Detektion av anti-TNF-α-hämmare
Av Josef Tilahun
Ht. 2020
Fördjupningsprojekt i analytisk kemi 15 hp Institutionen för Läkemedels kemi
Innehållsförteckning
Abstrakt ____________________________________________________________________ 3 Inledning/Bakgrund ___________________________________________________________ 4 Syfte____ ___________________________________________________________________ 5
Abstrakt
Inledning/Bakgrund
Idag lider patienter av immunologiska sjukdomar så som Chrons sjukdom CD, reumatoid artrit (RA), inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) eller andra inflammatoriska hudsjukdomar. Dessa patienter har ökad halt av den pro-inflammatoriska cytokinen Tumörnekrosfaktor (TNF-α). TNF-α molekylen är 55 kDA stor och 157 aminosyralång. Denna cytokin produceras samt utsöndras från aktiva makrofager och T-celler och har påvisat erhålla en huvudsaklig roll vid inflammatoriska och immunologiska processer [1– 4]. TNF-α initierar en inflammatorisk kaskad genom att binda till membranbundna receptorer på makrofager samt T-celler som medför en ökad TNF- α utsöndring. Ökad TNF- α halt bidrar till en ökad signalering hos T-celler och makrofager som i sin tur leder till en ökad inflammation. Det har även observerats att denna inflammatoriska process kommer att öka produktionen av brosknedbrytande enzymer och därefter sker demineralisering av ben [1,2].
På grund av αs karaktär i initieringen av inflammatoriska processer kan olika TNF-α-hämmare (TH) t.ex. Etanercept, Infliximab och Adalimumab vara potentiella läkemedel för patienter som lider av inflammatoriska sjukdomar [1]. Farmakokinetiken för de olika TH’s kan skilja sig åt vilket leder till att indikationen kan variera mellan de inflammatoriska sjukdomarna. Det som TH’s har gemensamt är att de kan förhindra men även hämma TNF-α från att binda alternativt verka på sitt målprotein [1].
Tabell 1. Tabellen beskriver olika TNF-α-hämmares aktiva substanser som används vid behandling av inflammatoriska sjukdomar samt dess verkningsmekanism och målprotein. [5].
Substans Målprotein Verkningsmekanism
Adalimumab TNF-α Binder till specifikt till TNF-α och hämmar dess
funktion. Infliximab TNF-α Binder till specifikt till
Etanercept TNF-α-receptorer Kompetitiv hämning av membranbundna TNF-α-receptorer.
Trots behandlingar med TH mot dessa sjukdomar har det observerat att över 30 % av alla som långtidsbehandlats med TH har fått reducerad farmakologisk effekt [6–8]. Detta kan förklaras med att kroppen producerar humana antikroppar som binder specifikt till olika TH och hämmar dess funktion. Dessa antikroppar benämnas som anti-drug antibody (ADA) [6,7,9]. ADA framstår som väldigt problematiska för patienter som behandlas med dessa läkemedel vilket kan leda till att den farmakologiska effekten inte uppnås [10]. Bieffekterna av för mycket cirkulerande ADA i kroppen kommer att förvärra sjukdomstillståndet och i vissa fall har observationer påvisat att patienterna är mer benägna att utveckla akut anafylaktisk chock [11]. Med avseende på bieffekterna är det viktigt att kunna snabbt detektera ADA i låga koncentrationer vilket i sin tur ökar en metods känslighet. Detta medför ett potentiellt utbyte av läkemedel tidigt i sjukdomsförloppet innan sjukdomstillståndet förvärras [11].
Syfte
____
Metod och datainsamling
Under arbetets gång utfördes det en systematisk litteraturöversikts studie för att kunna besvara syftet. Det utfördes sökningar från databasen Pubmed med specifika sökord för att erhålla relevanta artiklar. Artiklarna bearbetades sedan mha urval 1, urval 2 och urval 3. I urval 1 selekterades relevanta artiklar med relevanta rubriker. I urval 2 bortfiltrerades de artiklar vars abstrakter inte studerades vidare. I urval 3 presenteras de artiklarna som lästes fullt ut och selekterades för att besvara arbetets syfte. Inklusions- & exklusionskriterierna för arbetet är att det skall vara originalartiklar från Pubmed som är skrivna på engelska.
Tabell 2. Tabellen presenterar vilken databas och sökord som användes för arbetet. * Ger en bredare sökning i databasen och tar med alla potentiella artiklar som är relaterade till sökordet.
Databas Sök# Sökord Träffar Urval 1 Urval 2 Urval 3
Pubmed 1 Anti-TNF* AND detection AND ADA 36 15 8 5
2 Homogenous mobility shift assay AND Anti-TNF
10 8 4 2
3 Anti-TNF* AND surface plasmon resonance
14 6 3 2
4 Adalimumab AND surface plasmon resonance AND therapeutic drug monitoring
3 3 1 1
5 Antibody detection AND anti-drug antibodies AND anti-TNF therapy
24 4 2 1
6 Surface plasmon resonance AND ADA 21 10 6 3
7 Antibody* assay AND bridging ELISA* AND Therapeutic proteins
54 8 4 1
8 Infliximab AND Anti-drug antibody AND Mobility shift assay AND Inflammatory bowel disease
Resultat
För att kunna detektera humana antikroppar finns det flertals olika immunologiska metoder som används idag. Dessa metoder har olika för- och nackdelar och det blir därför viktigt att välja noggrant den mest gynsamma detektionsmetoden som kommer få fram önskade resultat som besvarar studiens syfte.
Detta arbete lyfter fram tre metoder som kan sensitivt detektera ADA i humana serumprover. Dessa metoder benämns som bridging Enzyme-linked immunosorbent assay (bELISA), homogenous mobility shift assay (HMSA) och surface plasmon resonance (SPR).
bELISA
.
Det finns olika typer av ELISA och dessa metoder har kapaciteten att detektera antikroppar i humana prover. I denna studie uppmärksammas bridging ELISA. Principen med bridging ELISA är att fånga in den önskade antikroppen mellan en immobiliserad ligand och en sekundär märkt-antikropp som tillsätts i ett senare steg för att bilda ett antikroppskomplex [12]. Den önskade antikroppen är en så kallad ADA. Antikroppen som är bunden till plattan och kommer att ta emot ADA och vara den nedre delen av komplexet medan den sekundära antikroppen ”stänger in” ADA och motsvarar de övre delen av komplex, se Figur 1. Detektionen kommer att genomföras indirekt som resultat av att den sekundära antikroppen kommer vara synlig vid detektionen mha spektrofotometer. Den märkta antikroppen kommer vara proportionerlig med mängden ADA och kan därmed användas för att mäta andelen ADA i prover.
För att skapa detta antikroppskomplex måste ett protokoll med många steg följas vilket är tidskrävande. Detta protokoll beskrivs utförligt av bland annat Patton m. fl., 2005 [13]. Det första steget i protokollet är att immobilisera TH till mikrotiterplattan i alla 96 brunnarna genom att först späda TH halten i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Därefter tillsätts detta till brunnarna och inkuberas i 37 °C i en timme så att TH bildar spontana kovalenta bindningar med plattan. Därefter skall PBS avlägsnas och blockerande-spädningsmedlet tillsättas. Brunnarna täcks därefter med en plåtförslutning under 2–8 °C i minst 12 timmar. Efter detta ska serum- och referensproverna förberedas genom att spädas ut med ättiksyra och inkuberas i en timme i rumstemperatur (RT). Detta utförs så att eventuella immunkomplex dissocierar. Därefter ska biotinylerade antiget spädas ut i ett spädningsmedel och det blockerande-spädningsmedlet avlägsnas. Till mikrotiterplattans brunnar tillsätts det behandlade biotinylerade antigenet. Därefter förbereds och tillsätts 1 M TRIS-buffert med pH 9,5 och det syrabehandlade serumet i varje brunn. Mikrotiterplattan försluts och skakas försiktigt på ett skakbord i 1–5 minuter och får sedan vila i RT i 3,5 timmar så att ADA kan interagera med TH. Under tiden förberedes spädningsmedlet i form av utspädd pepparrotsperoxidas (HRP). HPR kommer att användas som ett spårningsmedel vid detektionssteget. Förslutningen avlägsnas och plattan tvättas tre gånger med en bufferttvätt och torkas av försiktigt med en pappershandduk. HPR-spädningsmedlet tillsätts därefter i varje brunn och får vila i RT i 20 min. En tablett av O-fenylendiamin tablett (OPD) löses upp i PBS utspätt med vatten. Plattan tvättas ytterligare tre gånger med buffert och OPD-lösningen tillsätts till alla 96 brunnar. Plattan får därefter vila i RT i 30 min. Slutligen tillsätts svavelsyra för att avbryta eventuella reaktioner. Mikrotiterplattan detekteras sedan mha spektrofotometer med absorbansen inställd på 490 nanometer (nm).
som kunde detekteras i 4 av 50 serumsprover. Resultatet av SPR metodens detektion beskrivs nedan samt metodens tillvägagångsätt. Det finns även andra befintliga studier som har använt sig utav bELISA för att detektera ADA hos patienter som behandlas med TH [7,9,10,15].
SPR
.
Principen för SPR är att mäta interaktionen mellan två molekyler som t.ex. en ligand och en analyt i realtid. Liganden kommer vara bunden till den fasta fasen (sensorytan) medan analyten befinner sig i den mobila fasen och kommer att flöda förbi senorytan för att vidare interagera med immobiliserade liganden. När en interaktion sker mellan dessa två molekyler kommer sensorytan att kunna detektera det. Det finns flertal variabler som är detekterbara vid denna metod såsom analytens bindningsförmåga till liganden, dess specificitet, affinitet, kinetik och koncentration. I detta avsnitt ligger fokuset på koncentrationen.
inkuberas i RT i 15 minuter. En total utspädning kan därefter genomföras genom tillsatts av PBS. Den konstanta bufferten som kontinuerligt flödade genom SPR-instrumentet bestod av Tween 20 samt NaCl. De utspädda serumproverna som innehöll ADA injicerades i injektionskanalerna och flödade över de immobiliserade TH med hastigheten 30 µL/min i 3 min för att bilda interaktioner. Interaktionerna uppmättes under 7–11 minuter i 25 °C.
Figur 2. Figuren presenterar en schematisk bild av sensorytan och injektionskanalerna. På sensorytan kan ligander immobiliseras och roteras 90°. Detta sker för att alla sex injektionskanalerna under ska kunna passera alla immobiliserade ligander.
I samma studie som beskrevs ovan av Real-Fernández m.fl., 2019 så observerades det att SPR kunde detektera ADA i 6 av 50 humana serumprover. SPR metoden har även applicerats i ett flertal studier för att detektera ADA i humana serumprover [17–19].
HMSA
Figur 3, Figuren representerar de modifierade IFX-488 och olika former av ADA som tillsammans inkuberas för möjligheten att bilda antikroppskomplex. Därefter kommer antikroppskomplexet att genomgå storleksseparation mha HPLC. [6].
HMSA metoden har använts av flera forskare såsom Kang m. fl., 2018 och Moses m.fl., 2019 [21,22] för att detektera ADA. Moses m.fl., 2019 konstruerade en studie med 75 patienter som diagnostiserats med antingen IBD, CD eller ulcerös kolit och behandlades med TH. Syftet med studien var att undersöka hur lång tid det tar för kroppen att producera ADA. ADA uppmättes i patienters serumprover och det visade att 11 av 75 patienter producerade ADA. Det observerades även att det kan dröja 13.2 ± 7.3 månader för att kunna detektera ADA i humana serumprover.
Diskussion
Under detta arbete jämfördes olika detektionsmetoder för att mäta ADA i humana serumprover med avseende på tid och känslighet. Alla ovannämnda detektionsmetoder har kapaciteten att mäta ADA i serum men dessa metoder har olika för- och nackdelar som kan vara avgörande beroende på vart och när detektionen kan vara till nytta.
alternativ metod kallad HMSA introducerats som ersättning för bELISA [20].
HMSA och bELISA har vissa gemensamma nämnare såsom att bägge metoderna detekterar en märkt antikropp som bundit till ADA [16]. Likt bELISA har HMSA ett syra-disscoationssteg för att separera eventuella komplex och genom detta underlätta detektionen med HPLC [6,16]. En fördel med HMSA metoden är att risken för avlägsnandet av ADA innan detektion minskar då metoden saknar upprepade tvättningssteg jämfört med bELISA [6]. Denna metod är mindre tidskrävande att genomföra då inkubationstiden är endast två timmar jämfört med bELISA’s inkubationstid på 16,5 timmar [6].
Från ett tidsperspektiv är SPR överlägset snabbast då analysen tog endast 19 minuter totalt att genomföra [16]. SPR proceduren behöver däremot inte bilda ett antikroppskomplex med en märkt antikropp för att detektera ADA i serum. Detta medför att inga långa inkubationstider behövs jämförelsevis med HMSA och bELISA [16]. En annan utmärkelse med SPR metoden är möjligheten att detektera ADA med låg affinitet hos patienter som behandlas med TH. Detta observerades i studien som Real-Fernández m.fl., 2019 utförde där SPR hade en kapacitet att upptäcka ADA i 12% av populationen medan bELISA hade kapaciteten att upptäcka ADA i 10% av samma population. Detta kan förklaras av att SPR inte har tvättningsstegen som bELISA och HMSA har och därmed minimeras risken för avlägsnandet av ADA med låg affinitet till TH innan detektion [12,16,18]. Den portabla sensorytan som används vid SPR är kostsam och skulle kunna betraktas som en nackdel då tillgängligheten för den minskar [19].
Slutsats
Populärvetenskaplig sammanfattning
Referenslista
[1] K. Lis, O. Kuzawińska, E. Bałkowiec-Iskra, State of the art paper Tumor necrosis factor inhibitors – state of knowledge, Aoms. 6 (2014) 1175–1185.
https://doi.org/10.5114/aoms.2014.47827.
[2] T.S. Pui, P. Kongsuphol, S.K. Arya, T. Bansal, Detection of tumor necrosis factor (TNF-α) in cell culture medium with label free electrochemical impedance spectroscopy, Sensors and Actuators B: Chemical. 181 (2013) 494–500. https://doi.org/10.1016/j.snb.2013.02.019.
[3] J. Martinez-Perdiguero, A. Retolaza, L. Bujanda, S. Merino, Surface plasmon resonance immunoassay for the detection of the TNFα biomarker in human serum, Talanta. 119 (2014) 492–497. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2013.11.063. [4] S.K. Arya, P. Estrela, Electrochemical ELISA Protein Biosensing in Undiluted Serum Using a Polypyrrole-Based Platform, Sensors. 20 (2020) 2857. https://doi.org/10.3390/s20102857.
[5] FASS Vårdpersonal - Startsida, (n.d.).
https://www.fass.se/LIF/startpage?userType=0 (accessed October 19, 2020).
[6] S.-L. Wang, L. Ohrmund, S. Hauenstein, J. Salbato, R. Reddy, P. Monk, S. Lockton, N. Ling, S. Singh, Development and validation of a homogeneous mobility shift assay for the measurement of infliximab and antibodies-to-infliximab levels in patient serum, Journal of Immunological Methods. 382 (2012) 177–188.
https://doi.org/10.1016/j.jim.2012.06.002.
[7] K. Herszényi, H. Jókai, F. Rencz, V. Brodszky, E. Nagy, P. Holló, Antidrug antibody formation during tumor necrosis factor α inhibitor treatment of severe psoriatic patients in the real-life practice, Pdia. 36 (2019) 589–594.
https://doi.org/10.5114/ada.2019.89507.
[8] L. Boysen, A.M.E. Sprinkel, B. Lauritzen, J. Breinholt, J. Lykkesfeldt, B.M. Viuff, L.H. Landsy, Generic immune complex assay for detection of murine anti-drug-antibodies in complex with human IgG, Biologicals. 60 (2019) 42–48.
with random drug levels, Rheumatology. 55 (2016) 2050–2055. https://doi.org/10.1093/rheumatology/kew299.
[10] B. Marinari, E. Botti, M. Bavetta, G. Spallone, A. Zangrilli, M. Talamonti, A. Richetta, S. Chimenti, A. Costanzo, Detection of Adalimumab and
Anti-Adalimumab Levels by ELISA: Clinical Considerations: Assay for Anti-Adalimumab and Anti-Drug Antibodies, Drug Dev. Res. 75 (2014) S11–S14.
https://doi.org/10.1002/ddr.21186.
[11] E. Cozzani, M. Burlando, A. Parodi, Detection of antibodies to anti-TNF agents in psoriatic patients: A preliminary study, Giornale Italiano Di Dermatologia e Venereologia : Organo Ufficiale, Società Italiana Di Dermatologia e Sifilografia. 148 (2013) 171–4.
[12] J. Pan, T. Small, D. Qin, S. Li, L. Wang, D. Chen, C. Pauley, T. Verch, C. Kaplanski, R. Bakhtiar, Y.R. Vallejo, R. Yin, Comparison of the NIDS® rapid assay with ELISA methods in immunogenicity testing of two biotherapeutics, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (2011) 150–159.
https://doi.org/10.1016/j.vascn.2010.09.003.
[13] A. Patton, M.C. Mullenix, S.J. Swanson, E. Koren, An acid dissociation bridging ELISA for detection of antibodies directed against therapeutic proteins in the presence of antigen, Journal of Immunological Methods. (2005) 7.
[14] F. Real-Fernández, F. Pregnolato, R. Cimaz, A.M. Papini, M.O. Borghi, P.L. Meroni, P. Rovero, Detection of anti-adalimumab antibodies in a RA responsive cohort of patients using three different techniques, Analytical Biochemistry. 566 (2019) 133–138. https://doi.org/10.1016/j.ab.2018.11.018.
[15] F. Siljehult, L. Ärlestig, C. Eriksson, S. Rantapää-Dahlqvist,
Concentrations of infliximab and anti-drug antibodies in relation to clinical response in patients with rheumatoid arthritis, Scandinavian Journal of Rheumatology. 47 (2018) 345–350. https://doi.org/10.1080/03009742.2018.1433232.
[16] M. Beeg, A. Nobili, B. Orsini, F. Rogai, D. Gilardi, G. Fiorino, S. Danese, M. Salmona, S. Garattini, M. Gobbi, A Surface Plasmon Resonance-based assay to measure serum concentrations of therapeutic antibodies and anti-drug antibodies, Sci Rep. 9 (2019) 2064. https://doi.org/10.1038/s41598-018-37950-4.
anti-adalimumab antibody identification and kinetic characterization, Anal Bioanal Chem. 407 (2015) 7477–7485. https://doi.org/10.1007/s00216-015-8915-8.
[18] M. Liang, S.L. Klakamp, C. Funelas, H. Lu, B. Lam, C. Herl, A. Umble, A.W. Drake, M. Pak, N. Ageyeva, R. Pasumarthi, L.K. Roskos, Detection of High- and Low-Affinity Antibodies Against a Human Monoclonal Antibody Using Various Technology Platforms, ASSAY and Drug Development Technologies. 5 (2007) 655– 662. https://doi.org/10.1089/adt.2007.089.
[19] H. Shibata, K. Nishimura, C. Miyama, M. Tada, T. Suzuki, Y. Saito, A. Ishii-Watabe, Comparison of different immunoassay methods to detect human anti-drug antibody using the WHO erythropoietin antibody reference panel for analytes, Journal of Immunological Methods. 452 (2018) 73–77.
https://doi.org/10.1016/j.jim.2017.09.009.
[20] K. Bendtzen, Immunogenicity of Anti-TNF-α Biotherapies: II. Clinical Relevance of Methods Used for Anti-Drug Antibody Detection, Front. Immunol. 6 (2015). https://doi.org/10.3389/fimmu.2015.00109.
[21] J. Moses, K. Lambert-Jenkins, H. Momotaz, A. Sattar, S.M. Debanne, J. Splawski, T.J. Sferra, Time to antibody detection and associated factors for presence of drug antibodies in pediatric inflammatory bowel disease patients treated with anti-TNF therapy, 31 (2019) 6.
