Examensarbete, 15 hp
Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2020
Metodutprovning av ELISA
detektion av anti-Porphyromonas gingivalis IgG
Elin Dalstål
Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp
Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson ylva.hedberg.fransson@umu.se
Läraropponent: Birgitta Sundström
Examinator: Mari Norgren
Datum för godkännande: 2020 06 15 Examensarbetets engelska titel
Method Evalutation of ELISA Detection of Anti-Porphyromonas gingivalis IgG
Handledare
Jan Olsson, Institutionen för klinisk mikrobiologi, Umeå Universitet
3
Abstrakt
Alzheimers sjukdom (AS) är den vanligaste formen av demenssjukdom. Orsakerna till AS är inte kända, men genetiska faktorer, livsstilsfaktorer och infektioner ökar risken av AS. Infektion av herpes simplex virus och infektion av Porphyromonas gingivalis är bägge riskfaktorer för att utveckla AS.
Antikroppstester kan användas för att undersöka om infektion av bägge patogener ytterligare ökar risken. För detektion av P. gingivalis IgG antikroppar finns kommersiella enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) kit. Syftet med litteraturstudien var att ta fram en plan för en
metodutprovning som undersöker känsligheten för ett ELISA-kit för detektion anti-P. gigngivalis IgG.
En metodutprovning kan genomföras med tio positiva kontroller, fem negativa prover och tio prover från friska försökspersoner. För fullskaliga epidemiologiska studier med serumprover från biobank hade det varit önskvärt att öka testets känslighet, så mindre mängder provmaterial kan användas.
Visar utprovningen att kittet inte har önskad känslighet skulle andra ELISA-protokoll kunna användas för framtida studier. Konklusionen blir att om metodutprovning genomförs borde den kunna besvara om metodens känslighet kan ökas eller inte.
Nyckelord: Alzheimers sjukdom, ELISA, metodutprovning, Porphyromonas gingivalis, HSV1, IgG
4
Introduktion
Alzheimers sjukdom
Alzheimer sjukdom (AS) är en neurodegenerativ sjukdom. Den drabbar främst äldre och är den vanligaste formen av demenssjukdom (1). I Sverige utgjorde AS för 67% av demens som
diagnostiserades (2). Hos patienter yttrar symtomen sig som kognitiva nedsättningar, minnesförlust och personlighetsförändringar. Andra symtom som ångest och sömnproblem är också vanliga vid AS.
Även vid normalt åldrade försämras minnet, men vid AS börjar minnet försämras tidigare och sker snabbare (3).
Sjukdomen diagnostiseras utifrån kliniska kriterier som till exempel minnesutredning men även med cerebrospinalvätskeprov och positron emission tomography-biomarkörer. Sjukdomen karaktäriseras av förändringar i hjärnan, där kardinaltecknen är förekomst av amylid β plack extracellulärt samt neurofibrillnystan, ansamlingar av tau proteinet som är viktig för hjärnan funktion, o även förlust av hjärnceller (3).
I dagsläget finns det ingen behandling som botar AS eller helt stoppar progressionen av AS, utan de behandlingar som finns syftar till att minska symtomen, bromsa förloppet och höja patientens livskvalitet. Dagens medicinska behandlingar kan till exempel förlänga den tid patienten kan bo hemma och leva ett självständigt liv. Nya mediciner håller på att utvecklas som syftar till att minska bildningen av plack och minska de patologiska förändringar som sker i hjärnan men ingen sådan medicin finns ännu i bruk (1, 4).
Samhällsekonomiska kostnader av Alzheimer sjukdom
Alzheimers sjukdom påverkar inte bara på individnivå utan har också en stor effekt på samhället.
Detta tar sig både i form av ekonomiska kostnader för vård och medicinering, men även i form av ökade omsorgsbehov när sjukdomen leder till funktionsnedsättningar samt i hur sjukdomen påverkar anhöriga. En svensk studie konstaterade att för personer över 75 år ligger demenssjukdomar bakom mer än hälften av de äldres behov av hjälp i form av till exempel hemtjänstpersonal eller personal på omsorgsboende (5).
De behandlingar som finns idag bromsar progressionen av sjukdomen vilket innebär att patienterna med AS lever längre med sjukdomen. Det innebär i sin tur stigande kostnader och en beräknad fortsatt kostnadsökning då patienternas ökade livslängd ger ett längre behov av vård och omsorg. Med en åldrande global befolkning där både absoluta antalet och andelen av befolkningen som är över 65 år ökar så kommer fler att drabbas av AS vilket också medför ökande kostnader (6).
Den främsta kostnadsökningen kommer ske i mellan- och låginkomstländer där den äldre
befolkningen ökar mest. Ökningen av antalet patienter med demenssjukdom kommer vara linjär i höginkomstländer, men exponentiell i medelinkomstländer och låginkomstländer. Fattigare länder vars sjukvårdsystem har mindre ekonomiska resurser kommer i framtiden belastas hårdare än rika länders sjukvårdsystem (7).
5
Riskfaktorer för att utveckla Alzheimers sjukdom
Orsakerna till AS är inte kända men det finns ärftliga faktorer och livsstilsfaktorer som ökar risken för sjukdomen. Studier av tvillingar och familjer har visat på att den genetiska ärftligheten för Alzheimer sjukdom ligger mellan 49% till 79%, så ärftliga faktorer spelare en tydlig roll för risken att utveckla sjukdomen (8). Studier har kartlagt olika gener som ökar risken att drabbas av AS. Bland annat genen som kodar för apolipoprotein E (APOE) vilket är ett fettbindande protein som spelar roll i
fettmetabolismen. Proteinet finns i flera tre varianter ε2, ε3 och ε4, varav ε4 är associerad med en starkt förhöjd risk att drabbas av AS medan ε2 medför en minskad risk att drabbas av AS (9). Det finns även många livsstilsfaktorer som påverkar risken att drabbas av AS. Bland de faktorer som
konstaterats ge en ökad risk för att drabbas av AS finns rökning, fysisk inaktivitet, utbildningsnivå, fetma, diabetes och högt blodtryck (10).
Inflammation och patogener i samband med Alzheimers sjukdom
Forskning har hittat samband mellan AS, tecken på inflammation i hjärnan på patienterna och ett antal patogener. Studier visar att vid Alzheimer sjukdom kan flera tecken på inflammation ses i hjärnan hos patienterna. Inflammatoriska signalvägar i hjärnan är aktiverade och det finns även förhöjda nivåer av andra inflammationsmarkörer som cytokiner, kemokiner och komplement systemet. Genom att behandlas en längre tid med inflammationshämmande läkemedel som NSAID- preparat minskar risken att utveckla AS, vilket tyder på att den antiinflammatoriska behandlingen har en skyddade effekt. Utifrån en hypotes att bakteriella infektioner och virusinfektioner skulle kunna vara en bidragande faktor till att utveckla AS bedrivs forskning som undersöker vilka olika patogener som ökar risken att drabbas av sjukdomen (11). Två patogener där forskningen visat på att det finns samband mellan AS och tidigare infektioner är herpes simplex virus (HSV) och bakterien
Porphyromonas gingivalis.
Herpes simplex virus
HSV är en vanlig human patogen som drabbar mer än hälften av jordens befolkning. Ofta sker
infektionen tidigt i livet genom nära kontakt med föräldrarna under småbarnsåren. Viruset smittar via kroppsvätskor, saliv och sexuellt umgänge. De flesta som drabbas av HSV är asymtomatiska eller har bara milda övergående symtom som feber och lokala blåsor vid primärinfektionen. Viruset kan även ge allvarligare former av infektioner som bland annat hjärnhinneinflammationer, men detta är ovanligt (12).
Viruset delas in i två typer; HSV1 som typiskt yttrar sig som oral herpes och HSV2 som typiskt yttrar sig som genital herpes. Vid serologiska undersökningar ligger prevalensen i Sverige på 79,4 % för HSV1 och 12,9 % för HSV2. Virusen är aktiva under en primärinfektion och går sedan in i en latent fas.
Under den latenta fasen finns det inaktiva viruset i sensoriska nervganglier. Viruset kan återaktiveras och återgå in i aktiv fas, för att sedan bli latent igen. Denna återaktivering kan ske flera gånger under patientens livstid (13). Flera epidemiologiska studier visar att det finns samband mellan att vara HSV1-infekterad och risken att utveckla AS. Patienter positiva för anti‐HSV IgM, vilket tyder på att har
6
viruset återaktiverats, har visat sig ha en nära fördubblad risk för AS jämfört med personer som inte har det. Risken för personer positiva för anti‐HSV IgM hade en 76% risk att utveckla AS jämfört med 3,4% för de som inte var det (14). Även andra studier styrker sambandet (15).
Vissa av de varianter av APOE-genen som är associerade med en förhöjd risk att drabbas av AS har också studerats i samband med HSV1. Patienter med ε4 allelen av APOE-genen och som har höga nivåer av anti‐HSV IgG eller anti‐HSV IgM i serum har en trefaldigt ökad risk för AS, men ingen ökad risk kan ses för personer utan ε4 allelen (8). I de plack som är karakteristiska för AS så finns det HSV1- DNA. Det finns också mer HSV1-DNA ansamlat i placken än på andra ställen i hjärnan. Även i hjärnor från äldre utan demenssjukdom så återfinns HSV1-DNA ansamlat i pack men i lägre grad än hos individer med AS (16).
Porphyromonas gingivalis
P. gingivalis är en gram-negativ bakterie som orsakar parodontit, men bakterien kan även infektera andra delar av kroppen så som hjärtats kranskärl, lever, moderkaka och vagina (4, 17). Cirka 25% av alla människor är koloniserade av bakterien, varav de flesta är asymtomatiska (4).
Mycket av forskningen som berör AS och P. gingivalis har fokuserat på gingipainer, toxiska proteaser som produceras av bakterien. Gingipainer bidrar bland annat till P. gingivalis möjlighet att kolonisera sin värd, inaktivera värdens försvarsmekanismer vilket är viktiga för bakteriens upptag av järn och andra näringsämne och kan orsaka nedbrytning av omliggande vävnad. Dessa proteiner är
cysteinproteaserna lysin-gingipain (Kgp), arginin-gingipain A (RgpA) och arginin-gingipain B (RgpB) och Gingipain-proteaserna har visat sig kunna klyva tau-proteinet, vilket är ett protein som behövs för normal nervaktivitet men ansamlas i tau-nystan inne i hjärncellerna hos patienter med AS. Denna klyvning av tau-proteiner skulle kunna leda till att cellerna försöker kompensera genom att öka produktionen av tau-protein, vilket kan öka antalet tau-tangels (4).
Vid parodontit korrelerar också svårighetsgraden av parodontiten, mätt i djupet hos tandfickorna med graden av ”amyloid load” i områden i hjärnan som är associerade med AS. Områdena som undersöktes är prefrontala hjärnbarken, mellan frontal gyrus, bakre temporalloben, nedre hjässminiloben, och bakre gördelvindlingen (18). Vid djurförsök med möss som genmodifierats för att överuttrycka en mänsklig variant av proteinet amyloid precurser protein ser man att oralinfektion med P. gingivalis leder till kognitiva nedsättningar hos mössen. I mössens hjärnor bildas även plack som liknar de som bildas vid AS. Det innebär att P. gingivalis kan orsaka både symtom och förändringar i hjärnan hos mössen. Vid immunhistokemiska studier av provmaterial från hjärnor hos avlidna donatorer kan man se att mängden av gingipainer korrelerar med proteinmarkörerna tau och ubiquitin som används för att diagnostisera AS. Det fanns inte bara ett samband med mängden utan även lokalisationen av gingipains, tau och ubiquitin (4).
Gingipainer och P. gingivalis kan orsaka apoptos av endotelceller och kan klyva celladhesions molekyler, där klyvningen kan ske både i tandköttet vid parodondit men potentiellt även blod-hjärn- barriärens endotelceller, och därigenom öka genomsläppet över barriären när adhesionmolekyler
7
klyvs (19). Gingipainer har också en protelytisk effekt på APOE proteinet. Gingipainer klyver APOE- deriverade proteinfragment och enligt en hypotes har proteinfragmenten neurotoxiska effekter (20).
Det verkar också troligt att APOE4-genvarianten som är en stark riskfaktor för att utveckla AS kan vara ännu mer känslig för protolysen på grund av högre innehåll av argininrester än de andra varianterna av APOE proteinet (4).
Hypotetiska interaktioner mellan HSV1 och P. gingivalis
Utifrån det som är känt om HSV och P. gingivalis skulle samtidiga infektioner av de båda patogenerna kunna innebära synergiska effekter. Att ha varit infekterad av bägge patogenen skulle ytterligare kunna öka risken att senare drabbas av AS. Interaktioner mellan HSV1 och P. gingivalis skulle kunna ske på många sätt. En hypotetisk möjlighet vore att eftersom infektion av P. gingivalis försvagar blod- hjärn-barriären skulle detta kunna underlätta för en återaktiverad HSV1 infektion att korsa blod- hjärn-barriären och komma in i hjärnan. En annan möjlig synergisk effekt skulle kunna vara att P.
gingivalis proteolytiska effekt på APOE ytterligare förvärrar den risk HSV1 infektion innebär för vissa genvarianter av APOE genen. Eftersom både P. gingivalis och HSV1 är aktiva i munregionen skulle en aktiv P. gingivalis infektion i munhinnan hypotetiskt också kunna påverka infektionsmönstret när HSV1 återaktiverades. P. gingivalis angriper värdens immunförsvar och skadar den omgivande vävnaden, vilket skulle kunna förändra HSV1 infektionsmönster genom att immunförsvaret är försvagat lokalt och systemiskt.
Detektion av P. gingivalis IgG-antikroppar i serum
För att kunna studera om en patient varit infekterad av P. gingivalis kan detektion av anti-P.
gingivalis IgG antikroppar användas. En metod som kan användas för detektion av dessa antikroppar är enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ELISA vid epidemiologiska studier på biobanksprover
För att kunna undersöka om infektion av både HSV1 och P. gingivalis ytterligare accentuerar risken för AS är det möjligt att genomföra en epidemiologisk studie på biobanksprover. Detta ger en
möjlighet att göra jämförelser över tid och se hur antikroppar mot HSV1 och P. gingivalis, korrelerar med risken att drabbas av AS senare i livet. Både enskilt för patogenerna och med båda patogenerna i kombination för att jämföra hur mycket de förändrar risken att drabbas AS. Vid tidigare liknande studier med biobanksprover har biobanken godkänt uttag på 2 µl/forskningsperson. Det bedöms därför troligt att ett uttag på 2 µl serum/forskningsperson skulle kunna beviljas för en studie som undersöker om infektion av både HSV1 och P. gingivalis ytterligare accentuerar risken för AS (21).
Eftersom HSV1 och P. gingivalis infektioner båda höjer risken för att drabbas av AS, är det möjligt att infektionen med patogenerna ytterligare ökar risken för Alzheimer sjukdom. För att genomföra en epidemiologisk studie för antikroppar mot HSV1 och P. gigngivalis behövs en ELISA med tillräcklig känslighet. Syftet med litteraturstudien var att ta fram en plan för en metodutprovning som
undersöker känsligheten för ett ELISA-kit för detektion anti-P. gigngivalis IgG.
8
Material och metoder
Prover
Vid metodutprovning används serum från anonymiserade patientprover från klinisk utvecklingsverksamhet. Materialet omfattar 25 serumprover - tio positiva kontroller från
parodontitpatienter som har en av tandläkare konstaterad infektion av P. gingivalis. Materialet består av fem negativa prover från unga friska patienter med låg sannolikhet för bärarskap av bakterien och tio prover från äldre patienter utan tecken på parodontit. Bland proverna från äldre försökspersoner utan tecken på parodontit kan det finnas negativa, positiva och lågpositiva prover i och med att asymtomatiskt bärarskap av bakterien är vanligt förekommande. Inga ytterligare inklusionskriterier eller exklusionskriterier använde för patientproverna. Det bedöms för metodutprovningen inte relevant att ange patienternas kön, exakt ålder eller tidigare behandlingar.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
ELISA är ett sätt att detektera och kvantifiera specifika antikroppar. En indirekt ELISA innebär att ett antigen binds till ytan av brunnarna i en mikrotiterplatta. Genom att tillföra en lösning med icke reaktiva proteiner, till exempel används casein i form av torrmjölk eller bovint serumalbumin, förhindrar de icke reaktiva proteinerna ospecifika inbindingar. Efter tvätt tillsätt provet. Innehåller provet den primära antikroppen som ska detekteras så binder den primära antikroppen in till antigenet. Tvätta och tillsätt en sekundär antikropp riktad mot den primära antikroppen. Den sekundära antikroppen är märkt med ett in konjungat. Har en primär antikropp bundit in till
antigenet så binder den sekundära antikroppen till den primära antikroppen. I ett sista steg tillsätt ett substrat som processas specifikt av enzymkonjugatet. Oftast medför reaktion av substrat en
färgförändring som kvantitativt kan avläsas i en spektrofotometer. Graden av färgförändring korrelerar med mängden primär antikropp som finns i provet och en kvantifiering kan göras mot en standardkurva (22).
Kommersiellt tillgängligt ELISA Kit
Human Porphyromonas Gingivalis IgG ELISA Kit (MBS3804036, MyBioSource, San Diego, CA, USA) är ett kommersiellt kit för att för att detektera och kvantifiera anti-P. gigngivalis IgG i serum. Kittet ska enligt tillverkarens instruktioner använda en spädning på 1:5, vilket kräver 10 µl serum. För att kittet ska kunna vara lämpligt för studier psom beviljas ett uttag på 2 µl serum från biobank behövs en spädning på 1:50 användas. Om ELISA-kittet kan användas med 1 µl serum är det lämpligt att
användas för fullskaliga epidemiologiska studier på biobanksprover.
Metodutprovning
Metodutprovningen utgår från tillverkarens instruktioner men med variationen att även en spädning på 1:50 används. Samma kontroller analyseras med bägge spädningarna. Förbered genom att späda kittets tvättlösning 1/20 och tillsätt 50 µl standardlösning koncentrationerna 20, 10, 5, 2.5, 1.25, och 0 ng/mL. Enligt tillverkarens instruktioner späd 10 µl serum med 40 µl spädningsvätska (spädning 1:5).
9
Vid metodutprovning späd också 1 µl serum med 49 µl spädningsväska (spädning 1:50). Tillsätt serum och spädningsvätska till brunnarna och i de brunnar som används för att kalibrera blank tillsätt 50 µl spädningslösning. Tillsätt 100 µl horseradish peroxidase konjugat (HRP-konjungat) till brunnarna och inkubera 60 min vid 37°C. Tvätta brunnarna fyra gånger. Tillsätt 50 µl av kromogen lösning A och 50 µl av kromogen lösning B. Blanda lösningarna väl och inkubera 15 min vid 37°C skyddat från ljus.
Efter inkubation tillsätt 50 µl stopplösning och avläs plattonra inom 15 minuter vid 450 nm i spektofotometer för mikrotiterplattor.
Statistik
Associationen mellan abosorbans vid variabel spädning 1:50 och 1:5 analysera med Pearsons korrelation med signifikansnivån 0,01. Analysen sker med lämplig programvara.
Etiska överväganden
Försöket använder avidentifierade humana serumprov som inte går att koppla till individ.
Provmaterialet kommer från kliniskt utvecklingsarbete vid Tandläkarhögskolan i Umeå och medför därför inte någon extra risk för patienter att delta i studien. Projektet är en pilotstudie för att testa användbarhet inför en fullskalig studie som i så fall kräver etiskt godkännande. Inga övriga etiska överväganden bedömts som relevanta.
10
Diskussion
Lämplig uttagsmängd av serum för epidemiologiska studier
Vid forskning på prover från samlingar i biobank måste en ansökan godkännas som anger hur mycket material som får användas till studien. Vid liknade studier har uttag på 2 µl beviljats och därför bedöms det troligt att likande mängder skulle godkännas vid framtida studier (21).
Metodutprovningen skulle kunnat undersöka om det var möjligt att använda 1 µl serum istället för 10 µl serum för att dekretera och kvantifiera anti-P. gigngivalis IgG i serum. Om korrelationen är hög mellan resultatet för det använda ELISA-kittet med 10 µl och 1 µl serum så skulle kittet kunna användas för vidare forskning kring om att ha varit infekterad av både HSV1 och P. gingivalis ytterligare höja risken att drabbas med Alzheimers sjukdom.
Möjliga utfall
Genomförs metodutprovningen skulle utfallen kunna visa om ELISA-kittet har en god känslighet vid serumspädning 1:50 eller om känsligheten är lägre. Skulle korrelationen vara hög mellan att använda spädning 1:5 och serumspädning på 1:50 innebär det att ELISA-kittet kan vara lämpligt vid vidare forskning. Visar sig korrelationen vara låg skulle ett annat ELISA protokoll behöva användas. Skulle signifikans på 0,01 inte uppnås skulle analyser av fler prover behöva ske för att få ett bättre statistiskt underlag kring om kittet kan användas med serumspädning 1:50 eller ej.
Materialets omfattning
Eftersom metodutprovningen är en planerad pilotstudie för att utvärdera ELISA-kittets lämplighet inför framtida forskning så bör materialet ha ett omfång som räcker för att besvara frågeställningen kring testkittets lämplighet men bör samtidigt inte vara allt för stort. Det finns inget egenvärde i att genomföra ett stort antal kontroller. Metodutprövningens material föreslås bestå av tio positiva prover (kontroller) från parodontitpatienter, fem negativa prover från unga friska försökspersoner samt tio prover från forskningspersoner utan symtom där några visar sig vara positiva eller lågpositiva på grund av bärarskap eller tidigare infektion. Denna sammansättning av prover från forskningspersoner har en likande sammansättning, men i mindre skala, som vid utprovningen av ELISA protokoll för större epidemiologiska studier av P. gingivalis infektioner (23).
Om det visar sig att de prover som kom från forskningspersoner utan symtom helt saknar lågpositiva prover kan detta vara en nackdel, då det är önskvärt att även se hur korrelationen såg ut för lågpositiva svar. Vid en högre spädning finns det en ökad risk att lågpositiva svar med mindre mängd antikroppar inte upptäcks. Bärarskap av P. gingivalis är vanligt så 25% av befolkningen är koloniserade av
bakterien. Med tio prover från symtomfria patienter är det statistiskt troligt att i alla fall något av de proverna visar sig vara lågpositivt. Däremot kan avsaknaden av lågpositiva prover inte ha någon påverkan om det visar sig att korrelationen för de positiva och negativa kontrollera är allt för lågt. Om korrelationen är för låg är ELISA-kittet ändå inte lämpligt för vidare forskning om så är fallet (4).
11
Det är också möjligt att någon av de negativa proverna är lågpositiv då det ändå finns en liten risk att även unga friska personer kan vara asymtomatiska bärare. Om något av de negativa proverna visar sig vara positiva kan detta prov då kunna användas för att mäta korrelationen, då det centrala för
undersökningen är om de olika spädningarna ger samma resultat. Om korrelationen för de positiva och negativa proverna är allt för låg så är en frånvaro av lågpositiva prover inte av någon betydelse, då ELISA-kittet ändå inte kan användas för vidare forskning.
Jämförelser med andra studier
I likande studier, som undersökt hur en tidigare infektion P. Gingivalis har påverkat risken att drabbas av andra sjukdomar, har de använt ELISA för att detektera anti-P. Gingivalis IgG, men andra ELISA protokoll har använts. Inga studier har identifierats där human P. gingivalis IgG ELISA Kit från MyBioSource eller något annat kommersiellt tillgängligt ELISA-kit använts. Avsaknaden av studier där ELISA-kittet använts skulle kunna bero på att ELISA-kittet är relativt nytt, eller på att ELISA-kittet valts bort för att det behövs stora serummängder vilket gör det svårt att använda för epidemiologiska studier.
Andra epidemiologiska studier som undersökt om P. gingivalis ökar risken för andra sjukdomar har använt olika ELISA.protokoll för att detektera anti- P. gingivalis IgG Ett ofta använt protokoll är framtaget i Finland 2002, vilket utvecklats för större epidemiologiska studier. Protokollet använder serumspädningarna 1:100, 1:400, 1:1600 och 1:6400 för P. gingivalis, vilket passar för
epidemiologiska studier på prover från biobank. I vissa fall har studier utgått från detta protokoll men med mindre modifikationer som att fixeringen skett med ett annat preparat. Detta protokoll omfattar också bakterien Actinobacillus actinomycetemcomitans, vilket också orsakar parodontit (23-27).
Ett annat ELISA-protokoll som ett flertal studier använt eller använt en variant av är framtaget i en japansk studie 1988. Studier som använde det protokollet använder även de spädningar som skulle passa mängden som skulle kunna godkännas vid uttag från biobank (28-32).
Alternativa metoder
Om ELISA-kittet visar sig inte vara tillförlitligt vid serumspädning 1:50 är det ett alternativ för vidare analyser att använda något av de två ELISA-protokoll som andra studier använt. Att använda något av dessa protokoll kan dock innebära ett omfattande merarbete jämfört med att använda ett färdigt ELISA kitt.
Om en ELISA tas fram enligt det finska protokollet behövs stammar av tre olika serotyper av P.
gingivalis införskaffas och odlas. Stammarna odlas på berikade Brucella agar plattor anaerobiskt i fem till sex dagar, varpå odlingarnas renhet kontrolleras. Odlingarna fixeras över natt och densiteten på lösningen kontrolleras och justeras innan plattornas kopplas med antigenen. Plattorna behöver kvalitetskontrolleras innan de kan användas till forskning (23). Fördelen är att om det finska ELISA- protokollet används är att det använder mycket högre spädningar på proverna. Det innebär att dubbelprover skulle kunde analyseras och att det skulle finnas marginaler att göra om analysen på
12
proverna om något gick fel under processen. Att ha en liten marginal för handhavandefel så att det går att göra om analysen vid behov underlättar för forskningen.
Betydelse av projektet
Främsta värdet av en metodutveckling ligger i att det skapar ett underlag för framtida forskning. Att ha metoden utprovad i en pilotstudie innebär att det framtida forskningsprojektet mer effektivt kan lägga upp planen på forskningen och undvika problem som metoden skulle kunna föra med sig.
Metodutveckling kan få betydelse för effektivitet av framtida studier men även resultat, då valet av metod påverkar både arbetsprocessen och de data som erhålls.
I ett större perspektiv bidrar metodutveckling till möjlighet att skapa en bättre förståelse för AS och orsaken till sjukdomen, hur olika patogener påverkar AS och utveckling av behandlingsmöjlighet, vilket vidgar betydelsen av projektet. AS är en folksjukdom som innebär stora konsekvenser för samhälle och individ och med en åldrade befolkning kommer kostnaderna att öka (5-7).
Det går inte att förutsäga betydelsen en enskild studie kommer att ha, men att forskning bedrivs kring riskfaktorer för att utveckla förståelsen för AS har betydelse. Det hjälper att bygga en förståelse för varför folk drabbas av sjukdomen, vilket i sin tur innebär att det går att hitta sätt att identifiera
personer i riskgrupper och tidigare diagnostisera drabbade. Det skapar också möjligheter att förebygga så att personer inte behöver drabbas av AS och innebär möjligheter att utveckla nya
behandlingsmetoder som ytterligare skulle kunna bromsa eller stoppa sjukdomens förlopp.
En annan möjlighet skulle vara utdelning av nya mediciner för att lindra eller häva symtom eller till och med bota sjukdomen. Tandvårdens roll skulle bli viktigare för förebyggande åtgärder om vidare forskning finner starka samband mellan P. gingivalis och risken att drabbas av AS. Forskning kring hur riskfaktorer för AS samverkar skulle i förlängningen kunna minska mycket mänskligt lidande samt minska samhällets kostnader på grund av sjukdomen.
Etiska aspekter av projektet
Att genomföra en metodutprovning med avidentifierade kontroller för att undersöka om ett ELISA-kit kan användas med en mindre mängd serum väcker i sig själv inga större etiska frågor.
Metodutprovningen är en pilotstudie inför en fullskalig studie som skulle behöva söka etisk godkännande, men utprovningen av ELISA-kittet skulle inte kräva det.
Forskning kring AS, andra demenssjukdomar och tillstånd som innebär kognitiva nedsättningar måste i allmänhet hantera etiska frågeställningar kring samtycke. Både rent praktiska frågor kring hur samtycket ska hanteras men också svårare etiska frågeställningar kring samtycke. Personer med kognitiva nedsättningar har ofta en nedsatt möjlighet att ge eller inte ge informerat samtycke till forskning.
Studier kring äldre personers attityder till att delta i forskningsstudier visar att viljan att delta i forskning oftast är hög både bland äldre utan kognitiva nedsättningar och äldre med mildare kognitiva funktionsnedsättningar. De skulle samtycka till många olika typer av tester och viljan att delta utgår
13
ofta från altruistiska motiv. Många äldre vill också ha möjlighet att lämna skriftliga direktiv kring sin vilja att delta i forskning och/eller utse någon med rätt att ta beslut om deras deltagande i
forskningsstudier om den äldres egen förmåga att fatta beslut är temporärt eller permanent nedsatt (33).
Sedan 2016 har rekommendationer kring medicinsk forskning på människor inkluderat en
rekommendation att människor med kognitiva nedsättningar ska inkluderas i medicinska studier om det inte finns goda skäl att exkludera dem, eftersom om de inte inkluderas i forskning är det lätt att forskningen missar den här gruppens behov (34).
Utifrån detta kan man resonera att personer som en gång gett sitt samtycke till att prover sparas i biobank i förmån för forskning även skulle föredra att dessa prov användes till forskning, även om de drabbats av en demenssjukdom senare i livet. Det är lika viktigt att respektera deras vilja att delta i forskning om de tidigare tagit ett informerat beslut, som att respektera deras vilja att inte vill delta i forskning om de tidigare tagit ett beslut om att de inte vill delta. En epidemiologisk studie på tidigare lagrade biobankade prover kommer inte att utsätta AS patienter för något nytt obehag i form av provtagning, vilket också stärker resonemanget.
Denna litteraturöversikt syftande till att ta fram en plan gällande en metodutprovning om ett ELISA- kit. Litteraturöversikten undersökte om ELISA-kittet för detektion av anti-P. gingivalis IgG kunde användas med 1 µl serum istället för 10 µl serum. Om ELISA-kittet kunde användas med en 1 µl serum skulle kittet kunna användas i en fullskalig studie om infektion av både HSV1 och P. gingivalis
ytterligare ökar risken för AS. Om kittet inte kan användas för detta behöver en annan metod
användas. Litteraturstudien har funnit ELISA-protokoll som liknande studier använt för detektion av anti-P. gingivalis, men användande av dessa protokoll skulle innebära merarbete i jämförelse med att använda kittet men har en mycket högre känslighet.
Konklusionen var att utifrån den framtagna planen skulle det varit troligt att en metodutprovning skulle kunna besvara om ELISA-kittet går att använda med serumspädningen 1:50 eller inte.
14
Referenser
1. Weller J, Budson A. Current understanding of Alzheimer's disease diagnosis and treatment.
F1000Res. 2018;7. DOI: 10.12688/f1000research.14506.1
2. Svenska demensregistret. Svenska Demensregistret Årsrapport 2018.
https://www.ucr.uu.se/svedem/om-svedem/arsrapporter/svedem- arsrapport2018/viewdocument/967 (2020-06-03)
3. Ou YN, Zhu JX, Hou XH, Shen XN, Xu W, Dong Q, et al. Associations of infectious agents with Alzheimer's disease: A systematic review and meta-analysis. J Alzheimers Dis.
2020;75(1):299-309
4. Dominy SS, Lynch C, Ermini F, Benedyk M, Marczyk A, Konradi A, et al. in Alzheimer's disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors.
Sci Adv. 2019;5(1):eaau3333. DOI:10.1126/sciadv.aau3333
5. Agüero-Torres H, Fratiglioni L, Guo Z, Viitanen M, von Strauss E, Winblad B. Dementia is the major cause of functional dependence in the elderly: 3-year follow-up data from a population- based study. Am J Public Health. 1998;88(10):1452-1456.
6. Cimler R, Maresova P, Kuhnova J, Kuca K. Predictions of Alzheimer's disease treatment and care costs in European countries. PLoS One. 2019;14(1):e0210958. DOI:
10.1371/journal.pone.0210958
7. Banerjee S. The macroeconomics of dementia--will the world economy get Alzheimer's disease? Arch Med Res. 2012;43(8):705-709.
8. Wilson RS, Barral S, Lee JH, Leurgans SE, Foroud TM, Sweet RA, et al. Heritability of different forms of memory in the late onset Alzheimer’s disease family study. J Alzheimers Dis. 2011;23(2):249-255.
9. Linard M, Letenneur L, Garrigue I, Doize A, Dartigues JF, Helmer C. Interaction between APOE4 and herpes simplex virus type 1 in Alzheimer's disease. Alzheimers Dement.
2020;16(1):200-208.
10. Norton S, Matthews FE, Barnes DE, Yaffe K, Brayne C. Potential for primary prevention of Alzheimer's disease: an analysis of population-based data. Lancet Neurol. 2014;13(8):788-794.
11. Wyss-Coray T, Rogers J. Inflammation in Alzheimer disease-a brief review of the basic science and clinical literature. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012;2(1):a006346. DOI:
10.1101/cshperspect.a006346
12. Usatine RP, Tinitigan R. Nongenital herpes simplex virus. Am Fam Physician.
2010;82(9):1075-1082.
13. Olsson J, Kok E, Adolfsson R, Lövheim H, Elgh F. Herpes virus seroepidemiology in the adult Swedish population. Immun Ageing. 142017. DOI: 10.1186/s12979-017-0093-4
14. Lovheim H, Gilthorpe J, Adolfsson R, Nilsson LG, Elgh F. Reactivated herpes simplex infection increases the risk of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2015;11(6):593-599.
15. Letenneur L, Pérès K, Fleury H, Garrigue I, Barberger-Gateau P, Helmer C, et al.
Seropositivity to herpes simplex virus antibodies and risk of Alzheimer's disease: A population-based cohort study. PLoS One. 32008. DOI: 10.1371/journal.pone.0003637
15
16. Wozniak MA, Mee AP, Itzhaki RF. Herpes simplex virus type 1 DNA is located within Alzheimer's disease amyloid plaques. J Pathol. 2009;217(1):131-138.
17. Cassini MA, Pilloni A, Condo SG, Vitali LA, Pasquantonio G, Cerroni L. Periodontal bacteria in the genital tract: are they related to adverse pregnancy outcome? Int J Immunopathol
Pharmacol. 2013;26(4):931-939.
18. Kamer AR, Pirraglia E, Tsui W, Rusinek H, Vallabhajosula S, Mosconi L, et al. Periodontal disease associates with higher brain amyloid load in normal elderly. Neurobiol Aging.
2015;36(2):627-633.
19. Sheets SM, Potempa J, Travis J, Casiano CA, Fletcher HM. Gingipains from Porphyromonas gingivalis W83 induce cell adhesion molecule cleavage and apoptosis in endothelial cells.
Infect Immun. 732005. p. 1543-1552.
20. Lönn J, Ljunggren S, Klarström‐Engström K, Demirel I, Bengtsson T, Karlsson H. Lipoprotein modifications by gingipains of Porphyromonas gingivalis. J Periodontal Res. 532018. p. 403- 213.
21. Lin AV. Indirect ELISA. Methods Mol Biol. 2015;1318:51-59.
22. Lövheim H, Olsson J, Weidung B, Johansson A, Eriksson S, Hallmans G, et al. Interaction between cytomegalovirus and herpes simplex virus type 1 associated with the risk of Alzheimer's disease development. J Alzheimers Dis. 2018;61(3):939-345.
23. Pussinen PJ, Vilkuna-Rautiainen T, Alfthan G, Mattila K, Asikainen S. Multiserotype enzyme- linked immunosorbent assay as a diagnostic aid for reriodontitis in large-scale studies. J Clin Microbiol. 402002. p. 512-518.
24. Damgaard C, Reinholdt J, Enevold C, Fiehn NE, Nielsen CH, Holmstrup P. Immunoglobulin G antibodies against Porphyromonas gingivalis or Aggregatibacter actinomycetemcomitans in cardiovascular disease and periodontitis. J Oral Microbiol. 92017. DOI:
10.1080/20002297.2017.1374154
25. Paju S, Oittinen J, Haapala H, Asikainen S, Paavonen J, Pussinen PJ. Porphyromonas gingivalis may interfere with conception in women. J Oral Microbiol. 92017. DOI:
10.1080/20002297.2017.1330644
26. Cotič J, Ferran M, Karišik J, Jerin A, Pussinen PJ, Nemec A, et al. Oral health and systemic inflammatory, cardiac and nitroxid biomarkers in hemodialysis patients. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 222017. p. e432-9. DOI: 10.4317/medoral.21629
27. Ueno M, Izumi Y, Kawaguchi Y, Ikeda A, Iso H, Inoue M, et al. Prediagnostic plasma antibody levels to periodontopathic bacteria and risk of coronary heart disease. Int Heart J.
2012;53(4):209-214.
28. Murayama Y, Nagai A, Okamura K, Kurihara H, Nomura Y, Kokeguchi S, et al. Serum immunoglobulin G antibody to periodontal bacteria. Adv Dent Res. 1988;2(2):339-345.
29. Kakuta E, Nomura Y, Morozumi T, Nakagawa T, Nakamura T, Noguchi K, et al. Assessing the progression of chronic periodontitis using subgingival pathogen levels: a 24-month
prospective multicenter cohort study. BMC Oral Health. 172017. DOI: 10.1186/s12903-017- 0337-x
16
30. Furuta M, Shimazaki Y, Tanaka S, Takeuchi K, Shibata Y, Takeshita T, et al. Gender-specific associations of serum antibody to Porphyromonas gingivalis and inflammatory markers.
Biomed Res Int. 2015;2015. DOI: 10.1155/2015/897971
31. Kudo C, Naruishi K, Maeda H, Abiko Y, Hino T, Iwata M, et al. Assessment of the plasma/serum IgG test to screen for periodontitis. J Dent Res. 2012;91(12):1190-1195.
32. Takahashi T, Muro S, Tanabe N, Terada K, Kiyokawa H, Sato S, et al. Relationship between periodontitis-related antibody and frequent exacerbations in chronic obstructive pulmonary disease. PLoS One. 72012. DOI:10.1371/journal.pone.0040570
33. Ries N, Mansfield E, Sanson-Fisher R. Planning ahead for dementia research participation:
insights from a survey of older australians and implications for ethics, Law and Practice. J Bioeth Inq. 2019;16(3):415-429.
34. Council for International Organizations of Medical Sciences. (2016) International ethical guidelines for health-related research involving humans, fourth edition. Geneva.
