Utvärdering av olika metoder för isolering och odling av mesenkymala stamceller från humant perifert blod

Örebro universitet

Institutionen för Medicinska Vetenskaper Självständigt arbete, 15 hp

Januari 2020

Utvärdering av olika metoder för isolering och odling av

mesenkymala stamceller från humant perifert blod

Författare: Sofie Jaensson Handledare: Mikael Ivarsson, universitetslektor, docent Örebro, Sverige

SAMMANFATTNING

Introduktion: Mesenkymala stamceller är en viktig del av regenerativ medicin, cellterapi samt för att studera olika benmärgssjukdomar. Isolering av stamcellerna är en utmaning då benmärgsaspiration är ett invasivt och smärtsamt ingrepp. En alternativ källa för dessa celler är perifert blod som är lättillgängligt och kan erhållas med minimal invasivitet. Tidigare forskning visar inkonsekventa resultat vid isolering och odling av stamcellerna från humant perifert blod och svårigheten kan bero på att metoden inte är fullt optimerad för isolering, rening och tillväxt av cellerna.

Syfte: Att utvärdera olika metoder för isolering och odling av mesenkymala stamceller från perifert blod.

Metod: Mononukleära celler isolerades med hjälp av densitets-gradient centrifugering från blod. Olika varianter av densitetsgradients-metoden utfördes, bland annat odling vid olika syrgaskoncentrationer samt isolering av adherenta celler efter hemolys. Cellerna fäste på plast och odlades i medium. Trypsinering utfördes för att få loss cellerna som sedan analyserades med flödescytometri. Uttryck av olika cell-specifika markörer (CD14, CD73, CD90, CD105, HLA-DR) kunde då bestämmas och olika celltyper identifierades i de populationer som odlades.

Resultat: Sammantaget visar resultatet att odlingar av adherenta celler från blod (monocyter, fibrocyter, mesenkymala stamceller) bäst kunde framodlas under hypoxi, med hjälp av Ficoll®-separering, eller hemolys. Två olika cellpopulationer kunde identifieras i varje

blododling. Odling under hypoxi tenderade att ge upphov till tillväxt av fler celler som kunde analyseras samt fler celler som liknade MSC till uttrycket av liknande CD-markörer.

Slutsats: Våra resultat talar för att en hypoxisk miljö gynnar MSC:s tillväxt men att en storleksseparering vore lämpligt att utföra då de celler med CD-markörer som mest liknar MSC uppkom i en storleksmässigt mindre population än monocyter.

FÖRKORTNINGAR

AML- akut myeloisk leukemi CML- kronisk myeloisk leukemi

DMEM- dulbecco's modifierat eagle medium ET- essentiell trombocytos

FACS- fluorescenc aktiverad cell sortering FBS- fetalt bovint serum

FCM- flödescytometri

HLA DR- humant leukocyte antigen, subtyp DR JAK2- janus kinas 2

MDS- myelodysplastiskt syndrom MPN- myeloproliferativa neoplasier

mRNA- budbärar RNA (messenger ribonucleic acid) MSC- mesenkymala stamceller

PBMC- perifert blod-mononukleära celler PB-MSC- perifert blod-mesenkymala stamceller PBS- phosphate-buffered saline

PMF- primär myelofibros PV- polycytemia vera

Innehållsförteckning

1.5 Definition av mesenkymal stamcell ... 6

1.6 Mesenkymala stamcellers ursprung ... 6

1.7 Odling av mesenkymala stamceller från benmärgen via aspiration... 7

1.8 Fibrocyter ... 7

1.9 Odling av PB-MSC ... 7

1.10 Flödescytometri ... 7

2 SYFTE ... 8

2.1 Frågeställning ... 8

3 MATERIAL OCH METOD ... 8

3.1 Bloddonatorer ... 8

3.2 Olika metoder för isolering av mononukleära celler ... 8

3.2.1 Densitets-gradient centrifugering ... 8

3.2.2 Varianter av densitetsgradients-metoden ... 9

3.2.2.1 Uttag av olika fraktioner efter första centrifugering ... 9

3.2.2.2 Isolering av celler utan ficoll ... 9

3.2.2.3 Utsådd i medium innehållande olika koncentrationer FBS ... 9

3.2.2.4 Odling vid olika syrgaskoncentrationer ... 9

3.2.2.5 Isolering av adherenta celler efter hemolys ... 9

3.3 Odling av multipotenta stromaceller ... 9

3.4 Byte av odlingsmedium ... 10

3.5 Passering av celler ... 10

3.6 Flödescytometri ... 10

3.7 Etiska överväganden ... 11

4 RESULTAT ... 12

4.1 Tillväxt och morfologi ... 12

4.2 Analys av cellodlingarna med flödescytometri ... 13

4.2.1 Identifiering av cellpopulationer baserat på storlek och ytstruktur ... 13

4.2.2 Uttryck av cellytemarkörer ... 15

4.2.2.1 Population A ... 16

4.2.2.2 Population B ... 16

5 DISKUSSION ... 18

5.1 Olika protokoll för isolering av adherenta celler från perifert blod ... 18

5.2 Fenotyper, baserat på olika cellytemarkörer, som kan odlas fram med hjälp av olika protokoll ... 18

5.3 Klinisk användning och framtida studier... 19

5.4 Styrkor och svagheter ... 20

6 SLUTSATS... 21

1 INTRODUKTION

1.1 Hematologiska maligniteter

Sjukdomsklassifikationen vid hematologiska maligniteter delas in i lymfocytära samt myeloiska neoplasier som utgår från lymfoida respektive myeloida progenitor-celler i hematopoesen. Myeloiska sjukdomar delas vidare in i de som består av blaster i huvudsak samt där det finns utmognad av cellerna. De med minimal utmognad, dvs blaster, kallas akut myeloisk leukemi (AML); de sjukdomar där det finns utmognad delas in i ytterligare två kategorier, med normal differentiering benämnda myeloproliferativa neoplasier (MPN) samt de med minimal differentiering och dysplastiska förändringar, dvs. myelodysplastiskt syndrom (MDS) [1]. Skillnaden mellan AML och MDS är att vid AML ska över 20% av benmärgen vara blaster men MDS kan utvecklas till AML [2]. Vidare finns en kombination av dessa två, sjukdomar med både dysplastisk och normal utmognad som kallas

myelodysplastiska/myeloproliferativa neoplasier [1].

1.2 Myeloproliferativa neoplasier

MPN:s härstammar vanligen från multipotenta myeloida progenitor-celler där en vanlig sjukdomsorsak är mutationer i tyrosinkinaser som leder till konstant aktivering [3]. En hög andel har en dominant mutation av JAK2 [4]. Det leder till tillväxtfaktor-oberoende

proliferation och överlevnad av benmärgscellerna. Tyrosinkinas-mutation leder till produktion av en eller flera mogna blodcellstyper. Detta leder till en ökad proliferation av

benmärgsceller, transport av neoplastiska stamceller till sekundära hematopoetiska organ, med bildning av extramedullär hematopoes samt eventuellt benmärgsfibros. Patienten drabbas av cytopeni. MPN kan även övergå till akut leukemi. Det finns vidare olika typer av

myeloproliferativa neoplasier där de överlappar varandra både kliniskt och morfologiskt. Sjukdomarna delas in i polycytemia vera (PV), essentiell trombocytos (ET), primär myelofibros (PMF) samt kronisk myeloisk leukemi (CML). Den senare skiljer sig från de andra genom en speciell kromosom-translokation som kallas ”Philadelphia-kromosom” [3].

1.3 Utredning av MPN

MPN-sjukdomarnas egenskaper varierar. Hos PV-patienter ser man framför allt förhöjt hemoglobin orsakat av ökad produktion av erytrocyter. Benmärgen visar hos dessa patienter en kraftig ökning av cellhalten, trilinjär hyperplasi med förökning av erytroida, granulocyt-prekursorer samt megakaryocytära celler [1,2]. Även retikulinfibros förekommer. Hos

ET-patienter är trombocytos en huvudsaklig karakteristika av sjukdomen. Benmärgsbiopsi är nödvändig för att särskilja ET-diagnosen från prefibrotisk myelofibros. Typiska fynd vid PMF är benmärgsfibros, dvs biopsi av benmärgen är central för diagnos av sjukdomen. Vid

framförallt PMF, men även ET och PV kan flödescytometri påvisa ökning av omogna celler som uttrycker CD34 i perifert blod. Allogen stamcellstransplantation är den enda kurativa behandlingen som finns idag för PMF. Vid CML finns ofta hela granulopoesen representerad i blodet, benmärgen är hypercellulär och har låg mängd fett [1,5].

1.4 Mesenkymala stamceller

Mesenkymala stamceller (MSC) är multipotenta stromaceller som kan replikera som

odifferentierade celler och har potential att differentiera till cellinjer av mesenkymal vävnad, såsom ben, brosk, fett, senor, muskler och stroma i benmärgen[6]. MSC är en viktig del av regenerativ medicin, t.ex. vid benmärgstransplantation, som är en väsentlig behandling för leukemi [7]. Isolering av MSC är fortfarande en utmaning för användning inom

vävnadrekonstruktion och cellterapi [8].

1.5 Definition av mesenkymal stamcell

Det finns vissa kriterier för att definiera en multipotent mesenkymal stamcell. De ska vara adherenta när de bibehålls i standardiserade odlingsförhållanden. Dessutom måste de uttrycka CD105, CD73 och CD90 samt sakna uttryck av CD45, CD34, CD14 eller CD11b, CD79-a eller CD19 och HLA-DR ytmolekyler. De måste även ha kapaciteten att differentiera till osteoblaster, adipocyter och kondroblaster in vitro [9].

1.6 Mesenkymala stamcellers ursprung

I huvudsak är det benmärgen som ger upphov till de mesenkymala stamcellerna, men är ur klinisk synvinkel inte den mest optimala källan då aspiration av dessa celler är ett invasivt och smärtsamt ingrepp [10]. MSC kan även odlas från navelsträngsblod och fettvävnad som en alternativ källa istället för benmärgen. Cellerna i benmärgen isoleras från vävnadsfragment med en liten mängd tillväxtmedium för att tillåta fäste till odlingsplasten. När detta skett kan sedan vävnaden täckas helt i medium [11]. En annan alternativ källa för MSC är perifert blod (PB-MSC) som är lättillgängligt och kan tas från en individ med minimal invasivitet [12,13]. Dessa celler har rapporterats kunna isoleras med hjälp av densitetsgradient-centrifugering, eller hemolys, varefter tillväxtmedium tillsätts och cellerna odlas i värmeskåp på 37°C med 5% CO2 [11]. Möjligheten att odla fram MSC från perifert blod är dock ifrågasatt [14].

1.7 Odling av mesenkymala stamceller från benmärgen via aspiration

Vid odling av mesenkymala stamceller aspireras benmärg och spädes ut med samma volym saltbuffert och läggs ut på Ficoll-Paque media-lösning. Detta centrifugeras på 400xg i 30 min. MSC:s samlas in från gränsskiktet och tvättas två gånger med PBS. Cellerna odlas i

cellodlingsflaskor i α-MEM kompletterat med 10% FBS och antibiotika. Cellerna inkuberas på 37°C under hypoxi- eller normoxi-förhållanden. De icke adherenta cellerna utrensas efter tre dagar vid medium-utbyte och de adherenta MSCs odlas till de har en 80%-ig täthet innan de trypsineras och passeras [12].

1.8 Fibrocyter

En annan celltyp att ta hänsyn till vid odling från blod är fibroblast-liknande celler som kallas fibrocyter. Fibrocyter infiltrerar läkande sår där de medierar vävnadsreparation och fibros genom att producera kollagen [15]. Cellerna har både monocyt- och fibroblast-liknande egenskaper [16]. De uttrycker HLA-DR men inte CD90 [17,18]. Fibrocyter härstammar från CD14+ cellpopulation av PBMC [19].

1.9 Odling av PB-MSC

Tidigare forskning har visat inkonsekventa resultat vid isolering och odling av MSC från adult perifert blod. Vissa har lyckats odla cellerna [13,20–22] medan andra har misslyckats [14,23]. En trolig förklaring kan vara att PB-MSC är närvarande i cirkulationen i lågt antal, speciellt hos vuxna individer. Svårigheten att odla kan bero på att metoden inte är fullt

optimerad för isolering, rening och tillväxt av cellerna. Dessutom finns en stor diversitet i PB-MSC:s fenotyp, genuttryck samt biologiskt uppträdande [24].

1.10 Flödescytometri

Vid flödescytometri (FCM) används specifika antikroppar kopplade till fluoroforer mot dessa markörer. Fluoroforerna är ämnen som sänder ut fluorescence när de blir bestrålade av ljus vid olika våglängder. Specifik infärgning innebär en signal (topp) som högerförskjuts i förhållande till bakgrunden (avsaknad av inbindning). I ett diagram i mjukvaran som hör till FCM-instrumentet kan man sedan avläsa inbindning av antikropp som en högerförskjutning längs x-axeln. Ju större inbindning av antikropp, desto större uttryck av markör. Y-axeln i diagrammet anger antalet celler/partiklar som utsänder ljus vid denna våglängd med en viss

intensitet. Mjukvaran i flödescytometern kan sedan räkna ut hur stor andel av cellerna i en population som uttrycker en viss markör [25].

2 SYFTE

Att utvärdera olika metoder för isolering och odling av mesenkymala stamceller från perifert blod.

2.1 Frågeställningar

1. Hur effektivt är olika protokoll för isolering av adherenta celler från perifert blod? 2. Vilka fenotyper, baserat på olika cellytemarkörer, odlas fram med hjälp av dessa

protokoll?

3 MATERIAL OCH METOD

3.1 Bloddonatorer

Totalt har tio donatorers venösa blod (ca 30 ml per donator) använts för isolering av adherenta celler. Dessa har namngetts S1-S10. Både friska donatorer samt en polycytemia vera-patients blod har använts.

3.2 Olika metoder för isolering av mononukleära celler 3.2.1 Densitetsgradient-centrifugering

I studien användes densitetsgradient-centrifugering för att isolera mononukleära celler från humant perifert blod. Tio stycken blodprovsrör (8–32 ml) poolades ihop i ett större koniskt rör, 50 ml. Dessa centrifugerades på 1000xg i 15 min (långsam inbromsning). Detta gav upphov till tre skikt med plasma överst, PBMC:s i mitten (buffy coat) samt erytrocyter längst ned. Plasma-fraktionen avlägsnades och ca 5 ml buffy coat överfördes till ett annat koniskt rör. Två volymer PBS tillsattes till buffy coaten. Buffy coaten droppades försiktigt över högmolekylär polysackarid, Ficoll® (GE Health Care), i ett nytt rör. Volymen Ficoll® var 43%

av totalvolymen. Röret centrifugerades vid 400xg i 30 min (långsam inbromsning). Tre nya skikt uppstod och endast mellanskiktet innehållande mononukleära celler (ca 5 ml) fördes över till ett nytt provrör och späddes med 45 ml odlingsmedium (DMEM/F12 med 10% FBS, ThermoFisher). Röret centrifugerades vid 300 xg i 10 min. Vätskan hälldes av och

cellpelleten resuspenderades med 2–10 ml medium genom att pipetteras upp och ned cirka fem gånger. Cellerna räknades i hematocytometer och såddes ut i flaskor eller petriskål.

Cellerna odlades i värmeskåp vid 37°C med 5% koldioxid. Den beskrivna metoden benämns fortsättningsvis #1a.

3.2.2 Olika versioner av densitetsgradients-metoden 3.2.2.1 Uttag av olika fraktioner efter första centrifugering

I den första versionen togs buffy coaten om hand som ovan (#1a), men även (separat) 2,5 ml nedom buffy coat (som innehöll framför allt erytrocyter) (#1b) samt (separat) 7 ml av övre lagret (framför allt plasma) (#1c) för att undersöka eventuell förekomst av PBMC:s i dessa områden. Fraktionerna undergick sedan Ficoll® som beskrivits för metod #1a ovan.

3.2.2.2 Isolering av celler utan ficoll

En annan version av isolering av PBMC var att centrifugera buffy coat (#2a) samt övre lagret (framförallt plasma) (#2b) utan ficoll i 5 min före utsådd.

3.2.2.3 Utsådd i medium innehållande olika koncentrationer FBS

I vissa fall såddes cellerna ut i 10% FBS, istället för 20% (#3). I andra fall såddes cellerna ut med enbart 20% FBS (variant #4).

3.2.2.4 Odling vid olika syrgaskoncentrationer

I vissa fall odlades cellerna vid 5% syrgastryck istället för ambient (ca 18%). För att skapa denna hypoxi justerades syrehalten till 5% i inkubatorn med hjälp av kvävgas (variant #5).

3.2.2.5 Isolering av adherenta celler efter hemolys

Ett sista alternativ för isolering av adherenta celler från perifert blod var hemolys, utan densitetsgradient-centrifugering (#6). För detta späddes 2 ml EasyLyse Erythrocyte-lysing reagent® (BD)med 38 ml steriliserat vatten (spädning 1:20). 2,1 ml perifert blod tillsattes till

denna lösning och blandades noga. Efter 15 min inkubering centrifugerades blandningen vid 300xg i 10 min. Supernatanten hälldes av och cellpelleten resuspenderades i 5 ml

odlingsmedium.

3.3 Odling av multipotenta stromaceller

MSC isolerades från human benmärg taget från kasserad vävnad efter knäledspastik. Detta var gjort i forskningsgruppen innan denna studie påbörjades. Kortfattat innebar detta att små

bitar av benmärg behandlades med kollagenas i 16 timmar vid 37°C. Efter centrifugering och tvätt i PBS odlades sedan celler från benmärgsbitarna under samma betingelser som

blododlingarna.

3.4 Byte av odlingsmedium

Byte av odlingsmedium gjordes två gånger i veckan av samtliga odlingar. För odlingar vid hypoxi byttes endast hälften av mediumet ut. Det gäller även de celler som såddes ut

samtidigt, och som avsågs jämföras med hypoxi-odlingarna. Orsaken till detta var att behålla viss del av celler och av dessa producerade tillväxtfaktorer, och därmed öka viabiliteten hos PBMSC. Odlingar som trypsinerats och passerats en gång tillfördes medium (till hälften) som konditionerats med celler före första passage. Andra hälften var nytt medium. Vid bytet av medium för hypoxi-odlingar användes parafilm för att täcka för flaskornas filter-försedda lock. Detta för att utsätta dem för så lite syre som möjligt. Dessutom användes medium som utsatts för hypoxi (konditionerats) till dessa odlingar.

3.5 Passering av celler (trypsinering)

För att passera cellerna till en större flaska tillsattes enzymet trypsin (ThermoFisher) för att cellerna skulle lossna från botten för att sedan kunna odlas på en större yta i samband med att de växer. Mediumet aspirerades bort och cellerna tvättades med PBS två gånger. Cellerna inkuberades med trypsin vid 37°C ca 15 min. 5 ml odlingsmedium tillsattes och cellerna centrifugerades vid 300xg i 5 min. Supernatanten hälldes av och pelleten resuspenderades i odlingsmedium och fördes över till odlingsflaska.

3.6 Flödescytometri

Vi använde oss av FCM för att analysera uttrycket av cell-specifika markörer. Cellerna trypsinerades enligt ovan och överfördes till tre rör. Cell-pelletarna resuspenderades sedan i olika antikropps-lösning (BD) enligt tabell 1. Cellerna inkuberades med antikropparna 10 min i mörker i rumstemperatur. Därefter tillsattes 0,5 ml PBS. Cellerna förvarades i kylskåp max två timmar före analys. Cellerna analyserades i Accuri C6 Plus® flödescytometer (BD); 20

000–30 000 ”events” insamlades och datan analyserades med mjukvara inbyggd i instrumentet.

Tabell 1. Antikroppskombinationer för flödescytometri

Kanal Antikropp Kombination 1 Kombination 2 Kombination 3

(Negativ kontroll) FL1 CD73-FITC 5 µl - - FL3 HLA-DR-APC 5 µl - - FL4 CD90-PE-Cy7 5 µl - - FL3 CD14- Percp-Cy5,5 - 5 µl - FL4 CD105- AF647 - 5 µl - Brilliant stain® 50 µl 50 µl 50 µl

I tabell 2 presenteras vilken metod som användes till respektive odling.

Tabell 2: Beskrivning av vilken metod som användes till respektive odling

Metod Beskrivning av metod Individ

1a Densitetsgradient-centrifugering S1-S10

1b Centrifugat taget nedom buffy coat. S1

1c Centrifugat taget ovanför buffy coat S1

2a Centrifugering av buffy coat utan ficoll S1 2b Centrifugering av lagret ovanför buffy coat utan ficoll S1

3 10% FBS under hela odlingen S1-S2

4 20% FBS under hela odlingen S3-S10

5a Hypoxi S6-S10

5b Normoxi S6-S10

6 Hemolys samt hypoxi S8-S10

3.7 Etiska överväganden

Detta arbete har gjorts inom ramen för godkänd etikprövning (EPN Uppsala, dnr 2010/294). Från alla donatorer har vi fått informerat samtycke att ta venprover. Blodet har anonymiserats och tilldelats en kod (S1-10), som inte kan spåras tillbaka till donatorn.

4 RESULTAT

4.1 Tillväxt och morfologi

Av totalt 26 antal odlingar som påbörjades med de metodalternativ som angivits i tabell 2, var det endast åtta som uppvisade en celltillväxt som medgav fortsatt analys, dvs där hälften av odlingsytan i en 25cm2-flaska var täckt med celler inom 31 dagar (cirka 105 celler). I figur 1

visas dessa celler som har odlats, bilderna visar deras tillväxt och morfologi vid första trypsinering. Antal dagar till trypsinering är angivet i tabell 3. De adherenta cellerna observerades ha olika storlek och form, och dessa varierade mellan odlingarna (Fig 1). Odlingen med MSC visade en homogen grupp med spolformade celler. Celler med detta utseende sågs endast delvis hos övriga odlingar. Tabell 3 visar också antalet celler i varje odling, uppskattat efter trypsinering. De odlingar som inte växte fram var de med metoderna 1b, 1c, 2a, 2b samt 3 (Tab 2). Alltså växte otillräckligt antal celler från fraktioner utanför buffy coat, utan ficoll eller med 10% FBS i odlingsmediumet. De odlingar som vi kunnat analysera flest av var hypoxi-baserade (sex odlingar, varav tre efter hemolys). Endast två odlingar under normoxi kunde framodlas (Fig 1, Tab 3).

Figur 1. Odlingarnas morfologi och tillväxt vid första trypsinering. MSC, multipotenta stromceller från benmärg.

Tabell 3. Antal dagar från utsådd till trypsinering samt cellantal vid trypsinering. MSC är tidigare odlade celler från benmärg.

4.2 Analys av cellodlingarna med flödescytometri

4.2.1 Identifiering av cellpopulationer baserat på storlek och ytstruktur

För att kontrollera vilka fenotyper som odlats fram hos cellerna genomfördes flödescytometri på samtliga odlingar där åtminstone hälften av ytan var täckt med celler (105 celler vid

trypsinering). Tre skilda populationer av celler/partiklar identifierades i samtliga odlingar som ses i figur 2. De som vi har ansett vara av intresse har namngivits population A respektive population B. Population A innehöll mindre celler, med mer homogen ytstruktur. Population B innehöll större och till ytstrukturen ojämnare celler. Den tredje populationen befann sig nere i det vänstra hörnet, sannolikt representerande cellfragment/debris enligt tidigare erfarenhet. Därav är den populationen inte med i analysen. Populationerna från blod skiljde sig från MSC då det var en större spridning på cellerna hos de förra (avseende storlek och ytstruktur), samt en mycket liten population A i den senare. Notabelt är att population A generellt var mer markerad (dvs fler celler) hos de odlingar som odlats under hypoxi (metod 5a och 6) (Fig 2). Hos odlingen S10 6 syntes dock endast få celler i de båda populationerna.

Figur 2. Flödescytometri. Identifierade populationer benämndes population A respektive population B. FSC, forward scatter, proportionell mot cell/partikelstorlek. SSC, side scatter, proportionell mot ojämnheter i cell/partikelytan.

Figur 3. Exempel på celler som är positiva (överst) respektive negativa (nederst) för en viss markör. Högerförskjutningen i x-led visar att en stor andel av cellerna uttrycker den specifika

markören. 4.2.2 Uttryck av cellytemarkörer

Möjliga adherenta celler som kan framodlas från blod inkluderar monocyter/makrofager fibrocyter samt MSC. För att identifiera dessa i odlingarna analyserades uttrycket av specifika cellyte-markörer med hjälp av flödescytometri. De markörer som analyserades var CD14 och HLA-DR för antigenpresenterande celler/makrofager och CD73, CD90 och CD105 för MSC. Fibrocyter utgör ett mellanting mellan monocyter och mesenkymala celler och är enligt litteraturen HLA-DR-positiva men CD90-negativa. Figur 3 visar ett exempel på hur det ser ut när celler är positiva för en viss markör.

Flödescytometern har räknat ut hur stor andel av cellerna som uttrycker en viss markör och dessa siffror har sammanställts för vår studie i tabell 4. Där kan man utläsa hur många procent av cellerna som uttrycker respektive markör i population A samt population B, där avdrag för bakgrund gjorts. Resultat från MSC-odling från benmärg är också medtagen som referens. I

odlingen S10 6 blev det inga pålitliga resultat eftersom antalet celler var nästintill obefintliga i population A och B. I bilaga 1 finns en fullständig version av tabell 4, innan avdrag av

bakgrunden gjordes.

4.2.2.1 Population A

I tabellen kan man se att alla odlingar i population A uttrycker CD73 till viss del, som mest 37%. I MSC (referensodling) uttrycktes CD73 i större omfattning (91%). CD90 uttrycks till 90% hos MSC och som mest 38% hos blododlingarna. HLA-DR uttrycks inte hos MSC men hos blododlingarna ligger uttrycket mellan 45–76%. CD14 uttrycktes hos MSC till 68% medan blododlingarna uttryckte CD14 mellan 25–40%. CD105 uttrycktes till 93% hos MSC och 28–38% hos blododlingarna. Den odling som är mest lik MSC, alltså högst uttryck av CD73, CD90 och CD105 är S8 5a som odlades med hypoxi. Dock uttrycker denna odling hög procent av HLA-DR vilket inte MSC gör. Den som har lägst HLA-DR-uttryck är S9 6 som var den odlingen med hemolys. Den har även bland de lägsta uttrycket av CD14. Den andra odlingen med hemolys, S8 6, hade dock ett högre uttryck av HLA-DR (67%) och CD14 (37%). Den odling med högst uttryck av CD105 var S6 5b alltså den odlingen med normoxi-förhållanden. Sammantaget kan man se att hypoxi-odlingarna har högt uttryck av CD73, CD90 samt CD105 medan hemolys-odlingen S9 6 har lägst uttryck av CD14 samt HLA-DR.

4.2.2.2 Population B

I population B syntes uttryck av CD73, CD90 samt CD105 hos referensodlingen för MSC (över 96%) medan de var negativa för HLA-DR samt CD14 (under 8%). CD73 uttrycktes endast till maximalt 23% hos blododling S9 6. CD90 uttrycktes lite hos samtliga

blododlingar, högst hos S9 6 (24%). HLA-DR uttrycktes hos över 83% av cellerna i samtliga blododlingar. CD14 uttrycktes med mycket varierande grad hos blododlingarna, mellan 0,2– 88%. CD105 uttrycktes högt hos samtliga blododlingar, över 81%. Denna population är mindre lik MSC än population A enligt tabellen. Hemolys-odlingen S9 6 är mest lik MSC men har även ett högt uttryck av HLA-DR och CD14 vilket inte MSC har. Samtliga

blododlingar har för övrigt högt uttryck av HLA-DR vilket inte MSC har. Mest lik MSC är S9 6 när det gäller markörerna CD73 och CD90. Denna odling har även högt uttryck av CD105. Däremot har CD14 lägst uttryck hos normoxi-odlingen S6 5b. HLA-DR är minst uttryckt hos hemolys-odlingen S8 6 vilket även kunde ses hos hemolys-odlingen S9 6 i population A.

Tabell 4: Uttryck av olika cellytemarkörer hos blododlingar och MSC. Värden är angivna som procent av totalt cellantal i populationen, efter avdrag av bakgrundsvärdet.

Tabell 5 visar hur stor procentandel mesenkymala stamceller vi lyckats odla fram per population, utifrån det faktum att mesenkymala stamceller är den enda adherenta celltyp i blod som uttrycker CD90. Fraktionen av CD90-positiva celler kan dock ej bli större än fraktionen av andra markörer i studien, enskilt betraktade, och som specificerar MSC

(CD73+, CD105+, HLA-DR-) ). Därför kan den angivna procentsatsen MSC i tabell 5 skilja sig från CD90+ värdena i tabell 4. Celler som är HLA-DR- har beräknats som 100% minus procenten HLA-DR+ celler. CD14 har ej tagits med i beräkningen, se diskussionen.

Tabell 5: Procentandel mesenkymala stamceller (MSC) per population baserat på CD90-positivitet, samt med hänsyn till uttrycket av de andra markörerna.

Sammantaget visar resultatet att odlingar av adherenta celler från blod bäst kunde framodlas under hypoxi, med hjälp av Ficoll®-separering, eller hemolys. Två olika cellpopulationer,

baserade på storlek och fysisk ytstruktur, kunde identifieras i varje blododling. Odling under hypoxi tenderade att ge upphov till fler celler i den av populationerna som hade de minsta cellerna, storleksmässigt. Denna population innehöll också generellt betydligt fler CD73- och CD90-positiva celler, och färre HLA-DR-positiva celler än populationen med och större och till ytstrukturen ojämnare celler. Den senare populationen innehöll dock fler CD105-positiva celler.

5 DISKUSSION

Baserat på uttryck av specifika markörer, stödjer vår studie bilden att hypoxisk miljö gynnat tillväxt av MSC. Dessutom visar resultatet att en tydlig storleksskillnad finns mellan den population som innehöll flest MSC och den population som innehöll minst antal MSC.

5.1 Olika protokoll för isolering av adherenta celler från perifert blod

En hypoxisk miljö för stamcellerna verkar vara en bättre metod än normoxi då denna miljön gav en större tillväxt av celler och därmed fler odlingar som kunde analyseras. Dock skiljer sig morfologin på de celler vi lyckades odla fram jämfört med andra studier där samma protokoll har använts. Cellerna ser mer homogena och spolformade ut jämfört med en mer heterogen population i vår studie. Jämför man flödescytometrin på samma studie ses också skillnader i uttryck av CD-markörer. I den nuvarande studien ses inte samma höga uttryck av markörerna CD73, CD90 samt CD105 som en annan studie visar [26]. En annan studie där man isolerat adherenta celler på samma sätt visar likaså en mer homogen population av celler än cellerna i denna studie. Även flödescytometrin i den studien visar högt uttryck av relevanta CD-markörer, över 95% av CD29, CD90, CD105, CD44 samt CD73 vilket inte uppnåddes på någon av våra odlingar [12]. Hypoxi verkar vara den metod som får fram flest celler med MSC:s markörprofil, framför allt CD90 uttrycks mer hos hypoxi-odlingarna.

Enligt tidigare studier var ett sätt att isolera MSC och avlägsna erytrocyter på ett effektivt sätt att utsätta cellerna för hemolys. Denna metod fungerade mindre bra då endast tre

överhuvudtaget kunde odlas fram varav endast två gav tillräckligt många celler att analysera [12]. Ficoll verkar vara ett bättre alternativ då fler odlingar tillväxte med denna metod.

Vi fann att efter trypsinering och överföring till större flaskor slutade odlingarna sin tillväxt. Detta kan troligen förklaras med att monocyter lätt differentierar till makrofager när de odlas in vitro och därmed stannar av i tillväxten [27]. Dessutom finns det mycket få MSC i blodet vid stabila förhållanden som heller inte gynnas av de andra cellernas tillväxt [12].

5.2 Fenotyper, baserat på olika cellytemarkörer, som kan odlas fram med hjälp av olika protokoll

Utifrån tabell 4 kan man notera att blandpopulationer har uppkommit från samtliga

MSC gör [9,17], och att populationerna därför till stor del innehåller monocyter. En annan skillnad mellan populationerna är att population A har mer uttryck av CD90 som är en mer specifik markör för MSC, då inga studier hittas att monocyter uttrycker CD90, därav finns troligen fler sådana celler i den populationen jämfört med population B [9]. I population B såg man istället att alla odlingar var CD90-negativa vilket talar för att det är mer fibrocyter i den populationen då fibrocyter är negativa för CD90 och positiva för HLA-DR [17,18,28]. Problematiken med vissa av dessa markörer är att MSC har förmågan att inducera uttryck av exempelvis CD73 hos monocyter, vilket kan leda till ett oväntat uttryck av denna markören [29]. Även CD105 uttrycks av både MSC och fibrocyter, om monocyterna har differentierat till fibrocyter under odlingen kan det eventuellt vara en förklaring till det höga uttrycket av CD105 som framför allt ses i population B, eftersom cellerna även har höga HLA-DR-uttryck i den populationen [9,18]. En annan förklaring är att vid odling av monocyter kan de börja uttrycka CD105 spontant [30].

Ett annat fynd är att CD14 uttrycks till 68% hos MSC i population A vilket MSC inte ska göra [9]. Detta kan förklaras med att det har blivit en korsreaktivitet vid analysen av

flödescytometrin. I en tidigare studie hittade man kloner av CD14 antikroppar, där tre av fyra färgade MSC vilket då leder till ett falskt för högt värde av CD-markören vilket kan förklara det höga uttrycket i vår studie [31].

I tabell 5 kan man se andelen mesenkymala stamceller i population A respektive population B, baserat på CD90-uttryck, samt med hänsyn till övriga markörer (se beskrivning av detta i resultatet). Tabellen förtydligar att det finns stamceller i minst den procentandel som är angiven. CD14 har ej tagits med i beräkningen på grund av möjlig ospecificitet enligt ovan. Resultatet av denna beräkning visade att andelen MSC inte skiljde sig väsentligt från den baserat på enbart CD90 positivitet (se tabell 4), dvs 23–33% av cellerna i population A, och 0–9% i population B (se tabell 4).

5.3 Klinisk användning och framtida studier

Den kliniska användningen av MSC men även fibrocyter och monocyter är av stort intresse för att studera olika benmärgssjukdomar. Möjlig klinisk användning för MSC är

stamcellstransplantation då det är behandlingen för dessa sjukdomar. Dessutom kan dessa celler användas för att få en lättare tillgång vid diagnos och utredning av dessa sjukdomar då de flesta idag kräver aspiration av benmärg för att få en tydlig bild av sjukdomen. Kan man ta

ett venprov är detta en mycket mindre invasiv metod för patienten. Kan dessa celler isoleras från perifert blod på ett optimerat sätt kan benmärgssjukdomarna studeras lättare och en större förståelse för behandling och utredning av dem kan fås [12,26].

Det finns ytterligare metoder, som är relativt enkla, att pröva för att förbättra MSC utbytet. En sådan metod är så kallad panning. Det innebär att man efter ficoll-separering och utsådd tvättar cellerna med PBS redan efter ett dygn, eller tidigare, för att avlägsna celler som ännu inte bundit starkt till odlingsplasten. Då skulle man eventuellt kunna avlägsna en del av monocyterna [32].

En annan metod som kan prövas är differentialtrypsinering. När vi trypsinerade cellerna fick vi vänta cirka 20 minuter för att få åtminstone majoriteten av cellerna att lossna. Detta är i sig problematiskt då vi ville ha med alla celler till analys eftersom vi inte kunde säga säkert vilka celler som faktiskt satt kvar. Detta ger dock upphov till tanken att begränsa trypsineringen, och se vilka cellerna som lossar först (kallat differentialdifferentiering). Detta kan vara lovande då en annan studie observerat att MSC lossnar tidigare än andra celler (osteoclast precursor cells), redan efter 3–5 min medan andra celler lossnar efter längre exponering av trypsin (10–15 min). På så sätt kan man avlägsna celler som inte är av intresse [33]. Detta är något som skulle kunna undersökas i framtida studier i samband med blododlingar.

5.4 Styrkor och svagheter

En styrka med vår studie är att isolerings- och odlingsmetoden som beskrivits är relativt enkel. Den undviker dyra och exklusiva isoleringsmetoder som t. ex cellsortering /magnetism i kombination med specifika antikroppar riktade mot cellytemarkörer. Den senare metoden har även nackdelarna att isolering baserat på endast en markör gör att man får ett dåligt utbyte, alltså få celler. Dessutom kan man missa relevanta celler som uttrycker vald markör svagt.

En svaghet med studien är att trots försök med flera olika metoder lyckades vi inte odla fram en renodlad population av MSC vilket innebär att metoden behöver vidareutvecklas.

6 SLUTSATS

Våra resultat talar för att en hypoxisk miljö gynnar MSC:s tillväxt från blod, samt att dessa celler anrikas i en population av celler som har en mindre storlek än övriga adherenta celler (framför allt monocyter/makrofager). Fler studier behöver utföras, där protokollet kan kompletteras med storleksseparering, panning och differentialtrypsinering i olika

kombinationer. Detta torde löna sig då potentialen för att lättare studera benmärgssjukdomar, inklusive MPN-sjukdomar skulle vara en stor vinst.

SÄRSKILT TACK

Jag vill rikta ett speciellt tack till min handledare Mikael Ivarsson som har stöttat mig genom hela arbetet. Tillgänglig, uppmuntrande och engagerad i hela processen från början till slut och har gett mig en positiv första bild av forskarvärlden!

REFERENSER

1. Gahrton G, Juliusson G. Blodets sjukdomar : lärobok i hematologi, p-83-89. 1st ed. Lund: Studentlitteratur; 2012.

2. A. Victor Hoffbrand, Paul A. H. Moss. Hoffbrand’s Essential Haematology [Elektronisk resurs]. Wiley-Blackwell; 2015.

3. Kumar V, Abbas AK, Aster JC. Robbins and Cotran pathologic basis of disease [Elektronisk resurs]. 9th ed. 2015.

4. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Teo S-S, Tiedt R, Passweg JR, et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005; 352:1779– 90.

5. Choi CW, Bang S-M, Jang S, Jung CW, Kim H-J, Kim HY, et al. Guidelines for the management of myeloproliferative neoplasms. Korean J Intern Med 2015; 30:771–88. 6. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al.

Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284:143–7. 7. Egusa H, Sonoyama W, Nishimura M, Atsuta I, Akiyama K. Stem cells in dentistry – Part I: Stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research 2012; 56:151–65.

8.Ab Kadir R, Zainal Ariffin SH, Megat Abdul Wahab R, Senafi S. Molecular

characterisation of human peripheral blood stem cells. S Afr J Sci 2012; 108:7 Pages. 9. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8:315–7.

10. Antmen B, Saşmaz I, Birbiçer H, Ozbek H, Burgut R, Işik G, et al. Safe and effective sedation and analgesia for bone marrow aspiration procedures in children with alfentanil, remifentanil and combinations with midazolam. Paediatr Anaesth 2005; 15:214–9.

11. Trivanović D, Kocić J, Mojsilović S, Krstić A, Ilić V, Djordjević IO, et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton’s jelly. Srp Arh Celok Lek 2013; 141:178–86.

12. Lin W, Xu L, Lin S, Shi L, Wang B, Pan Q, et al. Characterisation of multipotent stem cells from human peripheral blood using an improved protocol. Journal of Orthopaedic Translation 2019; :S2214031X18301797.

13. Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G, Edwards CJ, Moss J, Burger JA, et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res 2000; 2:477– 88.

14. Wexler SA, Donaldson C, Denning-Kendall P, Rice C, Bradley B, Hows JM. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal “stem” cells but umbilical cord and

mobilized adult blood are not. Br J Haematol 2003; 121:368–74.

15. Bucala R, Spiegel LA, Chesney J, Hogan M, Cerami A. Circulating fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair. Mol Med 1994; 1:71–81.

16. Abe R, Donnelly SC, Peng T, Bucala R, Metz CN. Peripheral blood fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites. J Immunol 2001; 166:7556–62. 17. Bucala R. Fibrocytes: New Insights Into Tissue Repair and Systemic Fribrosis. World Scientific; 2007.

18. Table 1 Markers of cultured human fibrocytes. [cited 2020 Jan 1]; Available from: https://www.nature.com/articles/3700654/tables/1

19. Yang L, Scott PG, Giuffre J, Shankowsky HA, Ghahary A, Tredget EE. Peripheral blood fibrocytes from burn patients: identification and quantification of fibrocytes in adherent cells cultured from peripheral blood mononuclear cells. Lab Invest 2002; 82:1183–92.

20. Wan C, He Q, Li G. Allogenic peripheral blood derived mesenchymal stem cells (MSCs) enhance bone regeneration in rabbit ulna critical-sized bone defect model. Journal of

Orthopaedic Research 2006; 24:610–8.

21. Huss R, Lange C, Weissinger EM, Kolb HJ, Thalmeier K. Evidence of peripheral blood-derived, plastic-adherent CD34(-/low) hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cells 2000; 18:252–60.

22. Zhao Y, Glesne D, Huberman E. A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100:2426–31.

23. Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, Caplan AI. Human bone marrow-derived mesenchymal (stromal) progenitor cells (MPCs) cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections. J Hematother 1997; 6:447–55.

24. He Q, Wan C, Li G. Concise Review: Multipotent Mesenchymal Stromal Cells in Blood. STEM CELLS 2007; 25:69–77.

25. Brown M, Wittwer C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem 2000; 46:1221–9.

26. Ouryazdanpanah N, Dabiri S, Derakhshani A, Vahidi R, Farsinejad A. Peripheral Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells: Growth Factor-Free Isolation, Molecular Characterization and Differentiation. Iran J Pathol 2018; 13:461–6.

27. The separation, long-term cultivation, and maturation of the human monocyte. J Exp Med 1977; 146:1613–26.

28. Pilling D, Fan T, Huang D, Kaul B, Gomer RH. Identification of markers that distinguish monocyte-derived fibrocytes from monocytes, macrophages, and fibroblasts. PLoS ONE 2009; 4:e7475.

29. Monguió-Tortajada M, Roura S, Gálvez-Montón C, Franquesa M, Bayes-Genis A, Borràs FE. Mesenchymal Stem Cells Induce Expression of CD73 in Human Monocytes In Vitro and in a Swine Model of Myocardial Infarction In Vivo. Front Immunol [Internet] 2017 [cited 2020 Jan 1]; 8. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5701925/ 30. Rohde E, Malischnik C, Thaler D, Maierhofer T, Linkesch W, Lanzer G, et al. Blood Monocytes Mimic Endothelial Progenitor Cells. STEM CELLS 2006; 24:357–67. 31. Pilz GA, Braun J, Ulrich C, Felka T, Warstat K, Ruh M, et al. Human mesenchymal stromal cells express CD14 cross-reactive epitopes. Cytometry A 2011; 79:635–45.

32. Moazen B, Zarrinhaghighi A, Nejatollahi F. Selection and Evaluation of Specific Single Chain Antibodies against CD90, a Marker for Mesenchymal and Cancer Stem Cells. Rep Biochem Mol Biol 2018; 7:45–51.

33. Allers C, Lasala GP, Minguell JJ. Presence of osteoclast precursor cells during ex vivo expansion of bone marrow-derived mesenchymal stem cells for autologous use in cell therapy. Cytotherapy 2014; 16:454–9.