Institutionen för naturvetenskap
Examensarbete
Nathalie Carlsson
Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå
Nr: 2011: BL3
Metodjämförelse mellan Hemocue WBC Diff, Advia 2120 och manuell mikroskopi avseende
differentialräkning av leukocyter
Metodjämförelse mellan Hemocue WBC Diff, Advia 2120 och manuell mikroskopi avseende differentialräkning av leukocyter
Nathalie Carlsson
Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen
Extern handledare:
Med Dr, PhD, Ingvar Rydén Länsenheten för Klinisk kemi Kalmar länssjukhus
SE-391 85 Kalmar Intern handledare:
Dr Med vet, Leg. Biomedicinsk analytiker,
Susanne Widell Institutionen för
naturvetenskap Linnéuniversitetet SE-391 82 Kalmar Examinator:
Dr Med vet, Maria Mattsson Institutionen för naturvetenskap Linnéuniversitetet SE-391 82 Kalmar
Examensarbetet ingår i biomedicinska analytikerprogrammet, 180 högskolepoäng SAMMANFATTNING
Patientnära instrument kan i vissa vårdsituationer ge snabba analysresultat på ett kostnadseffektivt sätt. En viktig patientnära analys är differentialräkning av leukocyter, som visar fördelning och utmognad av dessa blodceller. Störningar i bildningen av leukocyter sker vid infektioner och hematologiska sjukdomar.
Med manuell mikroskopi räknas leukocyter i ett blodutstryk färgat med May-Grünwald Giemsa. En kvantitativ och kvalitativ bedömning utförs av alla blodceller.
Advia 2120 utför differentialräkning av leukocyter genom cytokemiska reaktioner och ljusspridning i olika vinklar vid belysning av celler. Celler identifieras baserat på kärnkonfiguration, granulering och cellstorlek.
Hemocue White Blood Cell (WBC) Diff har en charged coupled device (CCD) kamera som scannar celler i en mikrokyvett. Genom beräkning av optisk densitet från pixlars gråskalor och jämförelse med referensceller identifieras celler.
Syftet med studien var att jämföra analysresultat gällande differentialräkning av leukocyter i venöst blod mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 samt i kapillärt blod mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi. Provmaterialet bestod av 62 venösa prover från patienter och 20 kapillära prover från friska vuxna personer.
Resultatet vid jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 visade en korrelation på 0,99 vid beräkning av totala antalet leukocyter, neutrofila granulocyter och lymfocyter. En större spridning av resultat sågs vid beräkning av monocyter, eosinofila- och basofila granulocyter. Resultatet vid jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi visade en korrelation på 0,95 för neutrofila granulocyter och 0,84 för lymfocyter. För de andra celltyperna var korrelationen dålig.
Hemocue WBC Diff fungerar bra vid beräkning av leukocyter på friska personer. Instrumentet är dock under utveckling och förbättringar på vissa parametrar kan behövas.
ABSTRACT
Point of care instruments can provide faster testresults in a cost-effective manner. An important test in primary care is the differential leukocyte count, showing
distribution and maturation of these blood cells. Disruption of the formation of leukocytes occurs in infections and hematologic diseases.
With manual microscopy the leukocytes are counted in a blood smear stained with May-Grünwald Giemsa. A quantitative and a qualitative assessment of all blood cells is performed.
Advia 2120 perform the differential leukocyte count by cytochemical reactions and lightscatter at different angles when illumination of cells. Cells are identified based on the configuration of the nucleas, granulation and the size of the cell.
Hemocue White Blood Cell (WBC) Diff has a charged coupled device (CCD) camera that scans the cells in a microcyvette. By calculating the optical density from the gray values of pixels and comparison with reference cells the cell types can be identified.
The aim of the study was to compare the results of the differential leukocyte count in venous blood between Hemocue WBC Diff and Advia 2120, and in capillary blood between Hemocue WBC Diff and manual microscopy. The test material consisted of 62 venous samples from patients and 20 capillary samples from healthy adults.
The results of the comparison between Hemocue WBC Diff and Advia 2120 showed a correlation of 0,99 in calculating the the total number of leukocytes,
neutrophils and lymphocytes. A distribution of results was seen in the calculations of monocytes, eosinophils and basophils. The results of the comparison between Hemocue WBC Diff and manual microscopy showed a correlation of 0,95 for neutrophils and 0,84 for lymphocytes. For the other celltypes the correlation was poor.
Hemocue WBC Diff works well for the calculation of leukocytes in healthy people.
The instrument is under development and improvements in certain parameters may be needed.
Innehållsförteckning
1. INTRODUKTION ... 2
1.1 Patientnära analysverksamhet ... 2
1.2 Leukocyters bildning och roll i kroppen... 2
1.3 Cytokemisk färgning vid manuell bedömning av blod- och benmärgsceller ... 4
1.4 Leukocytopoesens morfologi i MGG-färgning... 5
1.4.1 Granulocytopoesen ... 5
1.4.2 Monocytopoesen ... 7
1.4.3 Lymfocytopoesen ... 7
1.5 Störningar i leukocytopoesen... 8
1.5.1 Infektiösa tillstånd ... 8
1.5.2 Leukemi ... 9
1.5.3 Myelodysplastiska syndrom ... 10
1.5.4 Maligna lymfom ... 10
1.6 Manuell differentialräkning av leukocyter ... 11
1.7 Maskinell differentialräkning av leukocyter ... 13
1.7.1 Allmänt om automatiska cellräknare ... 13
1.7.2 Advia 2120 ... 15
1.7.3 Hemocue WBC Diff ... 18
1.8 Syfte ... 20
2. MATERIAL OCH METODER ... 20
2.1 Provmaterial ... 20
2.1.1 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 ... 20
2.1.2 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi . 21 2.2 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 ... 21
2.2.1 Analys med Hemocue WBC Diff ... 21
2.2.2 Analys med Advia 2120 ... 21
2.2.3 Manuell kontroll av prover efter larm från Hemocue WBC Diff ... 22
2.2.4 Kvalitetssäkring ... 23
2.2.5 Statistiska analyser ... 24
2.3 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi ... 25
2.3.1 Provtagning ... 25
2.3.2 Analys med Hemocue WBC Diff ... 25
2.3.3 Framställning av preparat för manuell differentialräkning av leukocyter ... 25
2.3.4 Differentialräkning av leukocyter med manuell mikroskopi ... 26
2.3.5 Statistiska analyser ... 26
3. RESULTAT ... 26
3.1 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 ... 26
3.2 Inomserieprecision på Hemocue WBC Diff ... 33
3.3 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi ... 35
4. DISKUSSION... 39
4.1 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 ... 39
4.2 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi ... 41
4.3 Slutsats ... 42
5. TACKORD ... 43
6. REFERENSER ... 44
7. BILAGOR ... 46
1 FÖRKORTNINGAR
WBC White blood cell, leukocyter
LPK Leukocytpartikelkoncentration
Neutr. Neutrofil granulocyt
Lymf. Lymfocyt
Mono. Monocyt
Eos. Eosinofil granulocyt
Baso. Basofil granulocyt
5-partsdiff Differentialräkning av leukocyter med indelning i
neutrofila granulocyter, lymfocyter, monocyter, eosinofila granulocyter och basofila granulocyter
MGG May-Grünwald Giemsa
EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid, antikoagulansia
ALL Akut lymfatisk leukemi
AML Akut myeloisk leukemi
KLL Kronisk lymfatisk leukemi
PLL Prolymfocytleukemi
KML Kronisk myeloisk leukemi
MDS Myelodysplastiskt syndrom
LUC Stora ofärgade celler
MPXI Myeloperoxidas index
IG Omogna granulocyter
Atypi Atypiska lymfocyter
CCD kamera Charge coupled device kamera
Pixel En punkt med viss färg och placering som bygger upp en bild
Sd Standardavvikelse
CV Variationskoefficient
R Korrelationskoefficient
R2 Determinationskoefficient
2 1. INTRODUKTION
1.1 Patientnära analysverksamhet
Patientnära analysverksamhet vid vårdcentralslaboratorium kan vara ett
kostnadseffektivt och säkert alternativ till analyser utförda på sjukhuslaboratorier.
Dessa analyser kan ge ett snabbt svar till den kliniskt ansvarige läkaren. Patienten gynnas genom möjlighet till snabbare behandling eller korrigering av denna. Analys kan dessutom ske direkt vid provtagning. Det medför snabbare besked för att meddela analysresultat samt en minskning av väntetid och extra provtagningsbesök för patienten. Ytterligare en fördel är att det underlättar för patienter som bor långt bort från sjukhuset eller som har svårt att ta sig till laboratoriet.
Målet med verksamheten är att patientens hälsa skall stå i fokus (1).
Hemocue AB är ett företag som inriktar sig på att utveckla diagnostiska instrument inom laboratoriemedicin för patientnära analysverksamhet. Genom tillverkning av laboratoriesystem för mätning av exempelvis hemoglobin- och glukoskoncentration i helblod, albumin i urin samt blodets koncentration av leukocyter har företaget
bidragit till att utvidga användningsområdet för patientnära analyser. Dessa instrument kan användas på läkarmottagningar, vårdcentraler, äldreboende, diabeteskliniker och sjukhusmottagningar (2).
Samtliga produkter är framställda för att användas med Hemocues patentskyddade mikrokyvetter, som fungerar som både provbehållare och reaktionskammare.
Ungefär 10 µl blod sugs in i kyvetten med kapillärkraft och reaktioner som sker i kyvetten kan sedan registreras i instrumentet (3).
1.2 Leukocyters bildning och roll i kroppen
Bildningen av leukocyter, leukocytopoesen, sker i benmärgen och stimuleras av olika cytokiner. Alla blodceller härstammar från en pluripotent stamcell med förmåga till självförnyelse, proliferation och differentiering. Den pluripotenta stamcellen ger upphov till nya stamceller med varierande kapacitet till dessa egenskaper. Utifrån
3
myeloida- och lymfoida stamceller utvecklas leukocyterna i olika poeser till olika mognadsstadier (4).
Leukocyter, vita blodkroppar, delas in i granulocyter, lymfocyter och monocyter.
Granulocyter delas vidare in i neutrofila-, eosinofila- och basofila granulocyter som alla har olika funktioner. De olika granulocyterna har granula med affinitet för olika basiska och sura färger, vilket utnyttjas vid morfologisk och maskinell klassifikation av dem.
Alla leukocyter deltar i immunförsvaret för att skydda kroppen mot infektioner.
Monocyter och neutrofila granulocyter är fagocyterande celler som tar in olika antigener i sin cytoplasma och förstör dessa med kraftiga enzymer som finns i granula. Monocyter kan även aktivera lymfocyter, tack vare sin antigenpresenterande förmåga. Basofila granulocyter agerar vid allergiska reaktioner genom att släppa ut histamin. Eosinofila granulocyter angriper parasiter genom att fästa sig vid dem och spruta in giftiga enzymer. De deltar även vid allergiska tillstånd.
Huvudgrupperna av lymfocyter är T-celler (thymus-dependent), B-celler (bursa- dependent) och NK-celler (natural killer). T-celler delas in i flera undergrupper.
T-hjälpar-cellernas funktion är bland annat att känna igen antigen på
antigenpresenterande celler och att aktivera andra T-celler och makrofager.
Cytotoxiska T-celler dödar infekterade celler som märkts in med antigenpeptider på ytan. B-celler har förmågan att differentiera till plasmacell när de aktiveras av ett antigen, och kan då producera antikroppar av olika typer. NK-celler har cytotoxisk förmåga och kan attackera och döda tumörceller eller celler som angripits av virus (4).
Totala antalet leukocyter mäts i leukocytpartikelkoncentration x109/L (LPK eller WBC). En reducering av antalet leukocyter medför en ökad infektionsbenägenhet.
Detta kan ses vid stamcellssjukdomar, HIV och behandling med cytostatika. Ökat antal leukocyter ses vid bakteriella (neutrofila granulocyter) eller virala infektioner (lymfocyter) och vid hematologiska sjukdomar (4).
4
Friska vuxna individer har 3,5-8,8x109 leukocyter/L där neutrofila granulocyter och lymfocyter är de dominerande celltyperna (tabell I). Den procentuella fördelningen av leukocyter baseras på det totala antalet leukocyter.
Fördelningen av leukocyter hos barn är annorlunda än hos vuxna. Barn har exempelvis ett högre antal lymfocyter (5,6). Värdena kan variera med ålder, dygnsvariationer, träning, graviditet, fysisk stress och cigarettrökning (7).
Förstadier eller omogna celler i perifert blod finns normalt inte hos friska människor (5,6).
Tabell I. Normalvärden för leukocyter hos vuxna individer (5,6)
1.3 Cytokemisk färgning vid manuell bedömning av blod- och benmärgsceller
För att manuellt studera cellmorfologi och kvantifiera celler i blod- och benmärgsutstryk används cytokemiska färgningar. Färgning av celler och dess innehåll i kärna och cytoplasma sker baserat på strukturernas kemiska egenskaper.
Cellkärnan och komponenter i cytoplasman har affinitet för olika färger beroende på pH (8,9).
Färgningstekniken som används mest frekvent på kliniska laboratorier i Sverige är en Pappenheimfärgning som kallas May-Grünwald-Giemsa (MGG). Med denna metod sker färgning med en sur (eosin) och en basisk färg (metylenblått) (8,9). May- Grünwald färgar strukturer i cytoplasman och Giemsa strukturer i cellkärnan.
Basiska komponenter får en blå, blå-grå eller violett färg och sura (acidofila) komponenter får röd, orange eller rosa färg (8-10).
Celltyp x109/L %
Leukocyter 3,5- 8,8
Neutrofila granulocyter 1,8- 6,8 40- 70 Stavkärnig granulocyt < 0,7 < 5 Eosinofila granulocyter < 0,5 < 5 Basofila granulocyter < 0,2 < 3
Lymfocyter 0,9- 4,0 25- 45
Monocyter 0,2- 0,9 < 10
5
Spädning av MGG och sköljning mellan färgbaden bör ske med fosfatbuffert med pH 6,8. Denna buffert benämns Sörensens buffert. Kranvatten bör undvikas på grund av varierande pH som påverkar färgskalan så att cellstrukturer försvagas eller
försvinner.
För att undvika morfologiska förändringar av celler används ett bad med metanol för fixering. Koncentrerad May-Grünwaldlösningen innehåller tillräckligt med metanol för att fixering ska ske varför ett särskilt bad för detta ändamål inte behövs. Metanol skall däremot användas om lösningen är utspädd eller om ett ofärgat preparat ska sparas (8,9).
Ursprungsreceptet består av koncentrerad May-Grünwald eosinmetylenblått spätt med koncentrerad metanol och Sörensens buffert, och Giemsalösning med azur- eosinofil-metylenblått, metanol och Sörensens buffert. Giemsalösningen bör bytas efter högst 4 timmar för att optimal färgningsintensitet ska uppnås. Reagensinnehåll och färgningsmetodik kan skilja sig åt mellan olika laboratorium (8,9).
1.4 Leukocytopoesens morfologi i MGG-färgning
1.4.1 Granulocytopoesen
Granulocyter utvecklas i benmärgen från myeloblaster som är 11-20 μm i diameter.
De har en rund blårödlila kärna som är belägen centralt eller excentriskt.
Kärnstrukturen är finmaskig och slät med tydliga nukleoler. Cytoplasman är något blåaktig och kan innehålla upp till tio azurblåa granula.
Promyelocyten är 11-25 μm i diameter och har en rund eller oval kärna med nukleoler och en ljus uppklarning intill kärnan i cytoplasman. I den blåtonade cytoplasman finns primära azurofila granula som innehåller myeloperoxidas, lysozym och sura hydrolaser (4,11).
Myelocyten är 11-20 μm i diameter. Kärnstrukturen är tätare än hos promyelocyten och kärnan rund, oval eller svagt bönformad. Nukleoler saknas. Myelocyten
utvecklar sekundära granula innehållande laktoferrin, B12, alkaliskt fosfatas, lysozym och kollagenas. Den neutrofila myelocyten har stoftfina gråblå eller
6
rosafärgade granula. Den basofila myelocyten har mörkblåvioletta granula som ligger i cytoplasman och ovanpå kärnan. Eosinofil myelocyten har röd-orange granulering. Granulas affinitet för olika färger beror på dess innehåll. Neutrofila granula innehåller peroxidas, kloracetatesteras, surt fosfatas och alkaliskt fosfatas.
Eosinofila granula består av peroxidas och surt fosfatas och basofila granula innehåller surt fosfatas och klaracetatesteras (4,11).
Metamyelocyten är 11-18 μm i diameter och har en kärna som är brett bönformad.
Den har samma granulering som myelocyten. Primärgranula finns men i mindre kvantitet.
Den stavkärniga granulocyten är 10-16 μm i diameter med en stavformad kärna.
Kärnstrukturen är grov där den smalaste delen är mer än 1/3 av den bredaste. Granula är mestadels i form av sekundärgranula men även ett fåtal primärgranula finns. En ökning av stavkärniga granulocyter och förstadier ses som en vänsterförskjutning och förknippas med patologiska tillstånd. Normalt utgör stavkärniga granulocyter 0-5 % av det totala antalet leukocyter i blodet (4,11).
Den segmenterade granulocyten är lika stor som den stavkärniga och har 3-5
mörkblålila kärnsegment som hålls ihop av tydliga filament. Cytoplasman är ljusrosa med stor mängd ljusblå sekundärgranula och ett fåtal primärgranula (4,11).
I figur 1 nedan visas de olika utvecklingsstadierna från myeloblast till segmenterad granulocyt.
Figur 1. Granulocytopoesens utvecklingsstadier. a.myeloblast, b. promyelocyt c. myelocyt d.metamyelocyt e.stavkärnig granulocyt
f.segmenterad granulocyt (Bilder godkända för användning av Susanne Widell)
7
Om fler än 5 segment förekommer i mer än 5 % av de segmenterade granulocyterna betraktas det som hypersegmentering, vilket kan förekomma vid B12- eller
folsyrabrist. Färre än 3 segment hos mer än 5 % av de segmenterade granulocyterna ses som hyposegmentering (pseudo-Pelger kärna), vilket kan ses hos patienter med Myelodysplastiskt syndrom eller Akut myeloisk leukemi. Eosinofila- och basofila granulocyter har en kärna uppdelad på 2-3 segment (4,11).
1.4.2 Monocytopoesen
Monoblasten har samma morfologiska utseende som myeloblasten. Dessa kan inte skiljas åt morfologiskt. Promonocyten har en oregelbunden kärna, stålblågrå cytoplasma och synliga nukleoler. Karakteristiskt för monocyter är en stor,
oregelbunden kärna, stålblågrå cytoplasma med stoftfina granula och molnliknande och luckert kromatin (figur 2). Vakuoler är vanligt förekommande i cytoplasman i venöst blodprov taget i rör med EDTA-tillsats.
Då monocyten vandrar från blodbanan ut i vävnaden kan den omvandlas till makrofag (4,11).
Figur 2. Olika mognadsstadier hos monocyten. a.monoblast
b.mogen monocyt (Bilder godkända för användning av Susanne Widell)
1.4.3 Lymfocytopoesen
Lymfoblaster mognar och differentieras till B-lymfocyter eller T- lymfocyter.
Produktionen av alla lymfocyter sker i benmärgen. Blivande T-lymfocyter får däremot sin immunologiska kapacitet i thymus.
8
Morfologiskt i blod ses små lymfocyter (8-10 μm i diameter) som karakteriseras av en mörk och rund kärna med tätt kromatin och en osynlig nukleol och liten mängd ljus till blåaktig cytoplasma. Stora lymfocyter (12-18 μm i diameter) har rikligare och ljusare cytoplasma, en mer oregelbunden kärna och några kan ha ett fåtal stora azurofila granula.
Plasmacellen förekommer normalt inte i blodet hos friska personer. Dess form är oval och kärnan är oftast belägen i cytoplasmans ena kant. Cytoplasman är mörkblå med en ljus uppklarning intill kärnan (4,11).
I figur 3 nedan visas lymfocytopoesens utvecklingsstadier från lymfoblast till mogen lymfocyt och en differentierad plasmacell.
Andra varianter av lymfocyter kan förekomma vid vissa sjukdomstillstånd, exempelvis vid virussjukdomar som mononukleos och cytomegalvirus (4,11).
Figur 3. Lymfocytopoesens utvecklingsstadier. a. lymfoblast b.liten lymfocyt c. stor lymfocyt d.plasmacell (Bilder godkända för användning av Susanne Widell)
1.5 Störningar i leukocytopoesen
1.5.1 Infektiösa tillstånd
Vid bakteriella infektioner sker en ökad produktion av granulocyter, och framför allt neutrofila granulocyter. Granulocyter påverkas genom ökad granulering där granula blir rödfärgade olikstora och reaktiva. I benmärgen sker en ökad produktion av segmenterade- och stavkärniga granulocyter, som snabbt tar sig ut i blodet. Detta tillstånd kallas för vänsterförskjutning i differentieringen (12).
9
Vid svåra bakteriella infektioner kan inklusioner ses i granulocyters cytoplasma.
Dessa är runda och gråblå till färgen. De kallas för Döhles kroppar och består av aggregat av endoplasmatiskt retikel. Dessa kan ses vid exempelvis pneumoni (4).
Vid virusinfektioner ökar istället lymfocyter betydligt. Lymfocyterna har varierande utseende med olika storlekar, olika mängd cytoplasma och eventuell förekomst av granula. Reaktiva lymfocyter kan förekomma vid infektioner orsakade av Epstein Barr virus, och i vissa fall av parasitsjukdomar. I blodet förekommer då atypiska lymfocyter med oregelbunden kärna, nukleoler och en ökad mängd blåskuggig cytoplasma. Ofta råder även en relativ granulocytopeni och trombocytopeni (12).
1.5.2 Leukemi
Leukemi är samlingsnamnet på en grupp blodcancersjukdomar. De delas in i akut eller kronisk leukemi beroende på sjukdomsförlopp, symtom och vilka poeser som är drabbade (4).
Definitionen av akut leukemi är en expansion av omogna elakartade hematopoetiska celler i benmärg och perifert blod. Expansionen resulterar i en brist på normala
blodkroppar, vilket yttrar sig i anemi, blödningar och en ökad risk för infektioner (4).
De stora huvudgrupperna inom akut leukemi är akut lymfatisk leukemi (ALL) och akut myeloisk leukemi (AML). ALL dominerar hos barn, AML hos vuxna. Hos båda grupperna kan genetiska förändringar påvisas i stamceller. Med kromosomanalyser kan specifika kromosomrubbningar upptäckas, vilket har prognostisk betydelse.
Karakteristiskt för ALL är en expansion av omogna lymfatiska celler, vilka morfologiskt ses som blaster i perifert blod. Granulocytopoesen är nedsatt.
Vid AML ses istället en expansion av myeloida celler med blaster i blodet. Ett fynd som ibland kan hittas är Auerstavar, vilket är aggregat av granula (4).
Kronisk leukemi delas in i kronisk lymfatisk leukemi (KLL) och kronisk myeloisk leukemi (KML). KLL drabbar ofta äldre och har ett stillsamt förlopp trots att den är obotlig. Den upptäcks ofta vid utredning av symtom som inte är kopplade till
10
leukemin. Många är symtomfria trots det kraftiga cellantalet i benmärg, blod, mjälte och lymfknutor.
KLL-cellen är en mogen B-lymfocyt. Inga blaster förekommer i blodet, istället dominerar mogna lymfocyter. En form av KLL är prolymfocytleukemi (PLL) där prolymfocyter dominerar.
KML kännetecknas av höga nivåer av granulocyter där alla myeloiska förstadier från omogen blast till mogen granulocyt påvisas i blodet. Även eosinofila- eller basofila granulocyter kan öka. Vanliga fynd är även kärnförande erytrocyter på grund av splenomegali (förstorad mjälte). Philadelphiakromosomen (translokation 9,22) är något som är diagnostiskt vid KML (4).
1.5.3 Myelodysplastiska syndrom
Myelodysplastiska syndrom (MDS) är en grupp av maligna stamcellssjukdomar med mognadsstörningar inom en eller flera poeser. Det är sjukdomar som mestadels drabbar äldre människor.
I blodet råder ofta pancytopeni (brist på alla blodceller) med hypogranulering hos granulocyter, pseudo-Pelgerkärna och abnorm morfologi hos blodcellerna. För diagnos krävs anemi samt granulocytopeni eller trombocytopeni.
MDS orsakas av kromosomrubbningar i stamceller till följd av exempelvis joniserande strålning. Det kan även utvecklas efter cytostatikabehandling.
30 % av patienter med MDS utvecklar AML (4).
1.5.4 Maligna lymfom
Maligna lymfom är en grupp tumörsjukdomar som uppstår i lymfatisk vävnad, där de sedan kan sprida sig till annan vävnad. Huvudgrupperna utgörs av Hodgkins
sjukdom och Non-Hodgkins lymfom. Vanliga symtom vid dessa sjukdomar är svullna lymfkörtlar och leukemi-liknade symtom såsom nattliga svettningar, feber och viktnedgång. Förutom förstorade lymfkörtlar kan även en förstoring av mjälten förekomma (4).
11
Vid Hodgkins sjukdom påvisas maligna jätteceller, Reed-Sternberg-celler, som ofta är minoriteten av celler i tumören. I lymfkörtlarna finns förutom tumörceller även benigna inflammatoriska celler. Dessa utgörs av lymfocyter, neutrofila granulocyter och plasmaceller. I blodet förekommer leukocytos med en lätt till måttlig ökning av neutrofila granulocyter. I många fall kan även eosinofila granulocyter öka (4,12).
Non-Hodgkins lymfom delas in i lågmalign och högmalign sjukdom. Vid den lågmaligna varianten är de lymfatiska cellerna små och liknar morfologiskt normala lymfocyter. Den vanligaste formen av lågmaligna lymfom är B-KLL-lymfomen.
Patienter med denna typ av lymfom har oftast lång överlevnad.
Vid högmalignt lymfom dominerar blastceller i den lymfatiska vävnaden.
Tumörceller kan i undantagsfall hittas i perifert blod och benmärg. I snittat benmärgsmaterial kan härdar av blaster och små lymfatiska celler hittas.
Lymfoblastiskt lymfom är ett högmalignt lymfom som har benägenhet att sprida sig till benmärgen. Det är ett lymfom som kan drabba både barn och vuxna och som kan vara av både B- och T-cellstyp (4, 12).
1.6 Manuell differentialräkning av leukocyter
För att bedöma kvantitativa förskjutningar mellan leukocyter utförs
differentialräkning av dessa. Det ger en bild av fördelningen mellan de olika
celltyperna, dess differentieringsstadium samt dess morfologi. Det kan vara till hjälp vid misstanke om infektioner och vid hematologiska utredningar (12).
Differentialräkning av leukocyter kan ske i venöst blod med tillsats av EDTA (ethylenediaminetetra acetic acid) eller i kapillärt blod taget direkt från
fingerblomman. Blodet stryks i båda fallen ut på ett objektsglas. Utstryket bör utföras inom 4 timmar för att undvika åldrande av celler och påverkan av EDTA i venösa prover (till en ökad vakuoliseringsgrad). Blodfilmen skall strykas ut så att den gradvis övergår till ett tunnare lager där celler kan studeras var för sig och lätt identifieras. Blodutstryket färgas därefter med May-Grünwald-Giemsa för att möjliggöra klassifikation av de olika celltyperna (13).
12
Differentialräkning av leukocyter kan utföras manuellt i mikroskop eller maskinellt med cellräknare. Vid räkning i mikroskop granskas preparatet vid en låg förstoring för att avgöra om blodfilmen är tekniskt bra struken och att cellerna går att bedöma.
Antalet trasiga celler får överstiga 2 % endast hos patienter med kronisk lymfatisk leukemi. I annat fall är utstryket inte tekniskt acceptabelt. För närmare granskning av celler och dess strukturer används 60x eller 100x förstoring med olja.
Vid differentialräkningen granskas preparatet från sidokant till sidokant i ett
encellslager och minst 200 celler bör räknas. Varje cellslag får ett procentuellt värde, som räknas om till totalantal baserat på totala antalet leukocyter.
Cellerna klassificeras i neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, basofila granulocyter, lymfocyter, monocyter, blaster, promyelocyter, myelocyter,
metamyelocyter, stavkärniga granulocyter och eventuella plasmaceller. Skadade och trasiga celler räknas inte. Förekomst av omogna erytrocyter anges per 100 räknade leukocyter (13).
Förutom kvantitativa uppskattning av dessa utförs även en kvalitativ bedömning av leukocyter, erytrocyter och trombocyter. Den kvalitativa bedömningen av
granulocyter utgörs av hypo- eller hypersegmentering, vilket anges om det ses hos mer än 5 % av cellerna. Hos monocyter anges eventuell abnorm morfologi.
Avvikande former av lymfocyter anges som lymfocyter med variantformer, vilket anges om de är fler än 5 % av det totala antalet lymfocyter (13).
För bedömning av den röda blodbilden granskas erytrocyternas storlek, form och innehåll. Normala mogna erytrocyter är bikonkava, kärnlösa och är 7-9 μm i diameter. I mitten ses en liten ljusuppklarning. Förstadier såsom kärnförande
erytrocyter ska enbart finnas i benmärgen hos friska individer. Fynd av dem i perifert blod kan vara tecken på en patologisk ökning av erytropoesen eller en extramedullär blodbildning till följd av splenektomi.
Morfologiska avvikelser kan ske vid infektioner och hematologiska sjukdomar. Vid macro- och mikrocytos är majoriteten av erytrocyterna större än 9 μm respektive mindre än 7 μm i diameter. Makrocyter är vanliga fynd vid leversjukdomar,
alkoholism, megaloblastisk anemi och MDS. Mikrocytos förekommer vid järnbrist.
13
Innehållsatypier utgörs av hypo- eller polykromasi. Vid hypokromasi ses en större uppklarning i cellens mitt till följd av minskat hemoglobininnehåll. Polykromasi kännetecknas av olikfärgade erytrocyter med inkomplett utfyllnad av hemoglobin.
Dessa är ofta retikulocyter, omogna erytrocyter.
Anisocytos innebär en storleksvariation bland erytrocyterna. Vid poikilocytos har erytrocyterna olika former. Ovala celler kan förekomma vid megaloblastisk anemi.
Sfäriska celler är ofta mikrocyter och kan hittas vid hemolytisk anemi eller hos individer efter blodtransfusion. Skärvor av celler kallas sickelceller och ses hos patienter med sickelcellsanemi. Droppformade celler (teardrops) är karakteristiskt för myelofibros. Targetceller är makrocyter som har en ökad infärgning i mitten. De ses vid leversjukdomar och thalassemi.
Erytrocyter kan även ha inklusioner i cytoplasman. Howell-Jolly kroppar är fragment av kärnmaterial som ses som en röd rund inklusion. Dessa kan ses vid hemolytisk anemi. Basofil punktering är mörkblå korn som är aggregat av ribosomer. Dessa förekommer vid hemolytisk anemi och blyförgiftning (4).
Kvalitativa störningar av trombocyter utgörs av trombocytopeni, trombocytos samt avvikande former. Vid den kvalitativa bedömningen anges även förekomst av aggregat (13).
1.7 Maskinell differentialräkning av leukocyter
1.7.1 Allmänt om automatiska cellräknare
Införande av automatiska cellräknare har haft stor betydelse inom vården.
Informationen om olika analyter och betydelsen för dess förekomst har ökat och analysresultat har kunnat levereras snabbare än tidigare (14).
Med cellräknare som analyserar blodceller i helblod erhålls information både kvantitativt och kvalitativt. Den kvalitativa informationen består av analytisk interferens och förekomst av abnorma celltyper som påträffas vid patologiska
14
tillstånd. Dessa celler kan bestå av blaster, omogna erytrocyter eller granulocyter och atypiska lymfocyter (14).
Den analytiska prestandan hos cellräknare bedöms genom precision, noggrannhet och klinisk sensitivitet. Precisionsstudier kan ge information om resultatens variation genom mätningar i en serie. Vid tolkning av analysresultat är det viktigt att känna till att prover kan påverkas av variationer vid hanteringen innan analys samt i själva analysprocessen.
Noggrannhet i en serie mätningar handlar om hur nära analysresultatet ligger det sanna värdet. Det har betydelse då varje individuellt analysresultat ska placeras inom ett referensintervall där det finns övre och lägre gränser för normalintervall. Låg noggrannhet medför en lägre känslighet.
Klinisk sensitivitet är instrumentets förmåga att skilja på normala och patologiska prover. Klinisk specificitet definieras som andelen patienter med känd sjukdom som får sant resultat med metoden som testas.
Många cellräknare som analyserar blodstatus och differentialräkning av leukocyter har förmågan att upptäcka omogna eller patologiska celler och anger en förekomst av dessa genom larmfunktioner. Därmed är den kliniska sensitiviteten vanligtvis hög.
Brister kan finnas i den kliniska specificiteten, exempelvis då larm om patologiska celler kan visa sig vara normala celler vid kontroll i mikroskop (14).
Automatiska cellräknare som utför differentialräkning av leukocyter ska kunna påvisa kvantitativa förändringar hos en normal population av leukocyter samt upptäcka morfologiskt avvikande former. Detta innefattar identifiering av omogna eller atypiska celler. De har inte förmågan att klassificera dem, men ger larm vid förekomst av dem.
Cellräknare räknar tusentals celler i ett prov. Resultatet ges ut både i procent och som absolut värde. Vid manuell mikroskopering räknas 100-200 celler i ett blodutstryk.
Det kan ha sina nackdelar i att celler kan fördelas olika i preparatet och att
fördelningen blir annorlunda. Bedömningen kan dessutom skilja sig åt mellan två individer. Som bedömare krävs kunskaper om morfologin hos både normala och patologiska celler samt kunskap om metodikens begränsningar (14).
15 1.7.2 Advia 2120
Cellräknaren Advia 2120 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA) är ett diagnostiskt instrument för helblodsanalyser av blodstatus, retikulocyter och differentiering av leukocyter (5-partsdiff). Vid 5-partsdiffen anges fördelningen av neutrofila granulocyter, basofila granulocyter, eosinofila granulocyter, lymfocyter och monocyter (6).
Instrumentet består av en analysatordel och en datastation med monitor.
Analysatordelen består av aspirationsenheter, optiska enheter (perox- och laseroptik samt hemoglobin-kolorimeter), UFC-block (unified fluids circuit), pumpar för prov, reagens och tvättlösning, vakuum- och tryckregulatorer, en blodventil, en
manöverpanel och ett avfallssystem. UFC-blocket består av akrylplattor som innehåller fyra reaktionskammare samt vägar för vätske- och luftflöde och ventiler.
Bakom blocket finns en reagenspump (15).
För analys krävs venöst helblod med tillsats av EDTA(K2) eller kapillärblod. Provet kan aspireras på tre olika sätt; i en provväxlare i slutet system, manuellt öppet eller manuellt slutet. 175 μl blod aspireras och förs till blodventilen, som roterar och späder provet med respektive reagens. Blandningen av prov och reagens fördelas till respektive reaktionskammare, där en cytokemisk reaktion sker. Suspensionen förs till en flödescell för analys, därefter till slasken och respektive kanal sköljs.
Analysresultatet skickas till instrumentdatorn för bedömning (6,15).
Differentialräkning av leukocyter med Advia 2120 sker genom två skilda metoder.
För beräkning av det absoluta och procentuella antalet basofila granulocyter används Basofil/lobularitetsmetoden. Metoden bygger på att celler belyses med laser, vilket resulterar i ljusspridning från en hög och en låg vinkel baserat på cell- eller
kärnstorlek respektive kärnkonfiguration. De optiska signalerna omvandlas till elektriska pulser av fotodioder. Pulserna sammanställs i ett cytogram som visar ljusspridningen vid hög och låg vinkel (figur 4). Signaler vid hög vinkel visas på x- axeln och står för kärnans konfiguration. Signaler från låg vinkel visas på y-axeln och visar cellens storlek. Olika celltyper hamnar i olika populationer och särskiljs i
16
brus (t ex skräp, icke-lyserade erytrocyter), mättnad (t ex luftbubblor), blastkärnor, monocyt- och lymfocytkärnor, kärnor från neutrofila- och eosinofila granulocyter och intakta basofila granulocyter.
Figur 4. Baso cytogram från Advia 2120. 1. Brus 2. Blast 3. Monocyter och lymfocyter 4. Basofila granulocyter 5. Misstänkt basofil granulocyt 6. Mättnad 7. Neutrofila- och eosinofila granulocyter (Cellbilder godkända för användning av Susanne Widell)
För beräkning av resterande neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, lymfocyter och monocyter används Peroxidasmetoden, där celler belyses med en halogenlampa. Ljusspridning sker vid låg vinkel, baserat på peroxidasinnehåll, och vid hög vinkel, baserat på cellstorlek. Data registreras och sammanställs i ett cytogram med cellstorlek på y-axeln och peroxidasaktivitet på x-axeln (figur 5).
Lymfocyter, basofila granulocyter och stora ofärgade celler (LUC) innehåller inte peroxidas och förblir ofärgade och hamnar i cytogrammets vänstra del. LUC kan utgöras av blaster, atypiska lymfocyter eller plasmaceller. Neutrofila granulocyter har hög peroxidasaktivitet och är stora celler, så de hamnar i cytogrammets övre högra del. Med hjälp av cytogrammet kan även brus, kärnförande erytrocyter och trombocytaggregat identifieras. Med Peroxidasmetoden kan även MPXI
(myeloperoxidase index), vilket kan ge en indikation om granulocyter har brist på endogent myeloperoxidas (6,15).
17
Figur 5. Perox cytogram från Advia 2120. 1. Brus 2. Kärnförande erytrocyter 3. Trombocytaggregat 4. Lymfocyter och basofila granulocyter 5. LUC 6. Monocyter 7. Neutrofila granulocyter
8. Eosinofila granulocyter (Cellbilder godkända för användning av Susanne Widell)
Med båda metoderna kan det totala antalet leukocyter beräknas med hjälp av de två cytogrammen. Ett värde erhålls från respektive kanal. I första hand lämnas resultatet ut från Baso-kanalen (6).
Advia 2120 har larmfunktion för onormala prover. Atypiska lymfocyter (Atypi) och omogna granulocyter (IG) graderat plus 1 kan uppkomma då provet är gammalt.
Larm om förekomst av blaster, Atypi och IG 2-3 och kärnförande erytrocyter kräver manuell eller maskinell differentialräkning av leukocyter. Om antalet kärnförande erytrocyter överstiger 10 % av det totala antalet leukocyter bör detta värde räknas om efter manuellt mikroskopi.
Manuell mikroskopi utförs även vid LUC över 6 % eller 0,4x109/L, MPXI mer än +/- 25 (tyder på myeloperoxidasbrist) och basofila granulocyter över 5 % av totala antalet leukocyter (6).
18 1.7.3 Hemocue WBC Diff
Hemocue White Blood Cell (WBC) Diff (Hemocue AB, Ängelholm, Sverige) utför kvantitativ bestämning av totala antalet leukocyter och differentialräkning av dessa i kapillärt eller venöst blod. Instrumentet är utformat för användning inom patientnära verksamhet för analys på både barn och vuxna. Det är fabrikskalibrerat och kräver minimalt med underhåll samt är enkelt att arbeta med. Analysresultat visas inom 5 minuter och uttrycks både i procent och som absolut värde (7).
Instrumentet är avsett att användas med Hemocue WBC Diff mikrokyvetter. Även Hemocues WBC mikrokyvetter för analys av totala antalet leukocyter kan användas.
Mikrokyvetten är engångsmaterial och består av polystyren. 10 µl blod krävs för analys och kan tas direkt från fingerblomman eller från ett venöst provrör
innehållande antikoagulantia. Provet ska analyseras inom 8 timmar efter
provtagningen. Venösa prover blandas 1-2 minuter på rullblandare eller manuellt genom att röret vänds 10-20 gånger (7).
För analys av ett prov sugs blod in i kyvetten med kapillärkraft. I kyvetten
hemolyseras erytrocyter av saponin och leukocytkärnor färgas in med metylenblått. I mikrokyvetten finns surfynol 465 och triton x-100, vars funktioner är att minska ytspänningen (7,16,17).
Mikrokyvetten skall placeras i instrumentet inom 40 sekunder efter att den fyllts. I instrumentet scannas området i kyvetten, ca 140 µm, av en charge coupled device (CCD) kamera. Kameran rör sig 5 µm åt gången, fokuserar in på celler och tar 37 bilder som sätts samman i en bild där sedan varje cell scannas (7).
Kameran scannar av färgintensiteten hos cellerna och mäter den optiska densiteten, förmågan att absorbera ljus, i olika punkter (pixlar) på dessa. Färgskalor omvandlas därefter till gråskalor från 0 (vitt) till 4 (kraftigt infärgad). Varje cell får ett specifikt mönster som kan jämföras med celler i ett referensbibliotek. Det inlagda
referensbiblioteket har över 50 000 celler som manuellt klassificerats.
Referenscellernas form och färgintensitet har tagits fram och tränats i ett neuralt nätverk, där algoritmer används för att känna igen ett specifikt mönster. Varje cell i
19
referensbiblioteket har en specifik optisk densitet (7,18). Information om mätprincipen har verifierats av Stellan Lindberg på Hemocue AB.
Metoden är mycket lik den som används av Cellavision Diffmaster (Cellavision AB, Lund, Sverige) med samma analysprincip (19).
Värden som ges ut är totala antalet leukocyter, neutrofila granulocyter, lymfocyter, monocyter, eosinofila granulocyter och basofila granulocyter.
Mätintervallet för totala antalet leukocyter är 0,3-30,0x109/L. Differentialräkning visas när totala antalet leukocyter är 1.0-30,0x109 /L. Det nedre mätvärdet för neutrofila granulocyter är 0,8x109/L, för lymfocyter 0,3x109/L och för resterande leukocyter 0,0x109/L. De högsta mätvärdena är 30,0x109/L för neutrofila
granulocyter och lymfocyter, 5,0x109/L för monocyter, 1,5x109/L för eosinofila granulocyter och 1x109/L för basofila granulocyter.
Resultat som ligger över mätintervallet svaras ut som HHH och resultat under mätintervallet visas som LLL. Vid patologiska tillstånd med förekomst av omogna eller atypiska celler erhålls enbart värdet för totala antalet leukocyter. För
differentialräkning av dessa ska provet kontrolleras på ett sjukhuslaboratorium för att utreda orsaken till larmet.
Larm kan även visas om analysen inte utförts på grund av mätningsfel då bilden är oskarp, om ljusstyrkan är otillräcklig eller om batterispänningen är för låg. Vid resultat som är högre eller lägre än förväntade resultat kan orsaken vara felaktig provtagning, felaktig förvaring av prov eller att mikrokyvetten är skadad eller gammal (7).
Kända interferenser som har uppmärksammats är hos patienter som har mer än 2 % kärnförande erytrocyter. Hos dessa patienter kan det totala antalet leukocyter bli falskt förhöjt (7). Inom en snar framtid kommer Hemocue att förbättra instrumentets förmåga att skilja på omogna erytrocyter och ett larm kommer att finnas för detta ändamål.
Till instrumentet kan skrivare, tangentbord, streckkodsläsare och dator kopplas för att underlätta inmatning av patient-ID och överföring av resultat för bedömning (7).
20 1.8 Syfte
Syftet med arbetet var att undersöka korrelationen av analysresultat gällande differentialräkning av leukocyter i venöst blod mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 samt differentialräkning av leukocyter i kapillärt blod mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi.
2. MATERIAL OCH METODER
2.1 Provmaterial
2.1.1 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120
Provmaterialet var i form av rumstemperarade venösa blodprover med tillsats av EDTA (K2) som antikoagulantia. 62 venösa patientprover med en spridning i leukocytnivåer valdes ut. Av dessa 62 prover utgjordes 15 stycken av prover tagna inom primärvården, resterande hade tagits på sjukhusets avdelningar och
mottagningar. De flesta prover kom från vuxna män och kvinnor i åldrarna 17-86 år, endast ett fåtal från barn i åldrarna 10-16 år. Alla prover kom från patienter med okänd anamnes.
De olika leukocytnivåerna låg på 2,1-5,0x109/L, 5,1-11,0x109/L samt 11,1-25x109/L.
Prover valdes ut så att 32 % av proverna som analyserades låg på den lägsta nivån, ca 48 % på den mellersta nivån och ca 19 % på den högsta nivån.
De första fem proverna kördes som dubbelprover på båda instrumenten för att utesluta att någon signifikant skillnad i analysresultat fanns vid analys av samma prov. Resterande prover analyserades som enkelprover. Analyserna utfördes inom 8 timmar efter provtagningen. Differentialräkning av leukocyter utfördes på båda instrumenten och utfördes inom 8 timmar efter provtagningen. Tiden mellan analyserna på respektive instrument översteg inte 2 timmar.
21
2.1.2 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi
Underlaget för studien var 20 kapillära prover som togs på vuxna individer. Dessa var män och kvinnor i åldrarna 23-65. Samtliga personer betraktades som friska.
2.2 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120
2.2.1 Analys med Hemocue WBC Diff
Provet vändes manuellt 10-12 gånger för hand. Med hjälp av en 25 µl mikrokapillär togs blod från röret och placerades på en plastbit med hydrofob yta. Hemocue WBC Diff mikrokyvett fylldes i ett moment genom att spetsen hölls i ca 45o vinkel mot bloddroppen. 10 µl blod sögs in i mikrokyvetten med kapillärkraft. Överskott av blod torkades bort från mikrokyvettens utsida med en luddfri tork. Kyvetten
kontrollerades att den inte hade förekomst av luftbubblor och placerades därefter i kyvetthållaren inom 40 sekunder efter fyllningen. Kyvetthållararmen fördes mot mätläget och kyvetthållaren gled in i instrumentet för mätning (7).
I kyvetten hemolyserades erytrocyter med saponin (500 µg/g). Metylenblått (20 µg/g) färgade in leukocyternas cellkärnor. I instrumentet scannade CCD kameran området i kyvetten. Matematiska beräkningar och jämförelse med referensceller användes för identifiering av leukocyter (7).
2.2.2 Analys med Advia 2120
Provet vändes manuellt 10-12 gånger och ca 175 µl blod aspirerades därefter i manuellt slutet system. Provet fördes till blodventilen för spädning med reagens (6).
För att beräkna det totala antalet leukocyter från Baso-kanalen och det absoluta och procentuella antalet basofila granulocyter användes Basofil/lobularitetsmetoden. För lysering av erytrocyter och trombocyter tillsattes Baso reagens innehållande saltsyra (9 mmol/L), ftalsyra (21,5 mmol/L), konserveringsmedel och surfaktant.
22
Behandlingen med reagenset och en temperaturhöjning till 32-34o C i
reaktionskammaren resulterade i att alla leukocyter utom basofila granulocyter förlorade cytoplasman. Cellsuspensionen passerade flödescellen, där cellerna
belystes med laseroptik. Ljusspridning skedde från hög (5-15 o) och låg vinkel (2-3 o) baserat på storleken på cellen eller kärnan och kärnans konfiguration. Med hjälp av fotodioder omvandlades de optiska signalerna till elektriska pulser. Beräkning av basofila granulocyter och det totala antalet leukocyter skedde utifrån Baso- cytogrammet som framställdes genom tolkning av de elektriska pulserna (6,12).
För beräkning av totala antalet leukocyter från Perox-kanalen, lymfocyter, monocyter, neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, LUC och MPXI användes Peroxidasmetoden. Erytrocyter och trombocyter lyserades med Perox 1 reagens innehållande natriumdodecylsulfat (0,36 mmol/L), sorbitol (620 mmol/L), natriumklorid (8,4 mmol/L) och formaldehyd (5,7 %). För att underlätta lyseringen skedde en temperaturökning till 64-72o C i reaktionskammaren. Leukocyterna fixerades av formaldehyd. Färgning skedde med Perox 2 och Perox 3 reagens. Perox 2 reagensets innehåll av 4-kloro-1-naftol (44,8 mmol/L) agerade substrat för
väteperoxiden (0,3 %) i Perox 3 reagenset, vilket gjorde att en mörk fällning bildades vid närvaro av endogen peroxidasaktivitet i cellers granula.
Cellsuspensionen från reaktionskammaren fördes till flödeskyvetten där celler belystes med en halogenlampa. Absorption, till följd av cellens peroxidasinnehåll, mättes vid 0-10 o vinkel och ljusspridning, baserat på cellstorlek, mättes vid 5-15 o vinkel.
För identifiering och beräkning av totala antalet leukocyter, lymfocyter, monocyter, neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, LUC och MPXI användes Perox- cytogrammet (6,12).
2.2.3 Manuell kontroll av prover efter larm från Hemocue WBC Diff
En del av de prover som analyserades på Advia 2120 utan larm och som vid analys med Hemocue WBC Diff fick larm och därmed inga värden på differentialräkningen av leukocyter, plockades ut för kontroll med mikroskopi för att undersöka
23
anledningen till larmet. Samtliga prover hade leukocytvärden mellan 11,0 och 25,0x109/L och alla hade ökat antal neutrofila granulocyter.
Total fyra prover (prov 63-66) plockades ut för manuell mikroskopi. Av dessa var det ett prov som hade tagits inom primärvården (prov 63), resterande kom från sjukhusets avdelningar och mottagningar. Ytterligare fem prover (prov 67-71)
kontrollerades av en legitimerad biomedicinsk analytiker på Hemocues laboratorium.
Dessa prover var alla tagna på sjukhuset.
Blodutstryk framställdes på objektsglas med en automatisk diffstrykare, Hemaprep. 5 µl blod applicerades några mm från klarglasets övergång till mattrand. Då
diffstrykarens spak drogs ner fördes utstrykningsglaset mot bloddroppen, som flöt ut utmed objektsglasets kant. Då spaken släpptes ströks blodet ut med en jämn och snabb rörelse och bildade en blodfilm som gradvis övergick från tjock till tunn film och hade en småfransig avslutning (20).
Glasen lufttorkades och färgades därefter med May-Grünewald-Giemsa pH 6,8, innehållande ospädd May-Grünewaldlösning och Giemsa brukslösning som spätts 1/50 med Sörensens buffert. Vid färgningen placerades objektsglasen i ett ställ som ställdes ner i en bägare med metanol för fixering i 5 minuter. Därefter färgades de i en bägare med May-Grünewaldlösning 1 minut, sköljdes av i vatten och färgades med Giemsa i 25 minuter. Efter färgningen sköljdes glasen av med vatten och ställdes för att lufttorka vid en fläkt (10).
Vid kontroll av proven användes ett ljusmikroskop med 50x och 100x förstoring med immersionsolja (20). Prov undersöktes med avseende på förekomst av omogna celler eller celler med förändrad morfologi. Vid förekomst av ökat antal stavkärniga
granulocyter utfördes differentialräkning av 200 leukocyter och antalet stavkärniga granulocyter kunde uppskattas.
2.2.4 Kvalitetssäkring
Interna kvalitetskontroller används för att kontrollera att analysresultat ligger inom området som man för metoden kalibrerat. Dagliga analyser ger en uppfattning om
24
spridning av mätresultat finns i metoden och om instrumentet fungerar och ger rätt analyssvar (21).
De interna kvalitetskontrollerna på Advia 2120 ligger på tre nivåer; en låg (AD1), en normal (AD2) och en hög (RET H). De analyseras varje morgon, efter byte av reagens och efter att instrumentet gått i standbyläge. Även en normalkontroll från blodgivare används. Den agerar som slask och pool. Poolens analysresultat jämförs mellan de två Advia-instrumenten på laboratoriet (6).
Externa kvalitetskontroller skickas kontinuerligt från Equalis och används för att kontrollera att metoderna på olika laboratorier både nationellt och internationellt överensstämmer och att de håller rätt kvalité (21). Externa kontroller analyseras tio gånger om året och utgörs av färskt EDTA-blod (6).
Kvalitetskontroller på Hemocue WBC Diff utgörs av ett automatiskt självtest som utförs vid start av instrumentet och efter varje mätning för att kontrollera prestandan.
För varje mätning kontrolleras hantering av prov och mikrokyvett, provet,
mikrokyvetten och analyzern. Om kvalitetskontrollen misslyckas anges detta genom ett felmeddelande. I instrumentet finns inlagda referensceller som jämförs med provets celler, vilket fungerar som en kontroll vid analys (7).
2.2.5 Statistiska analyser
För att utvärdera resultaten av de venösa proverna som hade analyserats på Hemocue WBC Diff och på Advia 2120 gjordes en metodjämförelse i Excel där data plottades i ett diagram med regressionslinje med beräkning av korrelation. För att undersöka eventuella systematiska fel (bias) i form av metodfel eller instrumentala fel, gjordes en uppskattning av bias enligt National Committee for Clinical Laboratory Standards EP9-A (22).
För att undersöka metodens variation inom en mätserie utfördes inomserieprecision på Hemocue WBC Diff (21). Två patientprover med leukocytvärden på en hög och en låg nivå valdes ut och analyserades i en serie med 20 replikat. Den höga nivån
25
hade totala leukocyter på 11,5x109/L och den låga nivån 3,1x109/L. Resultaten
sammanställdes i Excel där medelvärde, standardavvikelse (Sd), variationskoefficient (CV) och variationsvidd beräknades.
2.3 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi
2.3.1 Provtagning
Fingertoppen rengjordes med desinfektionsmedel, som sedan fick lufttorka. Prov togs vid sidan av fingerblomman med en lancett med 2 mm stickdjup. De tre första dropparna torkades bort. För att få en tillräckligt stor droppe pressades tummen i riktning mot fingertoppen (7).
2.3.2 Analys med Hemocue WBC Diff
Mikrokyvetten fylldes i ett enda moment genom att kyvettspetsen hölls i ca 45o vinkel mot bloddroppen. 10 µl blod sögs in i mikrokyvetten med hjälp av
kapillärkraft. Överskott av blod torkades bort från mikrokyvettens utsida med en luddfri tork. Kyvetten kontrollerades att den inte hade förekomst av luftbubblor. Den placerades sedan i kyvetthållaren inom 40 sekunder efter fyllningen.
Kyvetthållararmen fördes mot mätläget och kyvetthållaren gled in i instrumentet för mätning. Analys utfördes enligt tidigare beskrivning (7).
2.3.3 Framställning av preparat för manuell differentialräkning av leukocyter
Med hjälp av en mikrokapillär togs blod från fingerblomman (20). Två blodutstryk gjordes per prov. Blodutstryk och färgning av dessa utfördes enligt tidigare
beskrivning.
26
2.3.4 Differentialräkning av leukocyter med manuell mikroskopi
Manuell differentialräkning utfördes i ljusmikroskop med 50x och 100x förstoring med immersionsolja. 100 celler räknades per glas. Totalantalet av varje celltyp togs fram genom att den procentuella fördelningen av respektive celltyp räknades om baserat på det totala antalet leukocyter, som erhållits från Hemocue WBC Diff (20).
2.3.5 Statistiska analyser
Resultaten av differentialräkningen av leukocyter med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi sammanställdes i Excel. En regressionslinje bestämdes och en uppskattning av bias utfördes enligt National Committee for Clinical Laboratory Standards EP9-A (22).
3. RESULTAT
3.1 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120
Korrelation sågs vid låga såväl som förhöjda nivåer av totala antalet leukocyter med en korrelationskoefficient, R, på 0,99 (figur 6). Figur 7 visar uppskattning av det systematiska felet, bias. Större spridning av värdena ses vid högre leukocytnivåer.
Figur 6. Resultatet av totala antalet leukocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)
27
Figur 7. Resultatet av uppskattning av bias gällande totala antalet
leukocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff
Korrelationen mellan instrumenten vid analys av neutrofila granulocyter var mycket god, 0,99. Resultaten överensstämde något sämre vid högre nivåer, (figur 8). Figur 4 visar uppskattningen av bias gällande neutrofila granulocyter. Bäst resultat sågs vid värden som låg inom referensområdet, 1,8-6,8x109/L. Vid högre värden sågs högre variation mellan instrumenten. Spridningen i analysresultat var mindre gällande neutrofila granulocyter än spridningen för totala antalet leukocyter (figur 9).
Figur 8. Resultatet av antalet neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)
28
Figur 9. Resultatet av uppskattning av bias gällande neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff
En god korrelation sågs även vid beräkning av lymfocyter (0,99). Få höga värden erhölls i studien så därför låg få värden i det övre referensområdet på 4,0x109/L. En patient visade mycket högre värde än övriga på båda instrumenten. Detta värde, 13,3 x109 lymfocyter/L på Advia 2120, blev 13,2 x109 lymfocyter/L på Hemocue WBC Diff. När detta värde räknades bort blev korrelationskoefficienten 0,94.
Höga värden skiljde sig inte mer åt mellan instrumenten än vad de lägre värdena gjorde. Detta kan ses i figur 11, där skillnad i analysresultat ses både på låga och något högre nivåer.
Figur 10. Resultatet av antalet neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)
