Examensarbete 15 högskolepoäng VT 08
Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet
Methodological aspects within the FMCA-method
-do incubation time and the amount of tumor cells influence the antitumoral effect?
Johanna Svensson
Handledare: Lena Lenhammar Klinisk farmakologi
ABSTRACT
Chemotherapy is a common method used for cancer treatment. Especially when it concerns cancers that have grown invasively it seems to be the only efficient treatment due to the substances ability to reach and affect almost the entire body. One major obstacle regarding chemotherapy is that the patients often develop resistance to the cytotoxic substances used. Fluorometric microculture cytotoxicity assay (FMCA) is a method developed to measure sensitivity of tumor cells to different cytotoxic substances in vitro. The assay is based on hydrolysis of fluorescein diacetate to fluorescein by cells with intact cell membranes after incubation with drugs for 72 hours. This study investigated the impact of two methodological factors that may cause errors in the achieved results; namely the possible occurrence of drug decay during incubation and the use of an inappropriate amount of cells. These factors were tested by exposing the cytotoxic drugs to pre-incubation in absence of tumor cells for different times and to use suspensions with different concentrations of cells. The results indicated
occurrence of drug decay in 3 of the 18 substances tested and that the amount of cells affected the results for most of the drugs tested but to different extent.
1 INTRODUKTION
Incidensen av cancer av olika varianter har ökat markant världen över sedan andra världskrigets slut. I Sverige diagnostiserades år 2005 50994 nya fall av cancer. De vanligaste cancerformerna hos män i Sverige är prostatacancer följt av hudcancer och lungcancer. Hos kvinnor är
bröstcancer, tjocktarmscancer och hudcancer vanligast.
Det finns olika teorier som försöker förklara varför cancer tenderar att öka. Faktorer som effekter av det senaste århundradets industrialisering orsakat i form av utsläpp av toxiska föreningar, strålning, användande av pesticider och andra miljöfaktorer tros ha en effekt på cancerstatistiken. Även livsstilsfaktorer som diet, övervikt, rökning, alkoholkonsumtion och längre medellivslängd hos befolkningen kan vara faktorer som direkt eller indirekt har effekt på cancerstatistiken. Den förbättrade cancerdiagnostiken, olika screeningprogram samt effektivare behandling tros i alla fall påverka prevalensen av cancer i världen [1].
Cancer kan uppstå som ett resultat av mutationer som främjar tillväxt eller förhindrar celldöd genom olika mekanismer. Även förmågan att metastasera samt stimulering av angiogenes kan förvärvas. Uppkomst av tumörer orsakas inte av mutationer i en enskild gen, det krävs flera defekta gener för att bryta cellens skyddsmekanismer. Muterade cancergener betraktas därför snarare som bidragande faktor till cancer än som direkt orsak. De här genetiska variationerna kan nedärvas, vilket betyder att alla kroppens celler bär på den defekta genen. Drabbade individer kan därmed utveckla cancer vid ett tidigare skede i livet än individer som enbart drabbas av cancer som ett resultat av somatiska mutationer.
Mutationer i tre olika slags gener brukar användas som förklaringsmodell till tumörutveckling. Onkgener, som i omuterat tillstånd kallas protonkogener, ger upphov till
celldelningsstimulerande proteiner. Tumörsupressorgener kodar vanligtvis för proteiner som hindrar celldelning eller inducerar apoptos. En inaktivering gör att dessa egenskaper förloras. Stabilitetsgener av olika slag minimerar risken för genetiska variationer under exempelvis DNA-replikation och vid exponering av mutagener. Defekta stabilitetsgener leder således till
mutationer i högre utsträckning. Mutationer i dessa gener innefattar alla förändringar i genomet, från de mutationer som innebär variation i enstaka nukleotid, mindre deletioner och insertioner, till amplifikationer och translokationer.
Syftet med cancerbehandling är främst att avlägsna hela tumören eller så stora delar av den som möjligt samt att förhindra återväxt och metastasering, vilket kan ske genom att direkt eller indirekt störa cancercellernas signalsystem eller att stimulera ett immunsvar. Samtidigt måste sannolikhet att bota sjukdomen vägas mot de biverkningar som kan uppstå till följd av
behandling. Behandlingen anpassas efter varje individuell patient och faktorer som vilken typ av cancer, tumörens lokalisation och spridning, patientens ålder och övrig hälsostatus vägs in. De vanligaste behandlingsmetoderna är kirurgi, strålning och cytostatika, både enskilt eller i olika kombinationer med varandra [3]. Innan 1950 bestod cancerbehandling i princip enbart av kirurgiska ingrepp, vilket fortfarande är en vanlig och effektiv behandling vid ett tidigt skede av cancersjukdom då tumören fortfarande är lokaliserad till ett begränsat område. Efter 1960 började strålning användas vid cancerbehandling. Strålning kan användas under omständigheter då kirurgi inte är lämpligt exempelvis på grund av tumörens lokalisation men vanligare är strålning i kombination med kirurgi eller cytostatika. Varken kirurgi eller strålning är effektiva botemedel under omständigheter då sjukdomen metastaserat till övriga delar av kroppen.
Kombinationsbehandlingar med cytostatika kan då vara behandlingsalternativ för många
cancerdiagnoser, då cytostatika har en effekt på de flesta av kroppens organ. Cytostatika används som primärt behandlingsalternativ enbart för ett fåtal typer av cancer, som exempelvis leukemier. Den moderna cytostatikaeran inleddes under 1940-talet baserat på fynd efter 1: a världskriget som visade att soldater som avlidit till följd av exponering av senapsgas visade hämmad
produktion av blodceller samt lymfoid hypoplasi, vilket ledde till misstankar att varianter till senapsgas skulle kunna bota lymfoida tumörer. Inledningsvis skedde både återväxt av tumören och progression av sjukdomen inom några veckor men tanken på att substanser som kunde administreras systemiskt skulle kunna ha effekt på tumörer var född [4].
Cytostatika delas ofta upp i grupper efter deras verkningsmekanismer. Det finns 4
huvudgrupper: alkylerande medel, antimetaboliter, mitoshämmare samt cytotoxiska antibiotika. Förutom dessa grupper finns en 5: e grupp som innehåller övriga cytostatika. I den gruppen finns läkemedel som platinaföreningar, monoklonala antikroppar, proteinkinashämmare, mål-specifika medel, topoisomerashämmare med flera.
nyare specifika cytostatika. Nedan presenteras dessa substansers verkningsmekanismer, därmed exemplifieras en del av ovan nämnda mekanismer.
Melfalan är ett alkylerande medel som utvecklades på 1950-talet. Det är en instabil molekyl som spontant bildar reaktiva intermediärer som orsakar brott och tvärbryggor i DNA-molekylen. En inhiberande effekt uppstår som påverkar både replikation och transkription, vilket leder till celldöd. Melfalan har visat sig ha effekt på maligniteter som multipelt myelom, amyloidos, lymfom, neuroblastom, bröstcancer samt mot ovarialcancer [5].
Gemcitabin är en antimetabolit som inhiberar DNA-syntes genom att en gemcitabinnukleotid infiltreras i DNA-molekylen. Efter det kan enbart en nukleotid läggas till den växande strängen vilket leder till att DNA-syntesen inhiberas så cellen dör [6]. Gemcitabin används i både singel- och kombinationsterapi mot icke småcellig lungcancer, pankreascancer, urinblåsecancer, bröstcancer och ovarialcancer [7].
Docetaxel är en mitoshämmare som verkar mot mikrotubuli. Då funktionella mikrotubuli är nödvändiga för mitos så avstannar processen och cellen går i apoptos. Substansen används mot icke småcellig lungcancer, bröstcancer och prostatacancer [6].
Oxaliplatin är en platinaförening som modifierar DNA-strukturen enligt liknande princip som alkylerande medel och på så sätt inhiberar normal DNA-syntes och dess reparationsmekanismer. Vanligaste tillämpningsområdet är vid metastaserande kolorektal cancer [8].
Bortezomib är en proteasomhämmare, ett mål-specifikt medel. Proteasomen bryter ned proteiner i cellen, en inhibition leder till en ackumulering av bland annat felveckat protein i cellen. En fungerande proteinnedbrytning är livsviktigt för cellen, en hämning resulterar därmed i celldöd. Till skillnad mot många andra cytotoxiska substanser är Bortezomib även toxiskt för celler som inte genomgår celldelning. Bortezomib används för behandling av multipelt myelom. Imatinib är en proteinkinashämmare riktat mot fusionsproteinet Bcr-Abl som är en produkt av translokationen mellan kromosom 9 och 21 som förekommer i kronisk myeloisk leukemi. Dessutom används Imatinib vid stromal gastrointestinal cancer då det hämmar c-kit, som är ett nyckelprotein i den cancerprocessen [6].
DNA-molekylen vilket resulterar i apoptos. Topotecan tillämpas på ovarialcancer och småcellig lungcancer[9].
De överaktiva tillväxtstimulerande signalsystem som existerar i tumörceller resulterar i att de blir känsliga för substanser riktade mot tillväxtstimulerande molekyler och/eller processer involverade i cellens replikation och uttryck. Då dessa uttryck även sker i normala celler så drabbas även de. Känsligast för cytostatikabehandling är de celler som normalt har en aktiv celldelning exempelvis celler i benmärgen, i mag-tarmkanalen och hårceller vilket leder till biverkningar såsom förlust av hår, illamående, förlust av aptit och nedsatt immunförsvar. Dessa biverkningar försvinner oftast efter avslutad behandling medan skador på hjärta, njurar, lungor och reproduktion kan bli permanenta [3].
Under de senaste decennierna så har fokus lagts på att kartlägga de signaleringsvägar cancerceller använder sig av vilket har resulterat i utveckling av läkemedel som är riktade mer specifikt mot mål som uttrycks i tumörceller. Framförallt är dessa läkemedel riktade mot tillväxtfaktorer, signaleringsmolekyler, cellcykelproteiner samt mot molekyler som förhindrar apoptos eller inducerar angiogenes. Då dessa läkemedel mer specifikt eliminerar tumörceller än vad klassiska cytostatika gör så skulle det kunna medföra lindrigare behandling för patienten men på grund av att resistens uppstår så är det oftast inte tillräckligt att enbart angripa ett mål i
tumörcellen. Kombinationsterapi med traditionell cytostatika är ofta nödvändigt för att eliminera tumören [4].
Resistens är vanlig problematik vid cytostatikabehandling. Cytostatikaresistens tros vara orsaken i över 90 % vid behandlingssvikt vid metastaserande cancer [10]. Vissa tumörceller kan uppvisa resistens redan vid en första exponering av cytostatika, vilket förekommer i exempelvis koloncancer, tumörer i njurarna samt i icke småcellig lungcancer. Andra typer av cancer, såsom småcellig lungcancer, ovarialcancer och leukemier, kan inledningsvis svara på behandling för att senare utveckla resistensmekanismer mot den använda cytostatikan men även mot cytostatika som tumören inte exponerats för [11].
Det finns många olika mekanismer som kan orsaka cytostatikaresistens. De delas in i två huvudgrupper. Den första gruppen inkluderar påverkan på mekanismer som transporterar substansen till cellen, som att absorptionen av drogen minskar, drogmetabolismen ökar eller att diffusionen från blodet till tumören minskar. Den andra gruppen omfattar genetiska variationer som sker i tumörcellen som påverkar känsligheten för cytostatika. ATP-beroende proteiner kan pumpa ut substansen ur cellen, amplifikationer och mutationer kan uppstå i målet för läkemedlet. Aktivering av DNA-repareringsmekanismer, blockerad apoptos och aktivering av cellens olika avgiftningsmekanismer är även det mekanismer som kan resultera i cytostatikaresistens [12]. FMCA är en metod som utvecklades i Uppsala under slutet av 1980-talet. FMCA mäter tumörcellers känslighet in vitro vid exponering av olika cytotoxiska substanser [13]. I metoden inkuberas tumörceller under 72 h i 384-håls plattor som är förpreparerade med olika cytostatika. Vid inkubationens slut tillsätts fluoresceindiacetat om hydrolyseras av esterasaktiviteten som förekommer i celler med intakta cellmembran och den starkt fluorescerande produkten fluorescein uppstår. Mängden fluorescein mäts spektrofotometriskt vid 485/520 nm.
Cellöverlevnaden i plattans brunnar anges i survival index, SI, som avspeglar andelen levande celler i procent. Ett lågt SI -värde anger således att de flesta celler påverkats av
cytostatikaexponeringen och att tumörcellerna är känsliga för substansen [14].
FMCA tillämpas exempelvis vid prekliniska studier av cytotoxiska substanser, screening av substansbibliotek och på patientprover vid resistensproblematik [15,16].
Två faktorer som eventuellt kan medföra att metoden kan generera missvisande resultat är att substansen sönderfaller under inkubationen vilket resulterar i mindre cytostatikaexponering. Även celltätheten i brunnarna tros kunna påverka läkemedelseffekten.
Syftet med arbetet var att undersöka substansernas stabilitet och celltäthetens inverkan på den antitumorala effekten av 18 substanser varav de 7 som presenterats ovan kommer att ingå i min uppsats.
2 MATERIAL OCH METOD
2.1 Substanser
flytande form så de vägdes alternativt mättes upp till angiven koncentration och löstes i antingen DMSO, PBS (Dulbecco`s phosphate buffered saline, Sigma) eller sterilt vatten enligt tabell 1 till en stamlösning som senare späddes vidare till den koncentration som var aktuell för respektive substans vid tillsättning till 384-hålsplattorna.
2.2 Spädning av cytostatika samt tillsättning till 384-hålsplattor
De olika substanserna späddes till 10 x önskad maximal koncentration till en totalvolym av 500 µl i 1,5 ml eppendorfrör enligt tabell1. Lösningarna applicerades sedan med hjälp av
pipetteringsroboten BioMek 2000 (Beckman Coulter, USA) till en 384-håls deepwellplatta (Nunc, Danmark) som fungerade som en mallplatta. Substanserna tillsattes i duplikat och späddes till 5 olika koncentrationer genom seriespädning 1/5 med PBS. Plattan innehöll cytostatikafält, rader för kontroller där det enbart applicerades PBS, samt en DMSO-kontroll. I plattorna fanns även plats för 16 blankbrunnar som det senare vid cellutsådden enbart applicerades komplett medium till. 5 µl från varje brunn i deepwellplattan tillsattes till motsvarande brunn i 20 384-håls mikrotiterplattor (NUNC, Danmark) med hjälp av BioMek 2000. Plattorna förvarades i -70°C till dess att användning var aktuell.
Tabell 1. Substanserna som användes i experimentet,
(Eloxaplatin) Topotecan (Hycamtin)
100 GlaxoSmithKline SV
2.3 Cellinje RPMI 8226/S
Till försöket användes cellinje RPMI 8226/S som är en human myelomcellinje framställd av perifert blod från en person som led av multipelt myelom. En cellinje upphör aldrig att dela sig. Denna cellinje har en dubbleringshastighet på 24-36 h. Då den har en känslighet för cytotoxiska droger var den lämplig för försökets ändamål.
2.3.1 Tining av cellinje RPMI 8226/S
Cellinjen förvarades i en ampull i -150°C. Helst skulle cellsuspensionen tina på mindre än 60s. Därför placerades ampullen direkt från -150°C till varmt vatten. Inledningsvis genomgick cellerna tvätt för att avlägsna det frysmedium innehållande 90 % fetalt kalvserum med 10 % tillsatt DMSO som de förvarats i. De applicerades med en pasteurpipett till ett centrifugrör innehållande 10 ml komplett medium (RPMI 1640 från Sigma med tillsats av 100 U/ml
penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 mM glutamin samt 10 % FCS). Röret centrifugerades vid 200 g i 5 min. Supernatanten hälldes av, cellsuspensionen slammades upp efter att 10 ml komplett medium applicerades till röret. Proceduren upprepades en gång.
Räkning av cellerna skedde i Bürkerkammare efter tillsatts av lika delar cellsuspension och 0,4 % trypanblått. Cellsuspensionen placerades i en cellodlingsflaska i inkubator i 37°C med 5 % CO2.
Passage skedde 2 gånger/vecka.
2.4 Preinkubation med komplett medium samt cellutsådd för stabilitetsförsöket
Ett delsyfte med försöket var att kontrollera de olika substansernas stabilitet i odlingsmedium under den 72 h långa inkubation i 37°C med 5 % CO2 som föregick avläsning med FMCA.
När preinkubationen avslutats såddes cellerna ut. Ca 5000 celler i en 20 µl cellsuspension applicerades till varje brunn i de 7 plattorna. En totalvolym på 50 µl uppnåddes i alla brunnarna då cytostatika, medium samt celler hade tillsatts. De 7 plattorna inkuberades 72 timmar innan analys med FMCA skedde. Försöket utfördes vid 2 olika tillfällen.
2.5 Cellutsådd för celltäthetsförsök
Det andra delsyftet i projektet var att undersöka om celltätheten i cytostatikaplattorna påverkade läkemedelseffekten. Vanligtvis appliceras 5000 celler till varje brunn baserat på en celltäthet som är utprovad för FMCA med 96-hålsplattor och anpassats för 384-hålsplattor. Därför valdes 5 olika cellkoncentrationer ut, 10000 celler/brunn, 5000 celler/brunn, 2500 celler/brunn, 1250 celler/brunn samt 625 celler/brunn av cellinje 8226/S. Varje cellsuspension applicerades till varsin cytostatikaplatta av pipetteringsroboten Precision 2000 (Bio-Tek instruments, Winooski, VT). 45µl cellsuspension tillsattes till vardera brunn i plattan. Efter 72 h inkubation så skedde analys med FMCA.
2.6 FMCA
Då cytostatikaplattorna inkuberats 72 h med cellsuspension följde till sist analys med FMCA. FMCA är en automatiserad metod som sker med hjälp av roboten ORCA (Beckman Coulter, USA) med mjukvaran SAMI (Beckman Coulter, USA). Först aspirerades medium och cytostatika ur plattans brunnar. De sedimenterade cellerna stannade kvar på botten. En dubbel tvätt med 70 µl PBS följde med ca 40 min sedimentering emellan. Efter tvätten applicerades 50 µl Q2 –buffert
till varje brunn följt av 1µl FDA löst i DMSO till koncentrationen 0,5 mg/ml. Q2 – bufferten
tillreddes av 1,25 mol/L NaCl, 59mmol/L KCl, 5 mmol/L CaCl2, , 5 mmol/L MgCl2, 10 ml
1mol/L hepes samt MQ-vatten till en totalvolym av 400 ml. pH-värdet korrigerades med NaOH till 7,4. FDA samt alla ingredienser till Q2 –bufferten var beställda från företaget Sigma. En
inkubation i 50 min i 37°C med 5 % CO2 följde. Den genererade mängden fluorescens mättes vid
485/520 nm med FLOUstar Optima device (BMG Labtech GmbH, Tyskland). Cellöverlevnaden angavs i ”Survival Index” (SI), en procentsats på antal celler som överlevt inkuberingen med cytostatika.
2.6.1 Kvalitetskrav för FMCA
Efter FMCA behandlades de erhållna resultaten i Excel där SI räknades fram från
duplikatbrunnarna. Variationskoefficient på den uppmätta fluorescensen från duplikatbrunnarna samt kontrollerna presenterades. Även värden för genomsnittlig blank, förhållande mellan kontroll och blank och för DMSO-kontroll redovisades. För att resultatet från en platta skulle godkännas krävdes att fluorescenssignalen från kontrollbrunnarna var minst 10 gånger större än blankvärdet samt en variationskoefficient på mindre än 30 % i kontrollbrunnarna.
DMSO-kontrollen fick inte heller ha ett SI-värde på mindre än 50 % jämfört med kontrollernas SI-värde.
2.6.2 Behandling av FMCA-resultat för stabilitetsförsök
I programmet Graph Pad Prism illustrerades de olika drogernas SI-värden gentemot
koncentration. De substanser som visade sig ha viss nedbrytning studerades vidare genom att SI i förhållande till antalet timmars preinkubation vid en vald koncentration illustrerades. Även kvarvarande koncentration cytostatika i plattorna studerades i förhållande till preinkubationens längd genom att en dos-responskurva konstruerades av 0-plattans SI-värden emot koncentration. Applikation av räta linjens ekvation mellan de två punkterna på dos-responskurvan där de olika SI värdena för de olika timmarnas preinkubation för den studerade koncentrationen hamnade, möjliggjorde att få ut kvarvarande koncentration i förhållande till tid av preinkubation.
2.6.3 Behandling av FMCA-resultat för celltäthetsförsök
Även vid behandling av resultaten av celltäthetsförsöket behandlades resultatet i Graph Pad Prism. Substansernas SI-värden avsattes emot koncentration. Dessutom presenterades förhållandet kontroll/blank gentemot cellkoncentration, detta för att se om även de lägre cellkoncentrationerna kunde uppnå kvalitetskravet att förhållandet mellan blank och kontroll skulle vara minst 10 gånger och om tillväxthämning skett
3 RESULTAT
3.1 Stabilitetsförsök
3.1.1 Kvalitetskrav
Stabilitetsförsöket utfördes vid två olika tillfällen. De illustrerade värdena i kurvorna är
värden fick strykas då det blev CV-värden på över 30 %. Vid höga CV på SI-värden under 10 behölls dock värdena beroende på att den låga signalstyrkan ofta orsakade viss skillnad på duplikatproverna. Några kontroller fick höga CV men kunde korrigeras då det visade sig handla om enstaka extrema värden, så kallade outliers, och därmed godkännas enligt kvalitetskraven. DMSO-kontroller och förhållande mellan kontroll och blank uppfyllde kvalitetskraven.
3.1.2 Dos-respons för stabila substanser
Gemcitabin och Imatinib uppvisade ingen förlust av aktivitet på grund av nedbrytning under preinkubationen. En sådan bedömning utfördes genom att de olika kurvorna för de olika antalet timmars preinkubation studerades. En viss skillnad i SI-värde förekom bland de substanser som bedömdes som stabila, som Docetaxel och Topotecan som presenteras i figur 1. Då det inte gick att dra paralleller till högre SI-nivåer vid längre preinkubation så tydde resultaten på att
skillnaderna berodde på andra faktorer.
A B 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 0h 2h 4h 24h 72h µM S I % 0.01 0.1 1 10 100 0 25 50 75 100 125 0h 6h 24h 48h 72h µM S I %
Figur 1. Dos - respons för Docetaxel (A) och Topotecan ( B). Kurvorna presenterar hur antalet timmars preinkubation påverkar SI -värdena för testade koncentrationer.
3.1.3 Dos-respons samt nedbrytning för instabila substanser.
återstod vid de olika tidpunkterna vid en vald koncentration i dos-responskurvan presenteras. De kvarvarande koncentrationerna har tagits ut genom att använda 0h-kurvan som standardkurva och applicera räta linjens ekvation mellan de 2 punkter som ger det intervall där SI–värdena hamnar.
Figur 2 illustrerar en dos-responskurva för Bortezomib som tydligt visar att nedbrytning skedde under preinkubationen. Figur 2B och C visar hur antalet timmars preinkubation påverkade SI respektive koncentration aktiv substans i brunnarna vid koncentrationen 0,08 µM.
A B 0.01 0.1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 6h 24h 48h 72h µM S I % C
Figur 2 A visar dos – responskurva för Bortezomib. Kurvan presenterar hur antalet timmars preinkubation påverkar SI -värdena för testade koncentrationer. Figur 2 B visar förhållandet mellan SI och tid av preinkubation vid
koncentrationen 0,08 µ M. C visar förhållandet mellan kvarvarande koncentration och antalet timmars preinkubation vid 0,08 µM.
Figur 3 illustrerar en dos-responskurva för Melfalan som tydligt visade nedbrytning av
substansen redan efter 6 h. Figur 3B och C visar hur antalet timmars preinkubation påverkade SI respektive koncentration aktiv substans i brunnarna vid koncentrationen 20 µM.
A B C 0.1 1 10 100 1000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 4h 6h 24h 48h 72h µM S I %
Figur 3 A visar dos-responskurva för Melfalan. Kurvan presenterar hur antalet timmars preinkubation påverkar SI-värdena för valda koncentrationer. B visar förhållandet mellan SI och tid av preinkubation för koncentrationen 20 µM. C visar förhållande mellan kvarvarande koncentration och antalet timmars preinkubation vid koncentrationen 20 µM.
A B C 0.01 0.1 1 10 100 0 25 50 75 100 125 0h 6h 24h 48h 72h µM S I %
Figur 4. Dosresponskurva för Oxaliplatin. Kurvan presenterar hur antalet timmars preinkubation påverkar SI -värdena för valda koncentrationer. B visar förhållandet mellan SI och tid av preinkubation för Oxaliplatin vid
koncentrationen 4 µM. C visar förhållandet mellan kvarvarande koncentration Oxaliplatin och antalet timmars preinkubation vid koncentrationen 4 µM.
3.2Celltäthetsförsök
3.2.1 Kvalitetskrav
3.2.2 Dos-respons celltäthetsförsök
Figur 5 presenterar dos-responskurvor för de substanser som uppvisade skillnader i celltäthetsförsöket. De visar SI-värde i förhållande till koncentration för de olika
cellkoncentrationerna för alla substanser förutom Bortezomib som inte visade någon som helst skillnad vid de olika cellkoncentrationerna. Figur 5A presenterar dos-respons för docetaxel. Det förekom stora skillnader mellan de olika cellantalen vid en del av koncentrationerna. Dos-respons för Gemcitabin presenteras i figur 5B. Ingen väsentlig skillnad uppvisades förutom för högsta koncentrationen. 5C presenterar dos-respons för Imatinib, skillnader förekom för vissa cytostatikakoncentrationer. Dos-respons för Melfalan visar att ingen väsentlig skillnad
uppvisades förutom för högsta koncentrationen, vilket illustreras i figur 5D. Figur 5E presenterar dos-respons för Oxaliplatin, en viss skillnad förekom för vissa cytostatikakoncentrationer. Dos-respons för Topotecan, som visas i figur 5F uppvisar en viss skillnad för de flesta
C D 0.1 1 10 100 1000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 10000 celler 5000 celler 2500 celler 1250 celler 625 celler µM S I % 0.1 1 10 100 1000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 10000 celler 5000 celler 2500 celler 1250 celler 625 celler µM S I % E F 0.01 0.1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 10000 celler 5000 celler 2500 celler 1250 celler 625 celler µM S I % 0.01 0.1 1 10 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 10000 celler 5000 celler 2500 celler 1250 celler 625 celler µM S I %
3.3.3 Förhållande mellan kontroll och blank
Det var av intresse att undersöka förhållandet mellan kontroll och blank av flera anledningar. Enligt kvalitetskraven så ska förhållandet mellan kontroll och blank vara minst 10, för att undvika att en bakgrund påverkar signalen i allt för stor utsträckning. Det var alltså av intresse att se om även de lägsta koncentrationerna uppfyllde detta krav, vilket resultatet visade att de gjorde. Vid försök med cellinjer så fortsätter cellerna att växa till under inkubationen, därför var det intressant att studera i vilken utsträckning det var möjligt i de högre koncentrationerna eller om en
tillväxthämning skedde. Resultatet visade att tillväxthämning skett vid cellantalen 5000 och 10000 celler.
4 DISKUSSION
Metoden FMCA har som nämnts i inledningen flera olika användningsområden inom området cancerterapi. Det var inte den första metoden som utvecklades för att detektera tumörcellers känslighet för cytostatika, däremot är FMCA enklare att utföra, mindre tidskrävande, har högre reproducerbarhet och god sensitivitet och specificitet [17].
FMCA är applicerbart på de flesta tumörtyper och på både frysta och färska celler [18].
Det finns vissa fördelar med att använda FDA som probe. FDA-hydrolys sker inom de intakta cellmembran som viabla celler har, vid skadade cellmembran har denna aktivitet förlorats. Membrandisintegration är ett sent inslag och ett icke reversibelt steg i de processer som föregår celldöd [17].
Vid metodens utvecklande så utfördes försök för att utreda om FDA-hydrolysen är specifik för levande celler, genom att applicera kända koncentrationer i olika fraktioner av levande och döda celler. Ett linjärt förhållande mellan fluorescens och förväntat antal levande celler uppstod, vilket tyder på att en specificitet för levande celler finns [13].
FDA är inte specifikt för tumörceller, förekomst av exempelvis mononuklerära celler i leukemiprover kan generera fluorescens. De är dessutom inte lika känsliga för cytostatika som tumörceller vilket skulle kunna vara en betydande felkälla. Därför är det viktigt att framställa provmaterial som består av minst 70 % tumörceller samt att provets morfologi bedöms både före och efter inkubation [17].
Det finns dock en del begränsningar för lämpligheten att studera effekten av vissa typer av cytostatika med FMCA-metoden och då särskilt med prover som härstammar från patienter. Då provet representerar en stor del av den totala tumörmassan, så består provet till stor del av tumörceller som inte kommer att dela sig. Därför kommer resultat från rent anti-proliferativa substanser att kunna vara missvisande.
Det kan förekomma skillnader mellan mekanismer som orsakar celldöd in vitro och in vivo trots att samma celler utsätts för samma substans. Det kan även inträffa att tumörcellerna använder sig av olika resistensmekanismer in vitro och in vivo. Om cellerna tillämpar samma resistensmekanismer så kan metoden ändå vara lämplig att använda sig av.
Vid användande av substanser med indirekta verkningsmekanismer, som exempelvis påverkar tumörens vaskualisering eller att en aktivering måste ske för att en cytotoxisk metabolit ska uppstå, kan en effekt uppnås in vivo men utebli in vitro. Det kan även vara svårt att uppnå samma koncentration cytostatika i tumören som in vitro [18].
Vid stabilitetsförsöket visade det sig att 4 av de 7 substanserna som testades var stabila eller att skillnader i SI-värden inte berodde på nedbrytning som orsakats av den inkubation som ingår i metoden. Inte heller någon av de substanser som ingick i försöket men som inte nämns i detta arbete visade tecken på nedbrytning. Dock visade dos - responskurvorna för Docetaxel och Topotecan att SI-värdena skilde sig en aning vid de olika timmarnas preinkubation. Däremot kunde inte dessa skillnader förklaras med att nedbrytning av substansen skett eftersom det inte gick att urskilja ett förhållande då kurvor för kortast preinkubation visade lägre SI-värde. För Docetaxel låg förvisso värden för 0 h respektive 4 h lägre än för kurvor, men då 2 h visade SI-värde liknande övriga kurvors så borde de lägre SI-SI-värdena kunna bero på andra faktorer än just nedbrytning. Docetaxel är av viskös natur vilket kan medföra felkällor vid spädning orsakat av lösningssvårigheter [19]. Sådana omständigheter skulle kunna medföra att det fanns
koncentrationsskillnader både inom samma platta och mellan olika plattor.
spädning kunde medföra att koncentrationsskillnader uppstod i plattorna. Cellsuspensionerna kunde ha olika koncentrationer beroende på felräkning i Bürkerkammaren eller sedimentation vid spädning eller cellutsådd. I vissa kurvor observerades skillnad mellan de 2 olika körningarna, vilket skulle kunna bero på ovan nämnda felkällor.
Dos-respons för Gemcitabin och Imatinib visade liknande SI-värden vid alla timmars preinkubation vid de 5 olika koncentrationerna, vilket indikerade att de inte påverkades av inkuberingen.
Det var 3 substanser som visade tendens att förlora cytotoxisk aktivitet under preinkubationen. Bortezomib hade snäv dos-respons under de första 6 h, från att inte ha någon effekt vid lägsta koncentrationen till att ha full effekt vid näst lägsta koncentrationen. Vid 24 h hade stor del av effekten förlorats för att vid 48 h och vid 72 h endast uppvisa effekt vid de högsta
koncentrationerna. Vid koncentrationen 0,08 µM illustrerade kurvan SI/tid att i princip all effekt klingat av vid 24 h. Kurvan som presenterar förhållandet mellan kvarvarande koncentration substans vid 0,08 µM och tid av preinkubation visade att nedbrytning skedde till dess att en koncentration på 0,02 µM uppnåddes under första dygnet, vilket tycktes vara en inaktiv koncentration. Nedbrytningen av substansen fortsatte förmodligen även fast det inte gick att detektera med FMCA.
Dos-respons för Melfalan visade att stor del av aktiviteten förlorats redan efter 6 h och att efter 24 h så sågs enbart en viss effekt på även den högsta koncentrationen. Kurvorna för SI/tid och koncentration/tid vid 20µM illustrerade att största delen av cytotoxisk effekt klingat av efter 6 h då en inaktiv koncentration på ca 5 µM detekterades. Det var ett faktum som observerades även för högre koncentrationer men som inte presenterades i resultatdelen. Studier visar att Melfalan degraderas genom att reaktiva intermediärer uppstår och har en halveringstid på 1,5 h vid 37°C i fysiologisk buffert [20]. Tillsatts av kloridjoner har visat kunna öka halveringstiden från 4-5 h i rumstemperatur till 16 h i rumstemperatur [21].
Även opublicerade data indikerar att inkubationen i FMCA-metoden kan resultera i nedbrytning av Melfalan så resultatet var förväntat.
Oxaliplatin visade viss tendens till nedbrytning vid 48 h men framförallt vid 72 h vid de högsta koncentrationerna. Till skillnad från Bortezomib och Melfalan så blev det planare kurvor för SI/tid respektive koncentration/tid vid 4µM, vilket tyder på att nedbrytningen skedde i
under den 72 h långa inkubationen. Oxaliplatin bildar snabbt olika reaktiva intermediärer i blod och plasma både in vitro och in vivo och elimineras som oreaktiva molekyler [22]. Möjligt vore att liknande reaktion sker i brunnarna i plattan.
Det är viktigt att tillägga att även en kortare exponeringstid än 72 h kan vara fullt tillräckligt för att generera tillförlitliga resultat. Särskilt för patientceller som inte delar sig i någon större utsträckning under inkubationen så är det möjligt att uppnå fullgod cytotoxisk effekt trots kortare exponering. Vid användande av substanser som visar tendens till nedbrytning kan det då vara bra att standardisera tider för plattillverkning och annat handhavande av substanserna.
Celltäthetsförsöket var på flera sätt enklare att utföra än stabilitetsförsöket. Först och främst så tillsattes den mängd celler som skulle appliceras till varje brunn i en större volym vilket
resulterade i färre höga CV. Dessutom skedde cellutsådden med en annan pipetteringsrobot med ett program som används till rutinprover och därmed väl beprövat. För stabilitetstestet användes 2 existerande program där dispenseringshastigheten och dispenseringshöjden modifierades för att passa försökets ändamål; det vill säga att applicera först medium och så ut celler utan att
kontaminera resterande brunnar i plattan. Viktigt var även att mediet skulle komma i kontakt med substanserna i brunnarna. Stabilitetsförsöket innefattade flera pipetteringssteg och skulle
dessutom utföras enligt ett tidsschema vilket tenderade att öka risken för misstag orsakade av den mänskliga faktorn.
Dos-respons för Bortezomib vid celltäthetsförsöket visade ingen som helst skillnad i SI beroende på cellkoncentration. En faktor som skulle kunna spela in är att Bortezomib har effekt även på celler som inte genomgår celldelning. I resultatdelen framgick att viss tillväxthämning skedde vid de högsta cellkoncentrationerna. Docetaxel däremot presenterade en stor variation i SI mellan de olika cellkoncentrationerna. Då Docetaxel verkar vid själva mitosen så skulle
tillväxthämningen för de högsta koncentrationerna kunna förklara den förlorade effekten [6]. Det uppstod relativt stora skillnader mellan de olika försökstillfällena vilket eventuellt skulle kunna påverka utseendet på kurvorna men resultatet visade att det var av stor vikt att använda lämplig cellkoncentration. Även för Gemcitabin uppstod viss skillnad för de olika
viktigt att beakta vilken cellkoncentration som är lämplig att använda. Melfalan visade sig bara skilja väsentligt i den högsta koncentrationen. Oxaliplatinkurvan indikerade väsentliga skillnader på 2 av punkterna. Även Topotecan skilde sig i SI men skillnaden var ungefär lika stor genom större delen av dos-respons kurvan.
Resultatet för celltäthetsförsöket tydde sammanfattningsvis på att högre SI uppnåddes vid högsta cellkoncentrationen på alla substanser förutom Bortezomib. Den högsta
cellkoncentrationen innehöll dubbelt så många celler än de 5000 celler som appliceras till brunnarna i nuläget. Det skulle därför inte vara aktuellt att använda sig av så högt cellantal, då dessutom förhållandet mellan kontroll och blank indikerade att tillväxthämning skett i brunnarna. Något som däremot var värt att notera var att dos-respons för 5000 celler ofta uppvisade aningen högre SI än 2500, 1250 och 625 celler som däremot ofta följde varandra på liknande sätt.
Förhållandet mellan kontroll/blank visade dessutom att tillväxthämning inte skett vid de cellkoncentrationerna. Det föreligger vissa svårigheter i att minska cellantalet, eftersom det då inte skulle finnas möjligheter att jämföra med existerande data. För en del av de använda
substanserna verkade det som om cellantalet inte påverkade resultatet i så stor utsträckning, under förutsättning att färre än 10000 celler användes. För andra, framförallt Docetaxel, Imatinib och Oxaliplatin verkade det vara av större betydelse.
Vad som däremot kunde vara intressant att studera vidare vore att undersöka hur och om substansernas verkningsmekanism påverkar cytotoxisk stabilitet. Det kunde även vara av intresse att notera om substansernas verkningsmekanism har en påverkan på dos – respons för olika celltätheter och i så fall vilken påverkan de har. Framförallt celltäthetskurvorna väckte funderingar om att de olika substansernas verkningsmekanismer eventuellt kunde påverka att skillnader uppstod, då dos -responskurvorna tedde sig olika. För en del substanser, som
exempelvis Gemcitabin och Topotecan hade kurvorna en liknande lutning fast SI % låg på olika nivåer medan för exempelvis Imatinib och Oxaliplatin fanns skillnader vid vissa koncentrationer. Det kunde även vara både intressant och användbart att se om liknande tendenser uppstår inom grupper med liknande verkningsmekanism.
Resultaten visade att 3 av de testade substanserna förlorade biologisk aktivitet under inkubation vilket skulle kunna generera felaktiga resultat eller i alla medföra att rutiner runt handhavande av instabila substanser etableras. Tumörcellskoncentration påverkade den
de högsta cellkoncentrationerna. Detta tydde på att lägre cellkoncentrationer kunde vara mer lämpliga att använda vid försök cellinje RPMI 8226/S.
5 ACKNOWLEDGMENTS
Ett stort tack till min handledare Lena Lenhammar för all hjälp jag fått! Tack även till Elin Lindhagen och opponentgruppen för synpunkter på uppsatsen. Tusen tack till Henning för världens bästa examenspresent!
6 REFERENSER
1. Irigaray et al. Lifestyle-related factors and environmental agents causing cancer: An overview. Biomedicine and pharmacotherapy (2007) 61. 640-658
2. Vogelstein B, Kinzler KW. Cancer genes and the pathways they control. Nature medicine (2004) 10. 789-799
3. Luqmani Y.A. Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy. Medical principles and practice (2005) 14. 35-48
4. Chabner BA, Roberts Jr TG. Chemotherapy and the war on cancer. Nature reviews cancer (2005) 5. 65-72
5. Teicher BA. Antitumor alkylating agents. De Vita VT, Hellman S, Rodenberg SA (editors). Cancer principals and practise of oncology: Lippincott-Raven Publishers (1997) 405-418
6. Blagosklonny M. Analysis of FDA approved anticancer drugs reveals the future of cancer therapy. Cell cycle (2004) 3. 1035-1042
7. Toschi L et al. Role of gemcitabine in cancer therapy. Future oncology (2005) 1. 7-17
9. Pommier, Y Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond. Nature reviews cancer (2006) 6. 789-801
10. Longley DB, Johnston PG. Molecular mechanisms of drug resistance. Journal of pathology (2005) 205. 275-292
11. Morrow. C et al. Drug resistance and cancer. The underlying molecular, cellular and
immunological factors in cancer and aging. Yang, S & Warner, H 387-305 (1993) Plenum press, New York
12.Gottesman M, Fojo T, Bates SE. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. Nature reviews cancer (2002) 2. 48-58
13. Larsson R et al. Chemotherapeutic drug sensitivity testing of human leukemia cells in vitro using a semiautomated fluorometric assay. Leukemia (1990) 4. 567-571
14. Lindhagen E et al. Pharmacological profiling of novel non-cox-inhibiting indole-pyran analogues of etodolac reveals high solid tumour activity of SDX-308 in vitro. Investigating new drugs (2007) 25. 297-303
15. Nygren P et al Detection of tumor-specific cytotoxic drug activity in vitro using the fluorometric microculture cytotoxity assay and primary cultures of tumor cells from patients. International journal of cancer (1994) 56. 715-720
16. Rickardson L et al. Screening of an annoted compound library for drug activity in a resistant myeloma cell line. Cancer chemotherapy and pharmacology (2006) 58. 749-758
18. Fridborg H et al. Relationship between diagnosis-specific drugs in fresh human tumour cells in ex vivo and in the clinic. European journal of cancer of cancer (1999) 35. 424-432
19. Widad HS et al. Enhancement of the solubility and efficacy of poorly water-soluble drugs by hydrophobically-modified polysaccharide derivatives. Pharmaceutical research (2007) 24. 2317-2326
20. Furner RL, Brown RK. L-phenylalanine mustard:the first 25 years. Cancer treatment reports (1980) 64. 559-574
21. Bosanquet AG. Stability of solutions of antineoplastic agents during preparation and storage for in vitro assays: General consideration, the nitrosoureas and alkylating agents. Cancer
Chemotherapy and Pharmacology (1985) 14. 83-95
