aktin i lagringslösning mot AB- buffert (genom att göra 3-4 buffertväxlingar om ca 1-2 timme, över natt och ca 2 timmar, i kylrum) med hjälp av ”snabb dialysator” (Fast SpinDialyzer, Harvard Appratus, USA) och 10 kDa- membran.
Därefter stabiliserades aktinfilamenten med tillsats av ekvimolär koncentration (100 µM eller 238 µM) av falloidin (~12 mM stamlösning i metanol, förvarad vid -20 oC). Sedan förbereddes nya avluftade LISS -, DTT-, NADH-, ATP-, och 5X-cocktail- lösningar, och en ny AB-buffert.
Aktomyosin-experimenten för båda HMM preparationerna utfördes vid olika
koncentrationer av F-aktin (se resultat) och med 25 nM HMM i kyvett (se Bilaga I för information om pipettering). Mätningen upprepades många gånger under flera dagar.
Till sist mättes absorbansen vid 340 nm i spektrometer vid ca 22 °C som negativ kontroll, med bara HMM, och med olika koncentrationer av F-aktin (se tabell II, Bilaga I) (11).
Beräkning av reaktionshastighet
Reaktionshastigheten (k) beräknades genom att anpassa absorbansändring mot tiden med en linjär funktion. Sedan användes extinktionskoefficienten för NADH (6220 M-1 cm-1) för att konvertera till förändringar i ATP koncentration i µM s-1 och slutligen till ATP s-1 myosinhuvud-1 med hjälp av den kända HMM-koncentrationen som använts (11).
Parametrarna kcat (=Vmax)och KATPas (= Km) beräknades enligt M-M-ekvationen med hjälp av GraphPad Prism (version 8.4.3 (686)). Excel (Microsoft 365).
2-In vitro motilitets-analys (IVMA)
I denna metod används ett objektglas som behandlades med trimetylklorsilan (TMCS).
Det bereddes i laboratoriet enligt ett eget protokoll och lagrades i rumstemperatur i torra petriskålar som täcktes med parafilm (17).
Innan användning tvättades TMCS-ytorna i destillerat vatten i 20 minuter och torkades med användning av N2-gasström. Ovanpå TMCS-ytan tillverkades en flödescell på det sätt som redan beskrivits ovan (Figur 6) (16, 18).
Figur 6: Schematisk bild av en flödescellen i IVMA metod.
Buffertar och lösningar:
För beredande av 9 mL”tvättlösning” filtrerades och avluftades först 15mL av LISS, och vidare bereddes 1M DTT-lösning i avluftad LISS. Sedan tillsattes i ett provrör 150 µl av 3M KCl i LISS, 9 µl av 1M DTT till avluftad LISS (slutvolym 9 mL) (18).
Till ett litet provrör som innehöll 1mg/ml BSA (1,5 ml) tillsattes 0,3 µl av 1M DTT (18).
Spädning av rodamin falloidinmärkta aktin-filament (RhPh AF) till 10 nM
Här späddes 4 µM RhPh-AF (2.5 µl) med 997.5 µl wash buffert.
Spädning av HMM till 120µg/ml
För ”bra HMM” späddes 438 µg/ml HMM (150µl) med 397.5 µl tvättbuffert, och för
”dåligt HMM” tillsattes 670 µg/ml HMM (150µl) till 687 µl tvättbuffert (18).
Assay solution: A60 (1200µl)
Alla ingredienser för analyslösningen fanns tillgängliga i laboratoriet och färdiga att användas. I små eppendorf-rör tillsattes 1080 µl avluftad LISS, 18 µl av 3M KCl (in LISS), 24 µl av glukos (Glu) (150 mg/ml), 24 µl katalas (1mg/ml), 12 µl DTT (1M in LISS), 12µl glukosoxidas (GOX) (10mg/ml) ), 12 µl kreatinkinas (Ck) (20 mg/ml), 12 µl MgATP (0.1 M ), och 6 µl kreatinfosfat (CP) (0.5 M) (18).
Steg för in vitro-motilitetsförsök
In vitro-motilitetsanalyser utfördes genom att 1. infusera 30 µl av HMM med inkubering under 5 min, 2. 30 µl BSA buffert i 2 min, 3. 30 µl tvättbuffert, 4. 30 µl Rhodamin-falloidinmärkta aktinfilament under 2 min, 5. 30µl tvättbuffert, 6. 30µl assay solution under 2 min. Till sist observerades motiliteten i ett Zeiss Axio Observer
Inverted-mikroskop och en Hamamatsu EMCCD-kamera som spelade in tre videos av ett experement under 63X objektivförstoring vid 27-28 °C (15, 18).
Inspelade data analyserades i ImageJ2, 20160205 genom att manuellt räkna rörliga och icke-rörliga filament. Sedan beräknades fraktionen rörliga filament (FMF) och totala antale filament för båda HMM-preparationerna i Excel (Microsoft 365).
Etiska aspekter
All hantering av djurmaterial var i enlighet med EU-regler och nationell lagstiftning och hade godkännande från Linköpings försöksdjursetiska nämnd (referensnummer 73-14).
Basala hygienrutiner och klädregler följdes. Handskar användes och byttes vid behov, och avfallet hanterades enligt instruktioner.
RESULTAT
Förändring i optisk densitet (O.D) mot tid för olika koncentrationer av ”bra” HMM visas i Figur 1. Utifrån data av denna typ beräknades reaktionshastigheter som
presenteras i Figur 2. Basala myosin ATPas-aktiviteter (V0) beräknades vid flera HMM- koncentrationer för ”bra” HMM och vid 500 nM för ”dåligt” HMM, det visas i figur 3.
Det fanns ingen observerbar skillnad i V0 beräknad från reaktion med användning av 500 nM myosin för bra eller dåligt HMM. Genomsnittligt V0 för båda HMM var ~ 0,03 ATP s-1 myosinhuvud-1 vilket är nära referensvärdet på 0,05 ATP s-1 myosinhuvud -1. Till skillnad från basal myosin ATPas-aktivitet var mätningar med aktin mycket svårare att genomföra på grund av aktinets viskositet. Det är därför aktinaktiverad myosin ATPas-aktivitet mätningar visade betydande variationer speciellt när höga
koncentrationer av aktin användes i kyvetten, se figur 4.
I en jämförelse mellan ATPas –aktivitet för ”bra” HMM och ”dåligt” HMM var ATP- förbrukningen snabbare för ”bra” HMM, se figur 5.
Data anpassades till Michaelis-Menten ekvationen som visade att KATPas (Km) för HMM med ”dålig” motilitet var lite högre än det för ”bra” HMM , det i sin tur innebar
minskad affinitet mellan myosin och aktinfilament. Minskning i kcat var cirka 35% för
”dåligt” HMM jämfört med ”bra” HMM, vilket avspegelar mer inaktiva motorer i
”dåligt” HMM, se Figur 6.
För IVMA metoden minskades fraktion av rörliga filament(FMF) 80 % mellan de två HMM; för ”bra” HMM var FMF 87,24% och för ”dåligt” HMM var FMF 17,86 %.
Totala antalet rörliga filament (TMF) minskades 98 % mellan de två HMM och det beräknades till 373 rörliga filament för ”bra” HMM och bara 7 rörliga filament för
”dåligt” HMM, se tabell I.
Motilitet av aktin filamenten var mycket bra och tydlig för ”bra” HMM jämfört med
”dåligt” HMM. Det var svårt att se rörelse av aktinfilamentet i ”dåligt” HMM som annses som inaktivt HMM, se figur 7.
0 100 200 300 400 0.90
0.95 1.00 1.05
Basal Myosin ATPas
Tid ( s )
O.D. (normaliserad ) CONTROL 0nM
HMM 62,5 nM HMM 125 nM
HMM 250 nM HMM 500 nM HMM 750 nM
Figur 1: Optisk densitet (O.D) vid 340 nm avsatt mot tid (300 s) för basal ATPas aktivitet för olika mängder av bra HMM: 3 µL (slutkoncentration, 62.5 nM) lila linje, 6 µl (125 nM) mörkblå linje, 12 µl (250 nM) ljusblå linje, 24 µl (500 nM) ljusgrön linje, 36 µl (750 nM) gul linje, och negativ kontroll svart linje.
62,5 125 250 500 750
0 20 40 60
Basal myosin ATPas
[HMM] (nM)
V
ATP( n M /s )
Figur 2: Konsumtion av ATP till följd av basal myosin ATPas aktivitet bestämd med hjälp av NADH-enzym-kopplat mätsystem vid flera koncentrationer av bra HMM. Data representerar medelvärde ± SEM från upprepering av mätningen 3-4 gånger (n = 3-4), T = 22 °C.
62,5 125 250 500 750 0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
Basal myosin ATPas-aktivitet
[HMM] (nM) V0 (s-1 head-1 )
"dåligt" HMM
"bra" HMM
Figur 3: Basal ATPas-aktivitet (V0) bestämdes vid flera HMM-koncentrationer för ”bra” HMM och vid 500 nM för dåligt HMM.
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10
Aktomyosin ATPas
[F-actin] (µM)
A T P a se r a te (s
-1h e ad
-1)
Figur 4: Aktin-aktiverad myosin ATPas-aktivitet vid olika F-aktinkoncentrationer för ”bra”
HMM. Mätningar vid höga aktinkoncentrationer kan vara utmanande att utföra på grund av den höga viskositeten hos aktinlösningen, vilket gör pipettering svår.
0 20 40 60 80 100 0
2 4 6 8 10
Aktomyosin ATPas
[F-actin] (µM)
ATPase rate(s-1 head-1 ) "bra" HMM
"dåligt" HMM
Figur 5: Aktinaktiverat myosin ATPas uppmätt vid flera aktinkoncentrationer för HMM med bra och dåligt motilitet. Mellan 1 och 8 oberoende mätningar för varje aktinkoncentration gjordes under flera dagar (n = 1-8). Om möjligt beräknades medelvärde ± SEM. Data anpassades till Michaelis-Menten-ekvationen. T = 22 °C.
bra motilitet dålig motilitet 0
5 10 15
0 50 100 150
Aktomyosin ATPas parametar
HMM
kcat (s-1 head-1 ) KATPas (µM)
Vmax Km
Figur 6: Michaelis-Menten-parametrar för HMM med bra och dålig motilitet. Data representerar medelvärde ± SEM av anpassningen. Det är ~ 35 % minskning av kcat för HMM med dålig motilitet jämfört med den med bra.
Tabell I: Jämförelse mellan bra HMM och dåligt HMM ATPas mätningar med NADH-kopplad mätmetod. Data representerar medelvärde ± SEM av anpassningen. För IVMA uppreperades beräkningarna tre gånger (tre videor, n =3) för båda HMM. Data representerar medelvärde ± SEM.
NADH-kopplat mätsystemsmetod
IVMA metod
Myosin (HMM)
Km (µM)±
SEM
Vmax
(ATP s-1 myosinhuvud-1) ± SEM
FMF
% ± SEM
TMF (filament)
± SEM Bra HMM 55,56 ± 14,43 11,21 ± 1,49 87,24 ± 3,27 373 ± 14,17
Dåligt HMM 68,25 ± 33,53 7,18 ± 1,98 17,86 ± 4,79 6,66 ± 3,05
Figur 7: Kvaliteten på aktin-myosin-rörlighet för ”bra” (A) och ”dåligt” (B) HMM. De ljusa spåren visar banorna för HMM-framflyttade fluorescensmärkta aktinfilament. Observera, A visar konsekvent och jämnt fördelad rörlighet på hela bilden jämfört med B. Bilder genererades som maximal projektion (addition av maximal pixelintensitet) av 100 bilder med hjälp av programvaran ImageJ.
DISKUSSION
A B
Denna studie syftade till att jämföra aktin-aktiverad myosin ATPas hastighet för två olika HMM-beredningar med låg, respektive hög fraktion rörliga filament i in vitro- motilitetsanalysen. Aktin-aktiverad myosin ATPas hastighet skulle ge svaret tillsammans med in vitro-motilitetsanalys om hur hög andel fungerande myosinmolekyler som behövs för en fungerade in vitro motilitet.
Innan mätningar började, kalibrerades spektrometern för att korrigera för instrumentets bakgrundsabsorbans och beräkna koncentrationen av NADH i cocktail-lösningen.
Därefter studerades den negativa kontrollen utan myosin, och resultatet uppvisade en horisontell rak linje utan ändring av absorbansen med tiden som bekräftelse på att det inte fanns något som kunde störa mätningarna med myosin (11).
Figur 1 visar resultaten för ”bra” HMM och det framgår här klart att absorbansen minskade ytterligare när koncentrationen av HMM ökade. Detta i sin tur avspeglar funktionen av myosin för ATP-förbrukning. Absorbansen av NADH förväntas vara direkt proportionell mot koncentrationen av ADP som frigörs, och när det finns mer HMM i kyvetten, konsumeras mer NADH. Detta leder till att absorbansen sjunker på grund av att ADP frigörs när ATP konsumeras (10, 11, 19).
Beräkning utifrån mätningar på båda HMM preparationerna gav V0 på 0,03-0,04 ATP s1 myosinhuvud-1 vilket är ett rimligt resultat i jämförelse med 0,05 ATP s-1myosinhuvud-1 som observerats tidigare i andra vetenskapliga artiklar (15).
Faktorer som kan ha påverkat mätningarna och visat lägre värden kan vara att det fanns en del inaktiva myosinhuvuden i båda myosinberedningarna (20).
Coacktail-lösningen innehöll PK- och LDH-enzym och vid beredningen av de två enzymerna användes glycerol för att skydda dem vid -20 o C. Detta gjorde blandningen mer viskös och bidrog till att generera mer bubblor vid pipettering i den lilla kyvetten.
Trots svårigheten med hög viskositet särskilt med mätningar som innehåller stora HMM-mängder i kyvetten, visade emellertid resultaten i figur 2 att de upprepade mätningarna gav mycket konsekventa resultat med endast små variationer (11).
Medelvärdet för V0 för bra och dåligt HMM, bestämt vid 500 nM protein var ~ 0,03 s-1 myosinhuvud-1. Detta innebär att det med dessa mätningar var svårt att se någon skillnad mellan de två HMM preparationerna som vi använde. Anledningen till att det inte kunde ses någon skillnad mellan myosinpreparat var att NADH-metoden som bygger på absorbans inte är tillräckligt känslig för att detektera små förändringar i långsamma reaktioner. Fluorescensbaserad NADH-metod eller andra fluorescens- eller radioaktiva metoder (t.ex. baserade på fluorescens eller radioaktiv ATP-analog) kan vara bättre för dessa mätningar (21, 22, 23).
Vid låga HMMkoncentrationer (62,5 nM och 125 nM) i figur 3 visade mätningarna stora variationer, och man kan säga att för att få en bra uppskattning av V0 för basalt myosin ATPas behövs minst 250 nM myosin. Detta överensstämmer med tidigare slutsatser (15).
Vid aktomyosinmätningen för båda HMM-preparationerna ökade ATP-förbrukningen då aktin-koncentrationen höjdes i kyvetten. Figur 3 visar alla mätningar för ”bra ” HMM. För mätningarna med aktin var det svårt att pipettera i kyvetten jämfört med experimenten som utfördes med endast HMM på grund av hög aktin-viskositet,
specifikt vid höga koncentrationer som bidrog till att det skapades mer bubblor. Detta är
tydligt i den höga variabiliteten hos mätningar vid höga aktin-koncentrationer (se Figur 4). Under experimentet försöktes flera gånger att undvika uppkomsten av bubblor genom att exempelvis HMM och aktin först tillsattes och blandades i kyvetten innan AB-, cocktail-lösning och ATP tillsattes. Alternativt, försöktes de olika lösningarna blanda i små eppendorfrör (specifikt för höga F-aktinkoncentrationer vid 80 µM och 100 µM) innan de tillsattes i kyvetten. I slutet utfördes de mätningarna genom att AB- med coctaillösning tillsattes i kyvetten först, och följdes av aktin och myosin. Detta bidrog till att få bra resultat, eftersom ingredienserna i coctaillösning täckte
kyvettväggarna och då blir det lättare för HMM och F-aktin att binda till varandra med effektiva reaktioner.
Cocktaillösningen kan påverkas av åldrande (NADH-oxidation), och det är bättre om den byts efter 2-3 timmar. Mätningen måste utföras direkt efter tillsats av ATP,
eftersom NADH konsumeras snabbt om det står lång tid innan mätningar påbörjas (11).
Experimentet var känsligt och F-aktinfilament måste vara stabila (utan frisättning av ADP från dem) för att få tillförlitlig ATPas mätning. Med låga koncentrationer av aktinfilament i kyvetten finns inte mycket ADP som kan påverka hastigheten om F- aktinfilament inte var stabila, men med höga F-aktinkoncentration kan mätningen påverkas. Det var därför viktigt att aktinfilamenten var ordentligt dialyserade och
stabiliserade innan experimentet, genom tillsatts av ekvimolär koncentration av falloidin som förhindrar aktinfilamentet att brytas ner och släppa ifrån sig ADP. Blandning av lösningarna i kyvetten var mycket viktigt, eftersom F-aktinfilamenten kan sjunka ner i kyvetten, något som skulle påverka lösningens viskositet och absorbansen (26).
Aktinpreparationen som köptes från Hypermol (Tyskland) innehöll förmodligen mer ADP och var mindre stabil än det aktin som framrenats i laboratoriet vid
Linnéuniversitetet. För att få det att fungera ordentligt dialyserades aktinstamlösningen fyra gånger (istället för tre) och stabiliseringen med falloidin gjordes över natten (istället för på experimentdagen) (10).
I experimenten med båda HMM preparationerna (bra HMM, dåligt HMM) tillsattes en konstant koncentration av HMM i kyvetterna och aktinkoncentrationen var den enda variabeln. En egenskap hos myosinmotorer är att de aktiveras när de binder till aktin, och hastigheten av ATPas ökar när aktin-koncentrationen ökar (25).
Figur 5 visar skillnaderna i den aktinaktiverade ATPas-aktiviteten mellan bra och dåligt HMM vilket innebär att antalet aktiva myosinhuvud i det bra HMM som band till F- aktin filamentet var högre än de som fanns i dåligt HMM, så att den total aktiviteten var högre (Figur 6, Tabel I).
I Michaelis–Menten-ekvationen beror förhållandet mellan reaktionshastighet och koncentration av substrat på enzymets affinitet för dess substrat. Detta uttrycks
vanligtvis som enzymets Km (Michaelis-Menten konstant; anges här också som KATPas).
ATPas aktiviteten påverkas av affiniteten mellan myosin och aktin. När Km är låg, innebär detta att affiniteten mellan aktin och myosin är hög. I figur 6 var Km för det dåliga HMM lite högre än för det bra HMM, vilket innebär att affiniteten mellan aktin och myosin är något högre för bra HMM (12).
I en annan studie, som syftade till att studera inhiberingsmekanism för blebbistatin som blockerar myosinhuvudena i ett produktkomplex med låg aktinaffinitet, användes NADH kopplat mätsystem med myosin S1-fragment isolerade från kaninmuskulatur.
Resultaten för V0 var ~ 0,08 s -1 myosinhuvud -1, kcat ~ 24 s -1 myosinhuvud -1, och KATPas
beräknades till ~ 24 µM. Dessa resultaten liknar våra resultat om man tar hänsyn till olika buffertkompositioner; ingen KCL användes i denna studie vilket innebär att jonstyrkan var lägre vilket påverkar affiniteten melan myosin och aktinfilament.
Dessutom var arbetstemperaturen som användes i denna studie högre (T = 25 °C) jämfört med vår arbetstemperatur (T = 22 °C) (27).
Med IVMA-metoden tillsattes F-aktin till flödescellen utan att blanda för mycket för att undvika att bryta aktinfilamenten. Om filamenten behålls långa är det lättare att se och räkna dem vid uppskattning av procentandelen rörliga filament. Det har tidigare uppskattats att om 20% av myosinhuvudena är inaktiva, blir det svårt att se rörelsen av aktinfilament vid IVMA (25).
Det totala antlet rörliga filament var 98 % lägre för dåligt än bra HMM, och fraktionen rörliga filament var 80 % lägre för dåligt än bra HMM. IVMA resultatet var så dåligt för ”dåligt” HMM att detta ansågs som helt och hållet inaktivt ("dött"). I kontrast till detta så visade den aktin-aktiverade ATPas-mätningen med det NADH- kopplade mätsystemet att den dåliga HMM preparationen hade ca 65% så många aktiva myosinhuvud som "bra" HMM.
Detta resultat visar tydligt att IVMA metoden är mycket känslig för förekomst av döda myosinhuvuden. Denna metod kan därför inte användas för att kvantifiera hur mycket aktivt HMM som finns i lösningen bara att andelen av detta aktiva HMM är under ett visst tröskelvärde för motilitet. Det NADH- kopplade mätsystemet är istället användbart för sådan kvantifierng av myosinkvaliteten (29,11).
I en annan studie som tydde på att ett problem som påverkar rörligheten av
aktinfilament av myosinmotorer är att icke-funktionella "döda" motorer som erhålls under isoleringsprocessen kan försämra rörligheten. I studien undersöktes effekterna av två tillvägagångssätt utformade för att eliminera effekterna av dessa döda motorer på motilitetet i IVMA analys. En god rörlighet uppskattades av fraktionen av rörliga filament cirka 90%, vilket liknar resultaten för FMF i den här studien (29).
Med hjälp av de använda metoderna, kan detaljerad information erhållas om myosins kinetiska egenskaper i kroppsmuskler något som i sin tur påverkar förmågan att skapa kraft och rörelse. Metoderna kan ockå användas för att karakterisera hur myosins funktion ändras vid olika sjukdoma (exv. hjärtsjukdom) t ex orsakade av någon skada eller mutation i generna för myosin eller aktin (30).
Slutsats
De två metoder som användes i denna studie lyckades att karaktiresera myosin och uppskatta dess funktionella egenskaper.
Det NADH- kopplade mätsystemet som studerar myosinets ATP nedbrytning ger ett mått direkt proportionellt mot antal katalytiskt aktiva myosin-huvuden. Med mätning av basla myosin-ATPas-aktivitet (utan aktin) var det svårt att visa skillnaden mellan de två HMM preparationer som användes. Medan experimenten med mätning av aktomyosin ATPas med olika koncentrationer av aktinfilament visade färre aktiva myosinhuvuden i
"dåligt" HMM jämfört med ”bra” HMM.
Slutligen, så är IVMA metoden mycket känslig för förekomst av döda myosinhuvuden.
I den aktuella studien uppfattades således det dåliga HMM som inaktivt ("nästan dött") baserat på att nästan ingen motilitet observerades. Om man antar att bra myosin har nästan 100% aktiva huvuden och vidare antar att värdet på kcat är direkt proportionellt mot aktiv myosinmängd ser man från dessa mätningar att mycket mer än 65% av totalt myosin måste vara aktivt för att ha bra aktinmotilitet.
TACKORD
Först vill jag tacka Alf Månssons och alla andra på sin grupp i Linnéuniversitetet, Kalmar för tillhandahållande av instrument, lösningar, proteiner, samt övrigt tillbehör i denna studie.
Ett hjärtligt tack till min interna handledare, Marko Ušaj, Forskningsingenjör i Linnéuniversitetet i Kalmar, för allt stöd och hjälp under studiens gång.
Jag vill tacka mina kurskamrater Nikolaj Gubonin och Mohamed Bashir som varit ett stort stöd och hjälp under de tre år i utbildning.
Ett stort tack till min man Ahmad Dakhlallah för allt stöd och uppmuntran under åren som gått.
Sist vill jag tacka alla lektorer och personaler i Biomedicinska analytiker programmet i Linnéuniversitetet i Kalmar som bistått mig på ett sätt.
REFERENSER
1. Sweeney HL, Houdusse A, Robert-Paganin J. Myosin Structures. Adv Exp Med Biol.
2020;1239:7-19.
2. Ojima K. Myosin: Formation and maintenance of thick filaments. Anim Sci J. 2019 Jul;90(7):801-807.
3. Widmaier, Eric P., Arthur J. Vander, Hershel Raff, Kevin T. Strang, and Todd C.
Shoepe. Vander's Human Physiology : The Mechanisms of Body Function. Fifteenth [international Student] ed. New York: McGraw-Hill Education, 2018.
4. Al-Khayat HA. Three-dimensional structure of the human myosin thick filament:
clinical implications. Glob Cardiol Sci Pract. 2013;2013(3):280-302.
5. Pollard, Thomas D., et al. Cell Biology E-Book, Elsevier, 2016. ProQuest Ebook Central, https://ebookcentral-proquest-com.proxy.lnu.se/lib/linne-
ebooks/detail.action?pq-origsite=primo&docID=4732254
6. Wang Z, Jiang H, Yang ZQ, Chacko S. Both N-terminal myosin-binding and C- terminal actin-binding sites on smooth muscle caldesmon are required for caldesmon- mediated inhibition of actin filament velocity. Proc Natl Acad Sci U S A.
1997;94(22):11899-11904.
7. Gollapudi SK, Yu M, Gan QF, Nag S. Synthetic thick filaments: A new avenue for better understanding the myosin super-relaxed state in healthy, diseased, and
mavacamten-treated cardiac systems [published online ahead of print, 2020 Dec 3]. J Biol Chem. 2020;296:100114.
8. Ramanakumar AV, Thomann P, Candeias JM, Ferreira S, Villa LL, Franco EL. Use of the normalized absorbance ratio as an internal standardization approach to minimize measurement error in enzyme-linked immunosorbent assays for diagnosis of human papillomavirus infection. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):791-6.
9. Alberts et al. Essential Cell Biology. Garland Science, fjärde upplagan. S.586
10. Radnai L, Stremel RF, Sellers JR, Rumbaugh G, Miller CA. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPas Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J Vis Exp. 2019;(150):10.3791/60017.
11. De La Cruz EM, Ostap EM. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPas. Methods Enzymol. 2009;455:157-192.
12. Ucl.ca.uk, The effect of substrate concentration on enzyme activity, Michaelis–Menten- ekvationen [Internet]. Ucl.ca.uk;2021 [cited 2021-05-09]. Available from:
https://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzass/substrate.htm
13. Sommese RF, Sung J, Nag S, Sutton S, Deacon JC, Choe E, Leinwand LA, Ruppel K, Spudich JA. Molecular consequences of the R453C hypertrophic cardiomyopathy mutation on human β-cardiac myosin motor function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jul 30;110(31):12607-12.
14. Bopp N, Scheid LM, Fink RHA, Rohr K. Determination of the Maximum Velocity of Filaments in the in vitro Motility Assay. Front Physiol. 2019 Mar 27;10:289.
15. Resnicow DI, Deacon JC, Warrick HM, Spudich JA, Leinwand LA. Functional
diversity among a family of human skeletal muscle myosin motors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jan 19;107(3):1053-8. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jun 8;107(23):10765.
16. Månsson A, Ušaj M, Moretto L, Rassier DE. Do Actomyosin Single-Molecule Mechanics Data Predict Mechanics of Contracting Muscle? Int J Mol Sci. 2018 Jun 25;19(7):1863.
17. Persson M, Albet-Torres N, Ionov L, Sundberg M, Höök F, Diez S, Månsson A, Balaz M. Heavy meromyosin molecules extending more than 50 nm above adsorbing electronegative surfaces. Langmuir. 2010 Jun 15;26(12):9927-36.
18. Månsson, A (2003) & Persson, M(2014), STANDARD PROTOCOL IN VITRO MOTILITY ASSAY (IVMA) FOR ACTOMYOSIN, Linneuniversitetet: Institutet för kemi och biomedicin.
19. Vanderporten E, Frick L, Turincio R, Thana P, Lamarr W, Liu Y. Label-free high- throughput assays to screen and characterize novel lactate dehydrogenase inhibitors.
Anal Biochem. 2013 Oct 15;441(2):115-22.
20. De La Cruz EM, Ostap EM. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPas. Methods Enzymol. 2009;455:157-192.
21. Heissler SM, Liu X, Korn ED, Sellers JR. Kinetic characterization of the ATPas and actin-activated ATPas activities of Acanthamoeba castellanii myosin-2. J Biol Chem.
2013 Sep 13;288(37):26709-20.
22. Radnai L, Stremel RF, Sellers JR, Rumbaugh G, Miller CA. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPas Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J Vis Exp. 2019 Aug 17;(150):10.3791/60017.
23. Adhikari AS, Trivedi DV, Sarkar SS, Song D, Kooiker KB, Bernstein D, Spudich JA, Ruppel KM. β-Cardiac myosin hypertrophic cardiomyopathy mutations release sequestered heads and increase enzymatic activity. Nat Commun. 2019 Jun 18;10(1):2685.
24. Kühner S, Fischer S. Structural mechanism of the ATP-induced dissociation of rigor myosin from actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 May 10;108(19):7793-8.
25. Scheid LM, Weber C, Bopp N, Mosqueira M, Fink RHA. Extraction Protocols for Individual Zebrafish's Ventricle Myosin and Skeletal Muscle Actin for In vitro Motility Assays. Front Physiol. 2017;8:367.
26. Balaz M, Månsson A. Detection of small differences in actomyosin function using actin labeled with different phalloidin conjugates. Anal Biochem. 2005 Mar 15;338(2):224- 36.
27. Kovács M, Tóth J, Hetényi C, Málnási-Csizmadia A, Sellers JR. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. J Biol Chem. 2004 Aug 20;279(34):35557-63.
28. Karpicheva OE, Simonyan AO, Rysev NA, Redwood CS, Borovikov YS. Looking for Targets to Restore the Contractile Function in Congenital Myopathy Caused by Gln147Pro Tropomyosin. Int J Mol Sci. 2020;21(20):7590.
29. Rahman MA, Salhotra A, Månsson A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. J Muscle Res Cell Motil. 2018 Dec;39(5-6):175-187.
30. Tang W, Blair CA, Walton SD, Málnási-Csizmadia A, Campbell KS, Yengo CM.
Modulating Beta-Cardiac Myosin Function at the Molecular and Tissue Levels. Front Physiol. 2017;7:659.
Bilagor
Bilaga 1: Schema för att mäta ATPas-hastigheten i spektrometer
Tabell I: ipettering för en negativ kontroll och olika lösningar vid mätning av basal ATPas-hastigheten med olika koncentrationer av HMM (bra HMM, och dåligt HMM) och med ATP i spektrometer (60µl i kyvetten).
Mätningar AB-buffert (µl) Cocktail 5X (µl)
Myosin (µl) ATP 5X (µl)
Negativ kontroll 36 12 0 12
Myosin konc1 33 12 3 12
Myosin konc2 30 12 6 12
Myosin konc3 24 12 12 12
Myosin konc4 12 12 24 12
Myosin konc5 0 12 36 12
Myosin konc4 (dålig HMM)
20,3 12 15,7 12
Tabell II: Pipetting för en negativ kontroll och olika lösningar vid mätning av aktin- aktiverade ATPas-hastigheten med olika koncentrationer av F-aktin (och med ATP i spektrometer (60µl i kyvetten)
AB-buffert (µl)
Cocktail (µl) (5x eller 10X)
Myosin 10X (µl)
ATP (µl) (5x eller 10X)
Aktin (µl) (100µM eller 238µM stock)
Aktin [µM]
36 12 0 12 0 0
27 (28,,7) 12 6 12 3(1,3) 5
24 (27,4) 12 6 12 6 (2,6) 10
21 (26,1) 12 6 12 9 (3,9) 15
18 (24,6) 12 6 12 12 (5,2) 20
6 (19.1) 12 6 12 24 (10,4) 40
0 12 6 12 30 50
0 (11,2) 6 6 6 42 (18,3) 70
8,6 12 6 12 20,9 80
3,4 12 6 12 26,1 100
Linnéuniversitetet
Kalmar Växjö Lnu.se
