Kan cyklodextrin användas för att motverka ateroskleros?
En systematisk litteraturstudie
Författare: Philip Bårman Handledare: Anna Asplund Examinator: Alf Månsson
Examensarbete, 15 hp
Förord
Examensarbete i biomedicinsk vetenskap, 15 hp.
Filosofie kandidatexamen med huvudområde biomedicinsk vetenskap
Författare: Philip Bårman
Hälsovetenskapliga programmet, 180 hp Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Linnéuniversitetet i Kalmar
Handledare: Anna Asplund Persson, universitetslektor Institutionen för kemi och biomedicin Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Linnéuniversitetet i Kalmar
Examinator: Alf Månsson, professor
Institutionen för kemi och biomedicin Fakulteten för hälso- och livsvetenskap Linnéuniversitetet i Kalmar
Abstrakt
Bakgrund: Ateroskleros är den främsta bakomliggande orsaken till att människor avlider i hjärt- och kärlsjukdomar. Karaktäristiskt för ateroskleros är att plack uppkommer som en följd av LDL-retention i blodkärlens väggar, vilket sätter igång en inflammation. Cyklodextrin har visat sig vara bra på att ta upp kolesterol samt transportera läkemedel. Det är därför intressant att undersöka dess potentiella möjlighet att behandla ateroskleros.
Syfte: Studiens syfte är att undersöka om cyklodextrin-derivat kan användas för direkt behandling av ateroskleros och indirekt som en del av en nanopartikels-behandling.
Metod: En systematisk litteraturstudie genomfördes där sju artiklar från PubMed mellan 2015 och 2020 studerades. Studierna var utförda på ApoE-knockoutmöss. Sökorden var;
Cyclodextrin, atherosclerosis, cholesterol, inflammation och plaque.
Resultat: Alla studier visade minskad plackbildning. Två cyklodextrin-derivat minskade dock inte plackbildning. De studier som undersökte kolesterolkristallisering visade att det minskade.
Studierna som använde nanopartiklar visade att antalet makrofager minskade och att kollageninnehållet ökade, vilket inte sågs i studierna som använde cyklodextrin-derivat.
Proinflammatoriska markörer minskade både i studierna som använde nanopartiklar och de som använde cyklodextrin-derivat.
Slutsats: Cyklodextrin-derivaten och nanopartiklarna påverkade faktorer positivt utifrån ett behandlingsperspektiv. Dock går det inte att säga vilken klinisk relevans förändringarna hade.
Fler studier är nödvändiga för att förstå vilken klinisk betydelse dessa förändringarna har.
Nyckelord
Ateroskleros, cyklodextrin, nanopartiklar, ApoE-knockoutmöss
Abstract
Background: Atherosclerosis is the most common underlying cause of cardio-vascular death worldwide. It is characterized by the development of plaque due to LDL retention in the blood vessel wall, which induces an inflammatory response. Cyclodextrin has been proven a good cholesterol-acceptor and to transport hydrophobic drugs. It is therefore of interest to investigate its potential to treat atherosclerosis.
Aims: The aims of this study are to examine derivates of cyclodextrin for a direct effect on atherosclerosis and the use of cyclodextrin as a part of nanoparticles for an indirect effect.
Method: A systematic literature study was performed, in which seven articles from PubMed between 2015 and 2020 were examined. The search words were; Cyclodextrin, atherosclerosis, cholesterol, inflammation and plaque.
Result: The articles demonstrated a reduced plaque development, however two cyclodextrin derivates did not. The articles which investigated cholesterol crystallization showed a
reduction. A decrease in macrophage number and an increase in collagen content were shown in the articles using nanoparticles but not in the articles using cyclodextrin derivatives.
Proinflammatory markers decreased in both the studies using nanoparticles and the studies using cyclodextrin derivates.
Conclusion: The cyclodextrin derivates and the nanoparticles improved some factors positively from a treatment perspective. However, it is not possible to conclude anything about the
clinical relevance of these findings.
Keywords
Atherosclerosis, cyclodextrin, nanoparticles, ApoE-knockout mice
Tack
Först vill jag rikta ett stort tack till min handledare Anna Asplund som med sitt engagemang och för mycket god vägledning hjälpt mig under arbetet. Jag vill sedan tacka min flickvän för ett stort stöd och visat tålamod under arbetet med uppsatsen. Till sist vill jag tacka alla som tagit sig tid att korrekturläsa arbetet.
Förkortningar
Apo Apolipoprotein
ApoE-/- ApolipoproteinE-knockoutmöss βCDP Beta-cyklodextrin polymer CD36 Cluster of differentiation 36
2HPβCD 2-hydroxypropyl-beta-cyklodextrin HDL High-density lipoprotein
H2O2 Väteperoxid IFNγ Interferongamma IL Interleukin
LPCD NP Luminol-betacyklodextrin-nanopartikel MβCD Metylerad beta cyklodextrin
MerTK Mer-tyrosin kinas receptorn MMP Matrix metalloproteinas
Ox-LDL Oxiderat low-density lipoprotein PBAP Fenylborsyra-pinacol-ester
PLGA Poly lactic-co-glycolic acid RAP Rapamycin
ROS Reaktiva syreföreningar SMC Glattmuskelceller SRs Scavengerreceptorer Th1 T-hjälparcell-1
TNF-α Tumörnekrosfaktoralfa
TPCD Tempol-fenylborsyra-pinacol-ester-cyklodextrin Tpl Tempol
WD Västerländsk diet
VSMC Vaskulära glattmuskelceller
Innehållsförteckning
1 Inledning 1
2 Bakgrund 2
2.1 Cyklodextrin 2
2.2 Cyklodextrins egenskaper 2
2.2.1 Cyklodextrin som nanopartikel 2
2.3 Ateroskleros 3
2.3.1 Aterosklerosprocessen 3
2.4 Djurförsök 6
2.4.1 Djurstudier 6
2.4.2 Möss 6
3 Syfte 7
3.1 Syfte 7
4 Metod 8
4.1 Studiedesign och datainsamling 8
4.2 Inkluderande och exkluderande kriterier 8
4.3 Val av artiklar 8
5 Resultat 9
5.1 Studiedesign 9
5.2 Ateroskleros och cyklodextrin 10
5.2.1 Cyklodextrins inverkan på ateroskleros Fel! Bokmärket är inte definierat.
5.2.2 Studier med cyklodextrin som nanopartikel 10
5.2.3 Studier med cyklodextrin-derivat 17
6 Diskussion 24
6.1 Metoddiskussion 24
6.2 Resultatdiskussion 25
6.2.1 Cyklodextrin som nanopartikel 25
6.2.2 Cyklodextrin-derivat 29
7 Slutsats 31
8 Referenser 1
1 Inledning
Hjärt- och kärlsjukdomar är de främsta orsakerna till död i världen. Enligt statistik från Världshälsoorganisationen (WHO) stod hjärt- och kärlsjukdomar år 2016 för cirka en tredjedel av alla dödsfall, vilket motsvarar ungefär 17,9 miljoner människor. Majoriteten av dödsfallen berodde på hjärtinfarkt eller stroke (1). Ateroskleros är vanligt förekommande i västvärlden (2) och den största orsaken att människor dör i hjärtinfarkter (3).
Ateroskleros innebär att det sker förändringar i blodkärlen som gör dem trängre (2). Det tar flera år att utveckla ateroskleros och det ger i tidiga stadier inga symtom. Det är en orsak till att det är flest äldre människor som drabbas av symtom och blodproppar. Ett av de mest karaktäristiska kännetecknen för ateroskleros är bildandet av plack i blodkärlen. Placken kan uppkomma av skador på endotelceller och av en hög halt low-density lipoprotein (LDL) i blodet. När LDL- kolesterolet ackumuleras i blodkärlsväggen oxideras det och sätter igång en inflammationsprocess. Vid inflammation aktiveras immunförsvaret och det är denna aktivering som ger upphov till plackbildningen. Plack delas in i stabila och instabila plack. Risken för att stabila plack brister är mindre än för instabila plack. Plack som brister aktiverar trombocyter så att blodproppar bildas och beroende på var detta sker kan det ge upphov till hjärtinfarkt, stroke, och, i förlängningen, hjärtsvikt. Primär-preventionen som används för att minska risken för ateroskleros inriktar sig framförallt på livsstilsförändringar. Rekommendationerna innebär bland annat en bra kost, regelbunden fysisk aktivitet och rökstopp. När detta inte är tillräckligt behöver behandling sättas in (2).
Ateroskleros behandlas i första hand med statiner och de är välfungerande. Alla individer svarar dock inte på statinbehandling och det finns individer som inte tål dem (3). Cyklodextrin är en oligosackarid som kan fås genom att bryta ned stärkelse med hjälp av enzymer. Dess hydrofila och hydrofoba egenskaper utnyttjas inom läkemedelsindustrin för att modifiera läkemedel. Det handlar bland annat om att göra hydrofoba läkemedel mer lösliga, att få en mer kontrollerad frisättning av läkemedel och att öka absorptionen av läkemedel (4). Användning av cyklodextrin mot ateroskleros är också intressant för att det har visats att cyklodextrin kan avlägsna kolesterol från celler (4, 5).
2 Bakgrund
2.1 Cyklodextrin
Cyklodextriner tillhör gruppen cykliska oligosackarider och utvinns genom att stärkelse bryts ner med hjälp av enzymer. Det tre naturligt mest förekommande och använda formerna av cyklodextriner, är alfa (α), beta (β) och gamma (γ). Inom läkemedelsindustrin har cyklodextriner många användningsområden. Det beror på att de har låg toxicitet, är lättillgänglighet, billiga och de har dessutom låg immunigenkänning. Den främsta användningen av cyklodextriner är med syfte att öka vattenlösligheten och biotillgängligheten hos hydrofoba läkemedel (4). De användas också för att minska interaktioner mellan läkemedel, för att öka permeabiliteten genom cellmembran, för att kontrollera läkemedelsfrisättning och för att minska systemisk eller lokal toxicitet (4).
2.2 Cyklodextrins egenskaper
Cyklodextrin består av minst sex och maximalt nio D-glukopyranos enheter/molekyler.
Molekylerna hålls ihop med alfa- 1,4 glykosidbindningar; α-CD, β-CD och γ-CD består av sex, sju respektive åtta D-glukopyranos molekyler (4). Cyklodextrin är ihålig med en hydrofil utsida och en lipofil insida. Den hydrofila egenskapen gör cyklodextrinerna vattenlösliga vilket möjliggör transport i blodet. Den lipofila insidan gör det möjligt att transportera fettlösliga läkemedel samt att ta upp kolesterol och lipider när insidan inte transporterar substanser. α-CD är den av cyklodextrinerna som har den minsta diametern vilket begränsar användningen som transportör av läkemedel. Diametern begränsar α-CDs förmåga att binda till och ta upp kolesterol, dock har den hög affinitet för fosfolipider (4, 5). γ-CD används inte i större utsträckning på grund av att den är dyr att framställa (4). β-CD har störst affinitet för kolesterol och är den mest använda av de olika cyklodextrinerna. Den naturliga formen av β-CD har låg vattenlöslighet. För att öka vattenlösligheten kan β-CD kemiskt modifieras för att framställa olika cyklodextrin derivat till exempel genom metylering eller hydroxypropylering (6).
2.2.1 Cyklodextrin som nanopartikel
Nanopartiklar kan användas inom läkemedelsindustrin för att bland annat öka stabiliteten, transportera-, samt att få en mer kontrollerad och precis frisättning av läkemedel (7). Tack vare att nanopartiklar är väldigt små kan de ta sig över membran, blodkärl och ut i vävnader. De kan dessutom fagocyteras av makrofager när de binder till deras receptorer, en process som kallas
opsonisering. CD och CD-derivat har framförallt använts för att öka lösligheten hos läkemedel som har låg vattenlöslighet. De kan bära läkemedel i det lipofila hålrummet (8). Rapamycin (RAP) är ett läkemedel som använts i djurstudier och har visats kunna minska ateroskleros. Dock ger RAP negativa systemiska effekter och har låg vattenlöslighet när de ges enskilt. Detta kan motverkas om RAP konjugeras till det lipofila hålrummet hos β-CD (9). Andra substanser kan konjugeras till cyklodextrineras yta vilket beror på CD-molekylens funktionella grupper (7).
Fördelen med detta är att det gör det möjligt att få en precis transport till ett visst område i kroppen (8). Till exempel kan en funktionell grupp som är pH-känslig eller reaktiva syreföreningar (ROS)-scavenger konjugeras till CD. Det gör att dessa grupper kan transporteras till områden med ett förändrat pH eller där ROS produktion är hög (9, 10). CD som har ett läkemedel bundet till sig gör att läkemedlet kan frisättas långsammare för att det inte bryts ned lika lätt av kroppen.
Det innebär att lägre doser kan ges och dessutom mer sällan (8).
2.3 Ateroskleros
Ateroskleros är idag betraktat som en inflammatorisk sjukdom, med stor involvering av immunförsvaret (11). Typiskt för ateroskleros är förändringar och skador i det subendoteliala utrymmet i blodkärlens väggar. Förändringarna ger upphov till plackbildning och uppstår på grund av lipidansamling i intiman, inflammation, cellapoptos och nekros samt glattmuskelproliferation. Dessa faktorer skapar en kronisk inflammation, vilka underhåller aterosklerosprocessen (11).
2.3.1 Aterosklerosprocessen
Kolesterol är betraktat som en av de främsta orsakerna till utveckling av ateroskleros. Det börjar med att LDL-kolesterol tar sig till tunica intima i det subendoteliala utrymmet. LDL är en produkt av den endogena vägen i lipidmetabolismen. LDL kan ta sig igenom endotelcellerna vilket det dels gör genom aktiv transcytos, där LDL binder till transportörerna SR-BI och Alk1 (12) och dels på grund av skador på endotelet (2). LDL i intiman binder med hjälp av apolipoproteinB(Apo)-100 till proteoglykaner, vilket leder till LDL retention och ackumulering i intiman (11).
Att LDL hålls kvar i intiman av proteoglykanerna har stor betydelse i aterogenesen (13). Celler i blodkärlet reagerar när LDL har bundit till proteoglykaner och gör att LDL oxideras (Ox-LDL).
Ox-LDL reagerar med reaktiva syreföreningar (ROS), vilket gör att oxidationen av LDL går snabbare. Det bildas även ämnen som får ApoB-proteinerna att oxidera, vilket resulterar i att
ApoB-proteinernas aminosyrakedja förändras. Från blodkärlscellerna frisätts kemotaktiska substanser; monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) och macrophage colony stimulating factors (M-CSFs), vilket gör att monocyter lockas till området. I den här fasen kan ox-LDL och förändrade ApoB-proteiner binda till makrofager, vilket sker genom att ox-LDL-ApoB- proteinkomplexet binder till scavengerreceptorer (SRs) hos makrofager (11). Det finns olika typer av SRs och beroende på vad LDL reagerar med och hur det har förändrats, varierar receptorernas affinitet för LDL (14). Två övergripande typer av SRs är; klass A SR AI / II och klass B cluster of differentiation 36 (CD36) (11). Affiniteten hos SRs klass A och B är hög gällande ox-LDL och LDL dit en acetylgrupp har bundit (14). Fagocyterande celler med SRs i det medfödda immunförsvaret har ingen negativ feedbackmekanism. LDL-upptag via LDL- receptorer fungerar normalt med negativ feedback, det vill säga att när kolesterolnivåer intracellulärt har nått en viss nivå kommer inte mer att tas upp. Fagocyterande celler med SRs kommer att ta upp ox-LDL så länge dessa finns extracellulärt (12).
Ox-LDL ger en rad proinflammatoriska effekter i intiman. Adhesionsmolekyler, speciellt vascular celladhesion molecule-1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) och E-selektin uttrycks på endotelcellernas yta, dit monocyter och leukocyter binder (11). Om endotelcellerna är skadade aktiveras transkriptionsfaktorn NFκB, vilket leder till att fler adhesionsmolekyler uttrycks på endotelcellernas ytor. Monocyter kommer att differentiera till makrofager, som fagocyterar ox-LDL (12).
Då aterosklerosprocessen fortskrider kännetecknas den av att både det medfödda- och adaptiva immunförsvaret involveras (15). Det finns två typer av makrofager i plack; M1-makrofager och M2-makrofager. M1 bidrar till ökad inflammation och M2 har anti-aterosklerotiska effekter.
Fagocyterat ox-LDL leder till att lipider och kolesterol ackumuleras i makrofagernas cytoplasma vilka bildar skumceller (11). Uppkomsten av skumceller betraktas som ett av de tidigaste tecknen på ateroskleros. CD36-receptorer har visat sig vara av stor betydelse för uppkomsten av skumceller. Aktivering leder till att fler CD36-receptorer uppregleras och att mer ox-LDL tas upp. Toll-like–receptorer aktiveras också av CD36 och bidrar till skumcellsbildning och aktivering av det medfödda immunförsvaret. Skumceller av M1 karaktär frisätter cytokiner och kemotaktiska substanser som fungerar proinflammatoriskt och rekryterar celler i immunförsvaret (12, 14). Interleukin-1β (IL-1β) är en de inflammatoriska meditorerna som upprätthåller och har stor betydelse i aterogenesen på grund av positiv feedback. Under aterogenesen ansamlas kolesterolskristaller i intiman och i makrofagernas cytoplasma (2, 12).
Kolesterolkristaller i makrofager och i skumceller kan göra att proinflammatoriskt-IL-1β klyvs till IL-1β (12, 16). Andra proinflammatoriska cytokiner från T-hjälparcell-1 (Th1) som särskilt kan kopplas till ateroskleros är bland annat; IL-6, tumörnekrosfaktoralfa (TNF-α), interferongamma (IFNγ) och IL-1α. IL-6 kan användas som markör i blodprov för att undersöka om det föreligger en inflammation. Höga IL-6 värden visar om en akut eller kronisk inflammation föreligger och tenderar att vara högre oss personer med hjärt- och kärlsjukdomar (17). Inflammatoriska cytokiner aktiverar ROS-produktion och proteaser bland annat matrix metalloproteinas-1 och 9 (MMP-1 & 9). M2-makrofager kan frisätta cytokiner bland annat; IL- 4, IL-10, IL-13 och IL-17 som är inflammationshämmande (11).
När mer ox-LDL tas upp av makrofager och fler skumceller bildas, leder detta till apoptos av skumcellerna. När M2-makrofager tar upp skumceller och apoptotiska celler kallas det för efferocytos. Makrofager tar upp apoptopiska celler via mer-tyrosin kinas receptorn (MerTK) och fagocyterar dem. (12). Apoptosen har i ett tidigt skede av aterosklerosprocessen en skyddande effekt. Att apoptos initieras i cellerna beror på att cellen inte hinner transportera bort fritt kolesterol. En stor mängd fritt kolesterol är toxiskt för celler och inducerar en stressreaktion på det endoplasmatiska retiklet (ER) i cellen (18). Från ER frisätts CCAAT-enhancer-bindande protein (CHOP), vilket i sin tur gör att kalcium frisätts från ER. Mitokondrier frisätter proteinet cytokrom C, vilket inducerar en kaskadreaktion, som får cellen att gå i apoptos. Den skyddande effekten av apoptosen försvinner när apoptotiska celler ackumuleras. Det leder till att MerTK på makrofagerna inaktiveras vilket gör efferocytosen otillräcklig i förhållande till behovet. Då det sker kan en sekundär nekros sättas igång. Under den sekundära nekrosen brister apoptotiska celler för att de under en längre tid utsatts för ox-LDL. När de brister frisätts inflammationsmediatorer, som aktiverar immunsystemet och dess celler. En mer utvecklad och allvarlig ateroskleros innehåller mer av det som karaktäriserar nekrotiska processer. När nekrotiska celler ackumuleras i placken upprätthålls inflammatoriska processer, vilket bidrar till en ökad bristningsbenägenhet hos placken (12).
Plack kan delas in i två grupper beroende på deras morfologi; stabila och instabila. Stabila plack är mindre benägna att brista då utvecklingen av dem går långsammare. Proliferation av SMC ökar stabiliteten då dessa celler producerar kollagen vilket gör den fibrösa kapseln tjockare (2).
Däremot är instabila plack mer benägna att brista vilket ökar risken för trombos som kan leda till hjärtinfarkter. Instabila plack kännetecknas av en nekrotisk kärna som består av nekrotiska celler och mycket lipider vilket underhåller inflammationsprocessen (16). Kollageninnehållet i den
fibrösa kapseln bryts ner av olika MMP. SMC bryts ner av olika inflammatoriska celler som gör att kapseln blir tunnare och mer benägen att brista (19).
2.4 Djurförsök
2.4.1 Djurstudier
Sedan år 1908 har försöksdjur haft en stor betydelse för att förstå den underliggande patologin vid ateroskleros (20). Det har också bidragit till en ökad förståelse för hur kosten och miljön inverkar (21). En av de främsta orsakerna till att djur används är att bildningen av plack går snabbare hos dem än hos människor, vilket i sin tur beror på att djuren får en västerländsk kost med mycket kolesterol, att gener inblandade i metabolismen kan manipuleras och möjligheten att studera riskfaktorer. Djurförsök har gjort det möjligt att förstå plackbildning och hur plack utvecklas över tid och vilka olika celler och molekyler som har en betydande roll i aterosklerosprocessen. Det har också bidragit till förståelsen för hur blodproppar uppkommer när plack brister, vilket kan leda till exempelvis hjärtinfarkt (22). Tack vare djurförsök har höga kolesterolnivåer identifierats som en drivande kraft i uppkomsten av ateroskleros, vilket har varit en betydelsefull upptäckt (20). Djurförsök har fortfarande en viktig funktion för att testa nya behandlingar mot ateroskleros (22).
2.4.2 Möss
Möss är de djur som idag används mest frekvent för att studera aterosklerosprocessen. Det beror på möjligheten att manipulera gener, att reproduktionen går snabbt och att utvecklingen av ateroskleros hos möss bara tar några månader (20, 22). Detta förutsätter att mössen är genmanipulerade eftersom möss är naturligt motståndskraftiga mot att utveckla ateroskleros, dels på grund av en annorlunda metabolism av lipider dels på grund av att LDL-kolesterolet endast finns i låga koncentrationer. Kolesterol hos möss transporteras med hjälp av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol till skillnad från människor där transporten sker via både LDL och HDL. Av de anledningarna kräver studier av möss att lipidmetabolismen kan manipuleras (22).
En vanlig typ av möss som används för att studera ateroskleros är apolipoproteinE-knockoutmöss (ApoE-/-), som saknar apolipoprotein E (23).
2.4.2.1 ApoE-/--möss
De mest använda för att studera aterogenes är ApoE-/--möss (23). ApoE är ett glykoprotein som binder till LDL-receptorer och bidrar till att kylomikroner och very low-density lipoprotein
(VLDL) kan tas upp i levern (23). Det är inblandat i många andra funktioner i kroppen, bland annat immunreglering, kolesterolhomeostas och omfördelning av kolesterol mellan olika vävnader (22).
Avsaknaden av ApoE gör att höga koncentrationer av kolesterol finns i plasman hos dessa möss.
Vilda möss har en kolesterolkoncentration i plasman på omkring 75–110 milligram/deciliter.
Koncentrationen hos ApoE-/--möss kan vara mer än fyrdubblad och ligga mellan 400–600 mg/dl vid en normal diet. Får mössen en högfettdiet kan koncentrationerna stiga till det dubbla (20, 22).
Aterogenes börjar hos dessa möss några veckor efter födseln, där det går att urskilja ateroskleroslesioner (21). Inom två till tre månader kan en markant aterosklerosutveckling ses hos mössen. Ateroskleros hos ApoE-/--möss liknar den som uppkommer hos människor. Plack hos möss bildas, liksom hos människor, i de delar av artärträdet där blodkärlen delar sig.
Dessutom följer bildningen av ateroskleros, samma steg som hos människor (22).
2.4.2.2 Fördelar och nackdelar med ApoE-/--möss
ApoE-/--möss har höga kolesterolnivåer vid en normal diet. De utvecklar ateroskleros utan att forskare behöver använda högfettdieter vilka i sig kan vara toxiska (20). Det finns dock en del nackdelar att förhålla sig till angående ApoE-/--möss. De har en lipidprofil som skiljer sig från människor. Hos människor är det LDL-kolesterol som orsakar ateroskleros. Den dominerande lipiden i plasman hos ApoE-/--möss är VLDL. En annan nackdel med ApoE-/--möss är att ApoE proteinet fungerar antiinflammatoriskt och antioxiderande vilket är skyddande effekter.
Plackbildningen behöver därmed inte vara orsakad av mycket kolesterol och lipider utan av inflammationsprocesser. Det är ovanligt att ApoE-/--möss utvecklar instabila plack och att plack brister, vilket begränsar möjligheten att få kunskap kring detta (20, 22).
3 Syfte
3.1 Syfte
Syftet med litteraturstudien är att studera om cyklodextrin direkt eller indirekt kan användas för att motverka ateroskleros samt utöka möjligheterna till behandling. För att undersöka de direkta effekterna studeras derivatformerna av cyklodextrin. De indirekta effekterna studeras när cyklodextrin är en del av nanopartiklar och bärare av aktiva substanser. Det primära syftet är att
undersöka hur de påverkar plackackumulering, plackbildning, plackinnehåll och inflammatoriska markörer.
4 Metod
4.1 Studiedesign och datainsamling
Arbetet är en systematisk litteraturstudie. Artiklarna i arbetet har sökts fram ur databasen Pubmed från december 2019 till februari 2020. I Pubmed genomfördes tre olika sökningar med olika sökord och begränsande filtrering. I den första sökningen användes sökorden: Cyclodextrin AND Atherosclerosis AND Cholesterol. Därefter filtrerades sökningen genom att välja de fem senaste åren samt ”other animals”. Sökningen gav 11 träffar. I den andra sökningen användes sökorden:
Cyclodextrin AND Atherosclerosis AND Inflammation. Den filtrerades likadant som den första sökningen. Sökningen gav 9 träffar. Den sista sökningen använde sökorden: Cyclodextrin AND Atherosclerosis AND Plaque. Den filtrerades endast för de fem senaste åren och gav 10 träffar.
De tre sökningarna gav totalt 30 artiklar varav 7 valdes ut för att ingå i litteraturstudien.
4.2 Inkluderande och exkluderande kriterier
För att avgöra vilka artiklar som skulle utgöra litteraturarbetet tillämpades inkluderande och exkluderande kriterier. Dessa kriterier var artiklarna tvungna att uppfylla för att inkluderas i studien.
Inkluderande kriterier: Originalartikel, år 2015–2020, in vivo, ApoE-/-, etiskt godkännande eller utförd i överstämmelse med riktlinjer och lagar, LDL-kolesterol, ROS.
Exkluderande kriterier: In vitro, människor, LDLr -/- möss 4.3 Val av artiklar
För att välja ut de artiklar som skulle vara en del av litteraturarbetet, lästes alla abstrakt. I flödesschemat (figur) visas sökprocessen samt val av artiklar. Sammanlagt gav sökningarna 30 träffar, 23 artiklar exkluderades utifrån de inkluderande och exkluderande kriterierna.
Figur 1. Flödesschema över artikelssökningarna. Visar använda sökord, sökfiltrering, antal träffar samt antal valda artiklar.
5 Resultat
5.1 Studiedesign
Det ingick sju artiklar i litteraturstudien. Alla artiklar grundade sig på djurförsök och involverade experiment på ApoE-/--möss. Antalet möss som användes i försöken varierade mellan 22 och 60.
Alla studier hade minst en experiment- och en kontrollgrupp. I tabell 1 och 2 redovisas artiklarnas olika studiedesign (9, 10, 24-28).
Tabell 1. Studiernas författare, publiceringsår och annan information för artiklarna där nanopartiklar studerades.
Författare Studielängd (veckor)
Behandlingstid (veckor)
Tillförsel av nanopartikel
Nanopartikel
Wang et al. 2018 12 8 i.v. TPCD NP (βCD)
Dou et al. 2017 12 8 i.p RAP/Ac-βCD NP &
RAP/Ox-βCD NP
Guo et al. 2019 8 & 12 12 dag & 8 i.p LPCD NP (βCD)
Intravenöst (i-v), intraperitoneal (i.p); Tempol-fenylborsyra-pinacol-ester-cyklodextrin (TPCD);
rapamycin/acetylerad betacyklodextrin (Ac- βCD); rapamycin/fenylborsyra pinacol ester-betacyklodextrin (Ox- βCD), luminol-betacyklodextrin (LPCD).
Sökning 1
Cyclodextrin AND Atherosclerosis AND Cholesterol
Filtrering:
Other animals, 5 senaste åren
Antal träffar:
11 träffar
Valda artiklar:
4 st
Sökning 2
Cyclodextrin AND Atherosclerosis AND
Inflammation
Filtrering:
Other animals, 5 senaste åren
Antal träffar:
9 träffar
Valda artiklar:
2 st
Sökning 3
Cyclodextrin AND Atherosclerosis AND Plaque
Filtrering:
5 senaste åren
Antal träffar:
10 st
Valda artiklar:
1 st
Tabell 2. Studiernas författare, publiceringsår och annan information för artiklarna där cyklodextrin och cyklodextrin-derivat studerades.
Författare Studielängd (veckor)
Behandlingstid (veckor)
Tillförsel av CD- derivat
CD-derivat
Zimmer et al. 2016 8 & 12 8 & 4 Sub-Q 2HPβCD
Heegon et al. 2020 16 4 Sub -Q 2HPβCD & βCDP
Sakurai et al. 2017 11 11 Peroral α-CD & β-CD
Montecucco et al.
2015
22 & 27 11 & 16 i.p MβCD
Cyklodextrin (CD); subkutant (Sub-Q); intraperitoneal (i.p); 2-hydroxypropyl-beta-cyklodextrin (2HPβCD), beta- cyklodextrin polymer (βCDP), alfa-cyklodextrin (α-CD), beta-cyklodextrin (β-CD), metylerad-beta-cyklodextrin (MβCD).
5.2
Ateroskleros och cyklodextrin5.2.1 Studier med cyklodextrin som nanopartikel 5.2.1.1 Studie 1 – Wang et al.
Studiedesign
I studien av Wang et al. användes olika doser av TPCD NP, en lågdos á 50 mg/kg och en högdos á 100 mg/kg. TPCD NP är en nanopartikel med ett brett spektrum av ROS-scavenger-egenskaper.
Substanserna Tempol (Tpl) och fenylborsyra-pinacol-ester (PBAP) konjugerades till β-CD. Tpl är en scavenger av fria radikaler och PBAP har visat sig kunna eliminera väteperoxid (H2O2).
Två kontrollgrupper fick två kontrollsubstanser; rent Tpl á 17,2 mg/kg och Probukol á 5,17 mg/kg. Probukol har i studier på möss visat sig minska ateroskleros på grund av att substansen har antioxiderande effekter. En placebogrupp användes som fick saltvattenslösning (Salin).
Femtio hanmöss delades slumpmässigt upp i fem grupper efter en månad för att studera TPCD NP som aterosklerosbehandling. Mössen fick en högfettdiet under hela försöket och behandlades en gång i veckan (10).
Plackbildning
Plackutvecklingen i hela aorta mättes efter 12 veckors högkolesteroldiet och 8 veckors behandling. Placebogruppen utvecklade cirka tre till fyra gånger mer plack jämfört med mössen som behandlades med TPCD NP 50 mg/kg samt TPCD NP 100 mg/kg (p <0,001). Mössen som behandlades med Probukol hade hälften så mycket plack som placebogruppen (p <0,001). TPCD-
grupperna hade utvecklat mindre plack än Tpl- och Probukol-gruppen (p <0,001 resp. p <0,05) (10).
Fryssnitt från aortabågen, arm-huvudartären och aortasinus visade att TPCD NP låg- högdosgrupperna hade utvecklat mindre plack i artärernas kärlväggar jämfört med placebogruppen (p <0,05 och p <0,001). Mössen som behandlades med TPCD NP hade mindre plackbildning jämfört med mössen som behandlades med Probukol och Tpl (10).
Plackinnehåll
Mössen som behandlades med en låg- respektive högdos TPCD NP hade cirka fyra och fem gånger lägre kolesterolkristallisering jämfört med placebogruppen. Mössen som behandlades med Tpl och Probukol hade cirka fem och tre gånger mer kolesterolkristaller än mössen som behandlades med en högdos av TPCD (p <0,01 resp. p <0,05). Inga signifikanta skillnader kunde påvisas mellan TPCD NP-lågdos och Tpl samt Probukol. Mellan grupperna som behandlades med TPCD NP fanns ingen skillnad (10).
Mössen i placebogruppen och de som fick Tpl behandling hade cirka 2,5 och tre gånger fler makrofager jämfört med de som blev behandlade med TPCD NP i låg- och högdos (p <0,01). De möss som fick en högdos-behandlingen med TPCD NP visade ungefär hälften så många makrofager jämfört med Probukol-behandling (p <0,05). Behandling med en lågdos TPCD NP och Probukol visade ingen skillnad. Mössen som fick probukol behandling hade cirka två gånger färre makrofager jämfört med Tpl-behandling (p <0,05) (10).
Halterna MMP-9 i placebogruppen var nästan fyra gånger högre än hos mössen som fick en lågdos TPCD NP (p <0,01). MMP-9 var nästan fem gånger högre i placebogrupperna än hos mössen som fick en högdos TPCD NP (p <0,001). MMP som behandlades med en lågdos TPCD NP hade MMP-9 halterna mer än Tpl-behandlingen (p <0,01). Behandlingen med Probukol minskade MMP-9 halterna mer än Tpl-behandlingen (p <0,05). Mellan Probukol- och TPCD NP- behandling var det ingen skillnad (10).
Mössen som fick TPCD NP behandling i låg- och högdos hade cirka tre gånger mer VSMC (p
<0,01 resp. p <0,001). De möss som behandlades med TPCD NP i låg- och högdos hade cirka två till två och en halv gånger mer VSMC jämfört med de möss som behandlades med Tpl (p
<0,01 resp. p <0,001). Probukol-gruppen hade mer VSMC än Tpl-gruppen (p <0,05). Mellan TPCD NP- och Probukol-behandling fanns ingen skillnad (10).
TPCD NP behandlingen i låg- och hög dos minskade nekros i placken med cirka 54 % respektive 62,5 % jämfört med placebogruppen (p <0,01). Mängden nekros i placken var cirka två och en halv till tre gånger mindre vid TPCD NP-behandling jämfört med Tpl-behandling (p <0,01).
Probukol-gruppen hade två gånger mindre nekros i placken än Tpl-gruppen (p <0,05). Ingen skillnad fanns mellan Probukol och TPCD NP-behandling (10).
Behandlingarna med TPCD NP minskade kolesterolkristallisering, antalet makrofager, halten MMP-9, nekros samt ökade vaskulära glattmuskelceller jämfört med placebogruppen och Tpl behandlingen. Dock var det ingen skillnad mellan en lågdos TPCD NP, Probukol och Tpl vad avser makrofager. Det var ingen skillnad mellan TPCD NP- och Probukol-behandlingen vad avser plackinnehållet. En hög dos av TPCD sänkte antalet makrofager mer än Probukol behandlingen.
Plackstabilitet
Kollagen i placken var cirka 2–2,5 gånger högre vid en låg- och högdos av TPCD NP jämfört med placebo- och Tpl-behandling (p <0,001). Probukol-gruppen hade ungefär 1,5 gånger mer kollagen i placken än placebogruppen (p <0,05). Det var ingen skillnad mellan TPCD NP- grupperna och Probukol-gruppen. Mössen som fick TPCD NP-behandling hade mer kollageninnehåll i placken jämfört med mössen som fick Tpl behandling samt de som fick placebosubstansen (10).
Inflammationsmarkörer
Mössen som behandlades med en lågdos TPCD NP hade cirka 33 µg/ml lägre plasmakoncentrationerna av ox-LDL jämfört med placebogruppen som hade 93 µg/ml (p <0,05).
En högdos av TPCD NP sänkte ox-LDL-plasmakoncentrationerna med cirka 49 µg/ml jämfört med kontrollgruppen (p <0,01). Jämförelser mellan behandlingsgrupperna och kontrollgruppen redovisas i tabell 7. Ox-LDL var signifikant lägre i TPCD NP låg- och högdos jämfört med Tpl (p <0,05 resp. p <0,01). Inget samband mellan Probukol-gruppen och de andra grupperna påvisades (10).
H2O2 i plasman var cirka 0,57 µM och 0,65 µM lägre hos mössen som behandlades med TPCD NP jämfört med placebogruppen som hade 1,35 µM (p <0,001). Halten H2O2 var cirka 1,30 µM hos mössen som behandlades med Tpl och i TPCD NP grupperna var halten cirka 0,52 µM och 0,60 µM lägre (p <0,001). Behandling med TPCD NP i låg- och högdos minskade halten H2O2
med cirka 0,22 µM och 0,30 µM jämfört Probukol-behandling där halten var 1,00 µM (p <0,05 resp. p <0,01). Probukol-gruppen hade jämfört med Tpl-grupperna lägre H2O2 (p <0,01) (10).
Mössen som behandlades med en låg- och högdos TPCD NP hade cirka 0,15 ng/ml och 0,21 ng/ml lägre plasmakoncentrationer av IL-1β jämfört med placebogruppen som hade 0,44 ng/ml (p <0,001). Behandling med TPCD NP sänkte IL-1β i serum med cirka 0,13 ng/ml och 0,19 ng/ml jämfört med Tpl där koncentrationen var 0,42 ng/ml (p <0,001). Mössen som fick TPCD NP i låg- samt högdos hade ungefär 0,04 ng/ml och 0,10 ng/ml lägre IL-1β koncentrationer jämfört med de som behandlades med Probukol där koncentrationerna var 0,33 ng/ml (p <0,05 resp. p
<0,001). Probukol visade signifikant lägre halter än Tpl (p <0,05). Inga samband mellan några av grupperna påvisades för IL-1β i aorta (10).
Koncentrationen av TNF-α i plasman var hos placebogruppen cirka 0,52 ng/ml. Mössen som behandlades med TPCD NP i låg- och högdos minskade halterna med ungefär 0,19 ng/ml och 0,21 ng/ml (p <0,001). TNF-α i serum var cirka 0,17 ng/ml och 0,19 ng/ml lägre hos TPCD NP- grupperna jämfört med Tpl där koncentrationen var 0,50 ng/ml (p <0,001). Mössen som behandlades med Probukol hade 0,38 ng/ml vilket var lägre jämfört med placebogruppen (p
<0,01). Inget samband kunde påvisas mellan Probukol och TPCD NP-grupperna. Probukol- gruppen hade lägre nivåer jämfört med Tpl (p <0,01).
Koncentrationerna av TNF-α i aorta var cirka 0,29 ng/ml och 0,35 ng/ml lägre i TPCD låg- och hög-dos än i placebogruppen där koncentrationen var ungefär 0,90 ng/ml (p <0,05 resp. p <0,01).
Behandling med Probukol minskade koncentrationen TNF-α med cirka 0,32 ng/ml jämfört med placebogruppen (p <0,01). TPCD NP- och Probukol-grupperna hade lägre halter än Tpl (p <0,05) (10).
Plackackumulering
100 mg/kg fluorescerande TPCD NP injicerades efter att mössen under tre månader fått en normal diet. Experimentgruppen visade signifikanta högre fluorescerande signaler efter tre och tolv timmar i aortabågen och bukaortan jämfört med kontrollgruppen (p <0,001). Efter tolv timmar var signalerna nästa tre gånger så höga som efter tre timmar. Undersökningar av fryssnitt visade fluorescerande signaler i makrofager (10).
5.2.1.2 Studie 2 – Dou et al.
Studiedesign
Studien av Dou et al. varade i tolv veckor. β-CD användes för att skapa två nanopartiklar och transportera Rapamycin (RAP) som i djurförsök används mot ateroskleros. Ac-βCD NP är en pH-känslig nanopartikel där en acetylgrupp har bundit till β-CD. Ox-βCD är en ROS-känslig nanopartikel som konjugerats med fenylborsyra pinacol ester (PBAP). Det användes ytterligare en nanopartikel för kontroll. Poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) används för att transportera olika substanser. Hypotesen i studien var att Ac-βCD samt Ox-βCD med deras egenskaper skulle kunna lokalisera plack bättre än PLGA för att få en kontrollerad och lokal frisättning av RAP.
40 tio veckor gamla ApoE-/- hanmöss användes i studien. Antal möss i varje grupp var tio. Mössen som användes för att undersöka nanopartiklarna som behandling mot ateroskleros fick en normal diet under hela studien. Efter en månad randomiserades till experimentgrupper och en kontrollgrupp. Mössen behandlades med 3 mg/kg RAP/Ac-βCD NP, RAP/Ox-βCD NP, RAP/PLGA NP och saltlösning (Salin) vilket var placebo. De fick substanserna var tredje dag under åtta veckor (9).
Plackbildning
För att studera plackbildningen hos mössen undersöktes aorta samt aortaroten. Placebogruppen hade utvecklat plack i ungefär 30,2 % av aorta och cirka 95 % av aortaroten. Mössen som behandlades med RAP-PLGA minskade mängde plack i aorta till 19,8 % och 70 % i aortaroten jämfört med placebogruppen (p <0,01). Behandlingen med RAP/Ac-βCD minskade plackbildningen till 5,1 % i aorta och till 60 % i aortaroten jämfört med placebogruppen (p
<0,001). Mössen som fick RAP/Ox-βCD sänkte plackbildningen till 4,5 % i aorta och 55 % i aortaroten jämfört med placebogruppen (p <0,001) RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD behandlingen minskade plackbildningen i aorta och aortaroten mer än för mössen som behandlades med RAP-PLGA (p <0,01) (9).
Plackinnehåll
Undersökningar av plackinnehållet i aortaroten visade att mängden nekros vid behandlingen med RAP-PLGA minskade med cirka 35 % jämfört med placebogruppen (p <0,05). Behandlingen med RAP/Ac-βCD och RAP/Ox-βCD minskade nekros i placken med cirka 55 % respektive 58
% jämfört med placebogruppen (p <0,01). RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD-behandlingen minskade mängden nekros signifikant jämfört med RAP-PLGA-behandlingen (p <0,05).
Mängden makrofager i placebogruppen var cirka 25 % högre än hos mössen som behandlades med RAP-PLGA (p <0,05). RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD behandlingen minskade makrofager med ungefär 65 % respektive 60 % jämfört med placebogruppen (p <0,01). Mössen behandlades med RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD hade signifikant mindre makrofager jämfört med de möss som fick RAP-PLGA behandlingen (p <0,05).
Hos mössen som fick RAP-PLGA behandlingen minskade mängden MMP-9 i placken med cirka 15 % jämfört med placebogruppen (p <0,05). Behandlingen med RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox- βCD sänkte mängden MMP-9 med ungefär 58 % respektive 55 % jämfört med placebogruppen (p <0,001). Mängden MMP-9 var i signifikant lägre hos de möss som behandlades med RAP/Ac- βCD- och RAP/Ox-βCD jämfört med RAP-PLGA (p <0,01).
Vaskulära glattmuskelceller minskade med cirka 40 % vid RAP-PLGA behandling jämfört med placebogruppen (p <0,05). De möss som fick RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD sänkte VSMC med ungefär 70 % respektive 80 % (p <0,001). RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD behandling sänkte VSMC mer än RAP-PLGA (p <0,01).
RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD behandlingen hade större effekter på plackinnehållet jämfört med RAP-PLGA behandlingen (9).
Plackstabilitet
Kollagen i placken ökade med cirka 40 % vid RAP-PLGA behandling jämfört med placebogruppen (p <0,05). RAP/Ac-βCD- och RAP/Ox-βCD behandling ökade kollagen i placken med cirka 90 % och 80 % jämfört med placebogruppen (p <0,01). Mössen som behandlades med RAP-PLGA hade mindre kollagen i placken jämfört med de som fick RAP/Ac- βCD- och RAP/Ox-βCD (p <0,05). Kollagen i placken var högre hos de möss där beta- cyklodextrin transporterade Rapamyecin (9).
Plackackumulering
Plackackumulering i aortabågen, karotidförgreningarna och bukaorta studerades på ApoE-/- möss som under tre månader fått en högfettdiet. Mössen i experimentgruppen injicerades med 2,4 µmol fluorescerande Ac-βCD och placebogruppen fick samma dos av fluorescerande salin. De avlivades 24 timmar efter injiceringen. Experimentgruppen visade högre fluorescerande signaler
än placebogruppen (P <0,001). Det sågs fluorescerande signaler i makrofager hos de möss som injicerades med Ac-βCD (9).
5.2.1.3 Studie 3 – Guo et al.
Studiedesign
Studien av Guo et al. varade i tolv veckor. Mössen fick en högfettdiet under hela studien. De delades slumpmässigt upp i en experiment- och en kontrollgrupp efter en månad.
Experimentgruppen injicerades med 0,6 mg LCD NP tre gånger i veckan i åtta veckor. LCD NP är en nanopartikel där substansen luminol konjugerades till β-CD. Luminol är en substans med antiinflammatoriska effekter. Åtta veckor gamla hanmöss användes i studien och i varje grupp ingick nio möss (24).
Plackbildning
Plackbildningen i hela aortan minskade hos mössen som behandlades med LPCD NP jämfört med placebogruppen (p <0,05). Fryssnitt av aortaroten påvisade mindre plackbildning hos experimentgruppen. Eventuell statistisk skillnaden mellan grupperna angavs inte (24).
Plackinnehåll
Mössen som behandlades med LPCD NP hade ungefär 45 % färre makrofager än placebogruppen (p <0,05) (24).
Plackstabilitet
De möss som hade behandlats med LPCD NP hade cirka 2 gånger mer kollagen i placken jämfört med placebogruppen (p <0,05). Antalet neutrofiler i aortavävnaden var cirka 0,7 % och 0,45 % i placebo- respektive LPCD-gruppen (p <0,05). Makrofager i aortavävnaden var cirka 22 % och 16 % i placebo- respektive LPCD-gruppen (p <0,05). Mössen som fick LPCD NP behandling hade en ökad mängd kollagen i placken och färre neutrofiler samt makrofager i vävnaden runt aorta (24).
Inflammationsmarkörer
Med immunfluorescens påvisades mindre myeloperoxidas (MPO) i experimentgruppen jämfört med kontrollgruppen. Eventuella signifikanta skillnader angavs inte (24).
Plackackumulering
Mössen fick en högfettdiet under åtta veckor. Efter åtta veckor fick de, var tredje dag 20 µg fluorescerande LPCD NP och dag tolv avlivades mössen. Analyser av bukaortan och aortabågen
visade mer fluorescerande signaler efter LPCD NP-behandling. Eventuella skillnader mellan experiment- och kontrollgrupp angavs inte (24).
5.2.2 Studier med cyklodextrin-derivat 5.2.2.1 Studie 4 – Zimmer et al.
Studiedesign
Zimmer et al. delade upp sin studie i tre olika delstudier. De använde 2HPβCD vid en dos av 2 gram/kilo kroppsvikt. 2HPβCD är en substans som används för att transportera och öka lösligheten av lipofila läkemedel hos människor. Den är godkänd av US food and drug administration (FDA). I alla studier användes tolv veckor gamla ApoE-/--möss i kontroll- och experimentgruppen. Upplysning om mössens kön saknades (25).
Försök 1 hade som syfte att undersöka 2HPβCD:s preventiva effekter vid ateroskleros. Sju till åtta möss användes i varje grupp och mössen fick ovan nämnd dos under åtta veckor tillsammans med en kolesterolrik diet (25).
Försök 2 undersökte tillbakabildningen av aterosklerotiska lesioner. Mössen fick en kolesterolrik diet i åtta veckor som därefter ändrades till en normal diet i fyra veckor. Under de sista fyra veckorna blev mössen i experimentgruppen behandlade som ovan. Antal möss var mellan 6–8 i varje grupp (25).
Försök 3 undersökte 2HPβCD som behandling mot ateroskleros. Mössen fick en kolesterolrik diet under tolv veckor. Efter åtta veckor blev experimentgruppen behandlade som ovan nämnt.
Antalet möss var av samma antal som i försök 2 (25).
Plackbildning
I försök 1 hade mössen som inte fick någon behandling plack i cirka 60 % av aortaroten och de möss som fick behandling hade plack i ungefär 35 % (p <0,001) (25).
I försök 2 hade mössen utvecklat plack i cirka 60 % av aortaroten innan behandling påbörjades.
Efter behandling med 2HPβCD bestod aortaroten av ungefär 33 % plack jämfört med placebogruppen där ungefär 55 % av aortaroten innehöll plack (p <0,01). Förändringen från 60
% till cirka 33 % plack motsvarar en 45 procentig minskning (p <0,001) (25).
I försök 3 hade experimentgruppen plack i ungefär 35 % av aortaroten och placebogruppen i ungefär 60 % (p <0,05) (25).
Plackinnehåll
Placken i försök 1 utgjordes av cirka 27 % kolesterolkristaller hos placebogruppen och 15 % hos experimentgruppen (p <0,01). Det fanns ingen skillnad mellan placebo och 2HPβCD-behandling med avseende makrofager och cellinnehåll i aortaroten. Mängden makrofager i den bildade placken utgjordes av cirka 6,5 % i kontrollgruppen och 5,5 % i experimentgruppen (25).
I försök 2 bestod placken av cirka 27 % kolesterolkristaller innan behandlingen började. Efter behandling och koständring bestod placebogruppens plack av cirka 15 % kolesterolkristaller och plack hos mössen som fick 2HPβCD-behandling bestod av cirka 10 % kolesterolkristaller (p
<0,05). Kolesterolkristallisering hos båda grupperna sjönk jämfört med innan behandlingen började (p <0,001) (25).
I försök 3 var cirka 18 % av placken kolesterolkristaller hos mössen som blev behandlade med 2HPβCD och placken i placebogruppen utgjordes av cirka 28 % kolesterolkristaller (p <0,05) (25).
Kolesterolkristalliseringen minskade mer hos de möss som fick behandling med 2HPβCD jämfört med placebogrupperna i alla tre försök. I försök 1 minskade mängden makrofager mer hos mössen som fick behandling men skillnaden kunde inte statistiskt säkerställas (25).
Inflammationsmarkörer
I försök 1 undersöktes IL-1β halten i plasman. Mössen i placebogruppen hade cirka 350 pg/ml IL-1β i plasman och mössen som behandlades med 2HPβCD hade cirka 100 pg/ml i plasma (p
<0,05). TNF-α halten i plasman hos placebogruppen var cirka 180 pg/ml och cirka 80 pg/ml i behandlingsgruppen (p <0,05). Plasma halten av IL-6 var ungefär 22 pg/ml i placebogruppen och cirka 8 pg/ml hos mössen som fick 2HPβCD-behandling (p <0,05). ROS-produktion i aorta hos placebogruppen var cirka 600 RLU/s/mg och ungefär 200 RLU/s/mg i behandlingsgruppen (p
<0,01). Inflammationsmarkörerna var lägre hos mössen som fick behandling med 2HPβCD (25).
5.2.2.2 Studie 5 – Heegon et al.
Studiedesign
Studien av Heegon et al. varade i 16 veckor. ApoE-/--mössen fick under tolv veckor Paigen´s högfettdiet. Den ändras till en normaldiet vecka 12 då behandlingen började och varade i fyra veckor. I studien delades mössen upp i en placebogrupp och två experimentgrupper som behandlades subkutant med 1 g/kg 2HPβCD och βCDP två gånger i veckan. 2HPβCD beskrivs i
studie 2. βCDP är en polymer av β-CD. Tio veckor gamla han-ApoE-/--möss användes i studien.
Antalet möss var sex i varje grupp (26).
Plackbildning
Plackbildningen minskade mest hos mössen som fick βCDP. Placken i aortabågen utgjorde cirka 58 % hos placebogruppen, 57 % i 2HPβCD-gruppen jämfört med 30 % i βCDP-gruppen (p
<0,01). I bröstaorta hade βCDP-gruppen utvecklat plack i cirka 17 %, 2HPβCD-gruppen hade plack i cirka 28 % och i placebogruppen fann forskarna plack i cirka 32 %. Plackbildningen var lägre hos mössen som fick βCDP jämfört med 2HPβCD och placebo (26).
Plackstabilitet
Kollageninnehållet i aortaroten var cirka 60 %, 60 % samt 61 % för kontroll-, 2HPβCD- respektive βCDP-gruppen. Inga skillnader fanns mellan behandlingarna och placebo (26).
Plackackumulering
Två grupper med tre möss i varje grupp användes för att undersöka hur cyklodextrinerna ackumulerades i plack. Mössen fick en högfettdiet i tolv veckor och därefter fick de en injektion med 100 mg/kg CD subkutant. Mössen avlivades 24h och 72h efter injektionen. Syftet var att undersöka om CD-polymerer skiljer sig från CD. Cyklodextrinerna som användes till detta moment var karboxymetyl-beta cyklodextrin (CMβCD) och karboxymetyl-beta-cyklodextrin polymer (CMβCDP). En fluorescerande substans konjugerades till ovan nämnda cyklodextrin- derivat. Near-infrared fluorescens (NIR)-analyser av artärträdet visade att mössen som behandlats med fluorescerade CMβCDP hade 14,2 gånger mer signaler jämfört med dem som behandlats med CMβCD. Nästan 4 % av den injicerade dosen CMβCDP återfanns i aorta, medan CMβCD fanns i mindre än 0,5 % av aorta. Polymeren CMβCDP ackumulerade mer i placken än CMβCD (26).
5.2.2.3 Studie 6 - Sakurai et al.
Studiedesign
Sakurai et al. utförde en pilotstudie och en större studie som båda pågick i elva veckor. Under pilotstudie fick ApoE-/- mössen en västerländsk diet (WD) för att initiera ateroskleros. Trettio, åtta veckor gamla honmöss användes i studien. De delades upp i tre grupper med tio möss i varje grupp. Två experimentgrupper användes där den ena fick 1,5 % α-CD (WDA) och den andra 1,5
% β-CD (WDB) som supplement till den dieten. En kontrollgrupp användes som enbart fick en WD (27).
Den större studiens design var som ovan, men utökades med två kontrollgrupper. En av kontrollgrupperna fick en lågfettdiet (LFD) och den andra fick en WD där 1,5 % inulin tillsattes (WDI) (27).
Plackbildning
Undersökningar av ateroskleroslesioner gjordes i aortan på mössen. Pilotstudien visade att ateroskleroslesioner hade utvecklats i cirka 4,6 % av aortan hos gruppen som fick α-CD, 10,6 % hos dem som fick β-CD och 11,7 % hos dem som bara fick en västerländsk diet (P <0,01). Mössen som fick α-CD utvecklade mindre plack i aorta jämfört med mössen som fick β-CD (27).
I den större studien hade ateroskleros lesioner utvecklats i cirka 5,2 % för de som fick α-CD, 13,3
% för de som fick β-CD, 15,0 % för de som endast fick en västerländsk diet, 4,9 % för de som fick en lågfettdiet och 13,3 % för de som fick inulin. Den minskade plackbildningen för de möss som fick α-CD tillsatt i kosten var signifikant mindre än för de som fick en västerländsk diet (p
<0,001). Forskarna fann inget samband mellan att tillsätta β-CD och enbart en västerländsk diet.
Den större studien visade att α-CD och en lågfettdiet minskar plackbildning mer än β-CD, inulin samt en västerländsk diet (27).
5.2.2.4 Studie 7 – Montecucco et al.
Studiedesign
Montecucco et al. genomförde två olika försök. De använde elva veckor gamla ApoE-/- möss som fick 40 mg/kg MβCD tre gånger i veckan (28).
Försök A varade i 27 veckor. Mössen fick en normaldiet under hela studien. Efter elva veckor delades de upp i en experiment- och en placebogrupp och behandling startade. Antalet i experimentgruppen var tolv och i placebogruppen nio (28).
Försök B varade i 22 veckor. Mössen gavs en normaldiet under de första elva veckorna. Dieten ändrades till högkolesterol diet under de resterande elva veckorna. En placebogrupp användes och behandlingen av experimentgruppen började efter vecka elva. Antalet möss i placebogruppen var nio och i experimentgruppen elva. Under vecka tolv dog en mus i experimentgruppen (28).
Plackbildning
Plackbildning undersöktes i bukaortan hos mössen. I både försök A och B hade mössen som fick MβCD utvecklat mindre plack än placebogrupperna (p=0,028, p=0,020) (28).
Plackinnehåll
Antalet makrofager och neutrofiler förändrades inte i placken hos mössen som fick MβCD- behandling jämfört med placebogruppen (P=0,862 och P=0,295). MβCD-behandlingen minskade antalet T-lymfocyter jämfört med placebogruppen (P <0,001) (28).
Mössen som blev behandlade med MβCD i försök A hade mindre lipider i placken jämfört med placebogruppen (P=0,028). Uttrycket av MMP-9 var signifikant lägre i experimentgruppen jämfört med placebogruppen (P=0,048). MMP-8 undersöktes men inga skillnader mellan experiment- och placebogruppen (28).
I försök B fanns de inga skillnader avseende lipidinnehållet mellan MβCD-behandling och placebo-behandlingen vad avser lipidinnehållet (P=0,412). Det fanns heller inga skillnader mellan experiment- och placebogrupp med hänsyn till MMP-9 halterna (P=0,112). Behandlingen med MβCD minskade halten av MMP-8 jämfört med placebogruppen (P=0,035) (28).
Behandling med MβCD minskade antalet T-lymfocyter i båda försöken. I försök A minskade behandlingen MMP-9 halten och i försök B minskade MMP-8 halten. Antalet makrofager och neutrofiler minskade varken i försök A eller B. I försök A sågs ingen skillnad av halten MMP-8 mellan behandlings- och placebogruppen. Det var ingen skillnad mellan behandlings- och placebogruppens halt av MMP-9 i försök B (28).
Plackstabilitet
Plackens kollageninnehåll undersöktes i aortaroten. Mössen som fick MβCD hade mer kollageninnehåll i placken jämfört med placebogruppen, men ökningarna var inte signifikanta (P=0,082; högkolesterol P=0,112). Inget samband kunde påvisas vad avser kollageninnehållet i placken mellan mössen som fick MβCD-behandling och placebobehandling (28).
Inflammationsmarkörer
Montecucco et al. använde mRNA som genetisk markör för att undersöka immunförsvarets respons på MβCD behandling. Försöken utfördes i bukaorta och i lymfknutor (28).
I försök A hade mössen som behandlades med MβCD cirka 2,3 gånger lägre nivåer av IFNγ i bukaorta jämfört med placebogruppen (P=0,031). Mössen som behandlades med MβCD visade en svag signifikant ökning av CD4 i lymfknutor jämfört med placebogruppen (P=0,049) (28).
I försök B visade undersökningar av bukaortan att MβCD-behandlingen sänkte nivåerna av IFNγ jämfört med placebogruppen (P=0,017). När mössen behandlades med MβCD sänktes uttrycket
av IFNγ- mRNA cirka 4 gånger jämfört med placebo (P=0,017). I mjälten var uttrycket av mRNA för CD4 ungefär 1,6 gånger högre i placebogruppen jämfört med mössen som behandlades med MβCD (P=0,007). I mjälten uttrycktes ungefär 2,4 gånger mer IFNγ-mRNA i mjälten jämfört med experimentgruppen (P=0,031) (28).
I både försök A och B minskade IFNγ- mRNA efter behandling med MβCD kontra placebogrupperna. Det var en ökning av CD4-mRNA i försök hos mössen som behandlades med MβCD. I försök B minskade CD4-mRNA efter behandling med MβCD (28).
Plackackumulering/farmakokinetik
Mössen delades upp i fem grupper med fyra möss i varje grupp, där en grupp fungerade som kontrollgrupp. Mössen injicerades en gång med 40 mg/kg MβCD och de avlivades efter 0,5 h, 1 h, 6 h och 24 h. Kontrollgruppen fick en placebosubstans och avlivades efter 0,5 h.
Undersökningar av mjälten, halten i serum och bukaortan genomfördes. MβCD kunde inte påvisas i de möss som avlivades efter sex och tolv timmar. Mössen fick en normaldiet men det angavs det inte hur länge de hade fått den dieten (28).
Halten MβCD i serum var högst efter 0,5 timmar (0,049 mg/ml) och efter en timme sjönk den till 0,013 mg/ml. Det var en signifikant minskning jämfört med kontrollgruppen (P=0,029) (28).
I mjälten kunde MβCD påvisas efter 0,5 timmar (0,014 µg/mg) och efter en timme hade halten ökat (1,161 µg/mg). Ökningen efter en timme var signifikant jämfört med kontrollgruppen (P=0,029) (28).
MβCD halten kunde mätas i serum efter 0,5 h och 1 h, därefter återfanns MβCD inte längre i serum. I mjälten kunde MβCD påvisas efter 0,5 h och efter 1 h hade halten ökat. Efter 6 h kunde MβCD inte påvisas i mjälten (28).
5.2.2.5 Sammanfattning av studierna
I tabell 3 och 4 sammanfattas resultaten från studierna i avseende till plackackumulering, plackbildning, plackinnehåll, plackstablitet samt inflammationsmarkörer.
Tabell 3. Visar studiernas författare och år. Redovisar plackbildning, plackinnehåll, plackstabilitet, inflammationsmarkörer och plackackumuleringen för experimentgrupperna i respektive studie.
Författare Plackackumulering Plackbildning Plackinnehåll Plackstabilitet Inflammationsmarkörer Wang et al.
2018
TPCD NP:
Lågdos: ↑ Högdos: ↑
TPCD NP:
Lågdos: ↓ Högdos: ↓
Låg- högdos:
CC↓, apoptos
↓, makrofager
↓, MMP-9 ↓, VSMC ↑
Kollagen ↑ TPCD NP:
Ox-LDL ↓ H2O2 ↓ S-IL-1β ↓ A-IL-1β n. s A&S-TNF-α ↓
Dou et al.
2017
Ac-bCD↑ Ac-bCD ↓
Ox-bCD ↓
Ac-bCD &
Ox-bCD:
CC ↓ Nekros ↓ Makrofager ↓
MMP-9 ↓
Ac-bCD &
Ox-bCD:
Kollagen ↑ VSMC ↓
-
Guo et al.
2019
LCD NP ↑ LCD NP ↓ Makrofager ↓ Neutrofiler ↓
Kollagen ↑ MPO ↓
Tempol-fenylborsyra-pinacol-ester-cyklodextrin (TPCD); rapamycin/acetylerad betacyklodextrin (Ac- βCD);
rapamycin/fenylborsyra pinacol ester-betacyklodextrin (Ox-βCD); luminol-betacyklodextrin (LPCD NP);
Kolesterolkristaller (CC); matrix metallopeptidas-9 (MMP-9); vaskulära glattmuskelceller (VSMC); oxiderat low- density lipoprotein (ox-LDL); väteperoxid H2O2; interleukin-1-beta (IL-1β); tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α);
myeloperoxidas (MPO). ↓ och ↑ indikerar en signifikant minskning/ökning i förhållande till placebogruppen. A:
aorta; S: serum.
Tabell 4. Visar studiernas författare och år. Redovisar plackbildning, plackinnehåll, plackstabilitet, inflammationsmarkörer och plackackumuleringen för experimentgrupperna i respektive studie.
Författare Plackackumulering Plackbildning Plackinnehåll Plackstabilitet Inflammationsmarkörer Zimmer et
al. 2016
- 2HPβCD:
Försök 1: ↓ Försök 2: ↓ Försök 3: ↓
Försök 1:
CC ↓, makrofager
n.d.
Försök 2:
CC ↓ Försök 3:
CC ↓
- Försök 1:
IL-1β ↓ TNF-α ↓
IL-6 ↓ ROS ↓
Heegon et al. 2020
CMβCDP>
CMβCD
βCDP ↓ 2HPβCD n. s
- n.s -
Sakurai et al. 2017
- α-CD ↓
β-CD n. s
- - -
Montecucco et al. 2015
MβCD ↑ MβCD ↓ Försök A:
Makrofager n. s T-lymfocyter
↓ Lipider ↓ MMP-9 ↓ MMP-8 n.s
Försök B:
Makrofager n. s T-lymfocyter
↓ Lipider n. s MMP-9 n. s MMP-8 ↓
Kollagen↑ n. s Försök A:
IFNγ ↓ CD4 ↑ Försök B:
IFNγ ↓ Tim3 ↓
Karboxymetyl-beta cyklodextrin (CMβCD); karboxymetyl-beta-cyklodextrin polymer (CMβCDP); metylerad beta- cyklodextrin MβCD; 2-hydroxypropyl-beta-cyklodextrin (2HPβCD), beta-cyklodextrin polymer (βCDP), alfa- cyklodextrin (α-CD), beta-cyklodextrin (β-CD); kolesterolkristall (CC); matrix metallopeptidas (MMP); interleukin (IL); tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α); reaktiva syreföreningar (ROS); interferon-gamma (IFNγ); cluster of differentiation 4 (CD4); T-cell immunoglobbulin and mucin-domain containing-3 (Tim3). ↓ och ↑ indikerar en signifikant minskning/ökning i förhållande till placebogruppen. A: aorta; S: serum; n.s inte signifikant; n.d ingen skillnad
6 Diskussion
6.1 Metoddiskussion
Efter att syftet hade formulerats visade sökningar i olika databaser att det inte fanns studier gjorda på människor för att kunna besvara frågeställningen. Av den anledningen valdes undersökningar gjorda på möss då det är ett ofta använt djur för att studera ateroskleros. Sökorden som användes kan ha inneburit att andra relevanta artiklar inte inkluderades i studien. Sökningarna för att hitta artiklarna gjordes endast i en databas vilket kan anses vara en svaghet med studien. Om artikelsökningarna utökats till en eller flera andra databaser hade andra artiklar möjligtvis kunnat ingå i studien. Avgränsningen i att välja artiklar från de senaste fem åren gjordes på bakgrund av att författaren ville undersöka den mest aktuella forskningen. De exkluderande kriterierna bidrog till att många studier som gjordes in vitro valdes bort. Om in vitro-studier hade inkluderats skulle
det möjligtvis bidragit till en ökad förståelse för mekanismer som ligger bakom resultatet. Dock låg det i författarens intresse att undersöka ateroskleros in vivo.
Litteraturstudien har en rad begränsningar och svagheter. Artiklarna är baserade på möss vilket gör det svårt att jämföra resultaten med människor. Bland annat för att ApoE-/--möss har en annan lipidprofil än människor (22). Den andra stora svagheten i studien är att det inte går att säga vilken klinisk relevans de olika ökningarna och sänkningarna av olika faktorer hade. Studien kan endast konstatera att olika parametrar förändrar sig men inte vilken betydelse de har.
Resultatrapporteringen i studien är ytterligare en svaghet. Då artiklarna presenterade resultaten i form av tabeller samt stapeldiagram är de siffror som presenteras i litteraturstudien författarens egna uppskattningar av tabeller och stapeldiagram. Detta sänker tillförlitligheten för resultaten i studien. I några av artiklarna har det saknats information vilken enhet de presenterar resultatet i.
Av den anledningen har vissa resultat från artiklarna endast kunnat presenteras i form av signifikanta skillnader. Reproducerbarheten i studien sjunker då en del av resultatet är subjektiva uppskattningar. En styrka med studien är att resultaten endast grundar sig på ApoE- knockoutmöss. Det har gjort det möjligt att jämföra de olika studierna med varandra för att identifiera skillnader respektive likheter.
6.2 Resultatdiskussion
Syftet med litteraturstudien var att undersöka om olika typer av cyklodextriner kan motverka och utöka behandlingsmöjligheterna av ateroskleros. Bakgrunden till syftet är att hjärt- och kärlsjukdomar är den vanligaste dödsorsaken i världen. Det finns bra behandling i form av statiner, dock är det inte alla som svarar på den behandlingen. Därför är det intressant att undersöka andra potentiella behandlingsalternativ. I litteraturstudien undersöktes olika delar av aterogenesen; plackbildning, plackinnehåll, plackstabilitet, inflammationsmarkörer och plackackumulering.
6.2.1 Cyklodextrin som nanopartikel Plackbildning och plackackumulering
I studierna där cyklodextrin användes som en del av en nanopartikel ökade ackumulering av substanserna i bukaorta samt aortabågen hos mössen som fick nanopartikeln (9, 10, 24).
Plackbildning är vanligt i dessa områden både hos möss och människor (22). I studie 3 (24)
