Examensarbete Malmö universitet
INDUCERING AV INTERFERON- GAMMA OCH
TUMÖRNEKROSFAKTOR-ALFA I HELSALIV
EN ICKE-INVASIV METOD FÖR ATT DIAGNOSTISERA CELIAKI
DORINA KOKREHEL
INDUCERING AV INTERFERON- GAMMA OCH
TUMÖRNEKROSFAKTOR-ALFA I HELSALIV
EN ICKE-INVASIV METOD FÖR ATT DIAGNOSTISERA CELIAKI
DORINA KOKREHEL
Kokrehel, Dorina. Inducering av interferon-gamma och tumörnekrosfaktor-alfa i helsaliv. En icke-invasiv metod för att diagnostisera celiaki. Examensarbete i biomedicinsk
laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för biomedicinsk laboratorievetenskap, 2022.
Celiaki (glutenintolerans) är en kronisk, autoimmun sjukdom med diffusa symtom. Vid förtäring av glutenhaltig mat uppstår en allergisk reaktion hos glutenintoleranta individer.
Gluten kan inte fullständigt brytas ned av kroppens enzymer, vilket betyder att icke nedbrutna peptidfragment (såsom glutamin) absorberas i tarmslemhinnan. Enzymet transglutaminas katalyserar omvandlingen av glutamin till glutamat. Glutenkänsliga T-celler aktiveras av glutamat att utsöndra proinflammatoriska cytokiner såsom interferon-gamma (IFN-γ) och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-⍺). Syftet med studien var att undersöka om gluten- och gliadinstimulering av celler i helsaliv in vitro kan inducera produktion av IFN-γ och TNF-⍺.
Pilotstudier med 2 försökspersoner utfördes, där celler i salivprover stimulerades med
enzymatiskt nedbrutet gliadin (<40 mg gliadin), samt PHA (5 µg/mL), PMA (50 ng/mL) och LPS (1 µg/mL) 20 timmar vid 37 ˚C. Cytokinproduktionen i salivproverna kvantifierades med ELISA och uppreglering av IFN-γ och TNF-⍺ undersöktes med RT-qPCR. Efter metodutveckling upprepades stimulering och ELISA med salivprov från 12 försökspersoner (6 individer med och utan celiaki). Immunreaktionen som uppstår hos glutenintoleranta individer in vivo kunde inte återskapas i saliv in vitro med den framtagna metoden. Hos övervägande delen av salivproverna var cytokinproduktionen under detektionsgränsen, 4 pg/mL för IFN-γ och 15,6 pg/mL för TNF-⍺. Det finns risk för att outforskade detaljer eller agens saknades från reaktionskedjan och därmed kunde den förväntade immunreaktionen inte återskapas. En annan felkälla kan vara för låg koncentration av immunceller i saliven.
Nyckelord: celiaki, gliadin, IFN-γ, saliv, TNF-⍺
INDUCING INTERFERON-GAMMA AND TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA IN WHOLE SALIVA
A NON-INVASIVE METHOD TO DIAGNOSE CELIAC DISEASE
DORINA KOKREHEL
Kokrehel, Dorina. Inducing Interferon-Gamma and Tumor Necrosis Factor Alpha in Whole Saliva. A Non-Invasive Method to Diagnose Celiac Disease. Degree Project in Biomedical Science, 15 Credit Points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, 2022.
Celiac disease is a chronic, autoimmune disease that has diffuse symptoms. Upon consuming gluten containing food, an allergic reaction occurs in gluten-sensitive individuals. Gluten cannot be fully digested by human enzymes, which leads to non-digested peptide fragments (such as glutamine) to be absorbed in the gastrointestinal wall. The transglutaminase enzyme catalyzes the conversion of glutamine to glutamate. Glutamate activates gluten-specific T- lymphocytes to produce proinflammatory cytokines e.g., interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor alpha (TNF-⍺). The aim of this study was to investigate whether stimulation of cells in whole saliva in vitro with gluten and gliadin can induce production of IFN-γ and TNF-⍺. Pilot studies were conducted, where cells in saliva from 2 subjects was stimulated with enzymatically digested gliadin (<40 mg gliadin) together with PHA (5 µg/mL), PMA (50 ng/mL) and LPS (1 µg/mL) for 20 hours at 37 ˚C. The production of cytokines was quantified by ELISA, and the upregulation of IFN-γ and TNF-⍺ was analyzed by RT-qPCR. After method development, the stimulations and ELISA quantifications of the proinflammatory cytokines were repeated in saliva samples from 12 subjects (6 individuals with and without celiac disease). The immune reaction that occurs in people with celiac disease could not be recreated in saliva in vitro with the developed method. In most of the samples the production of cytokines was under the detection range, 4 pg/mL for IFN-γ and 15,6 pg/mL for TNF-⍺. There is risk of unstudied details or agents missing from the reaction chain, and therefore the expected immune reaction could not be recreated. Another source of error could be low concentration of immune cells in saliva.
Keywords: celiac disease, interferon-gamma, saliva, tumor necrosis factor alpha
FÖRORD
I samband med examensarbetet fick jag möjligheten att fördjupa mig i ett ämne jag brinner för och försöka utveckla en egen diagnosmetod för celiaki. Jag är väldigt tacksam för stödet från min familj. Mycket stort tack till mina handledare Anna Gustafsson och Maria
Magdalena Stollenwerk för deras entusiasm, proffsiga vägledning och stöd i motgångar. Vill även rikta ett tack till vänner, alla deltagare och övrig personal på Malmö universitet som har varit involverade i projektet.
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
FÖRORD 1
BAKGRUND 5
Gluten och celiaki 5
Saliv 6
Proinflammatoriska cytokiner 7
Mitogener 7
Syfte 8
MATERIAL OCH METOD 8
Urval 8
Provtagning 8
Pilotstudier 8
ELISA 9
RT-qPCR 10
RESULTAT 11
Inducering av TNF-⍺ i helsaliv 12
DISKUSSION 13
KONKLUSION 15
REFERENSER 16
BILAGA 1. 21
BAKGRUND
Celiaki (glutenintolerans) är en kronisk, autoimmun sjukdom som kan ha allt från inga eller milda symtom till allvarlig malabsorption [1]. Tarmskadan som uppkommer försvårar
upptaget av vitaminer, näringsämnen och mineraler, vilket leder till bristsymtom [2–4]. Långt gången malabsorption kan orsaka exempelvis osteoporos och järnbristanemi [1]. Av denna anledning påverkas inte endast mag-tarmkanalen, utan även andra organsystem såsom skelett och hud [1]. Förut ansågs celiaki vara en barnsjukdom, men förståelsen för sjukdomen har ökat under de senaste 50 åren [5]. Celiaki kan drabba alla människor oavsett ålder eller kön.
Populationsstudier visar att celiaki är en global sjukdom med stigande prevalens. Sjukdomen påverkar cirka 0,7 % av världens befolkning enligt en studie från 2019 [6]. I dagsläget räknas celiaki till en av Sveriges folksjukdomar med 3–4 fall per 1000 barn [2].
Gluten och celiaki
Gluten är ett protein som finns i de allra flesta sädesslag och är därmed en av de vanligaste ingredienserna i människokost [7]. Proteinhalten i sädesslag är låg (cirka 10–20 % av torr vikt), men gluten utgör mellan 50–100 % av hela proteinhalten. Gluten består mestadels av prolamin och glutenin. Prolaminer förekommer i olika former men finns bland annat i vete (gliadin), havre (avenin), råg (secalin) och korn (hordein) [8]. Alla födoämnen uppfattas av kroppen som främmande och potentiellt patogena, innan de bearbetas av kroppen och bryts ner till metaboliter [9]. Till skillnad från andra proteiner kan inte gluten fullständigt brytas ned av kroppens enzymer. I kroppen resulterar det i att icke nedbrutna peptidfragment absorberas i slemhinnan. Vid förtäring av glutenhaltig mat uppstår en allergisk reaktion hos glutenintoleranta individer, orsakat av individens egna immunsystem. Leukocyter och deras ytreceptorer (human leukocyte antigen, HLA) spelar en central roll. Immunceller får inte reagera för svagt eller för starkt på kroppsegna cellers HLA molekyler. När en epitop från ett främmande ämne binder till leukocytens HLA, förändras dock dess kemiska och molekylära struktur så att kroppens immunceller kan stimuleras [2].
Efter intag av gluten påbörjas nedbrytningsprocessen dels mekaniskt, dels kemiskt. I
magsäcken (pH <3) blandas gluten med pepsin, där proteinet bryts ned till peptider [10]. Från magsäcken fortsätter peptidfragmenten vidare till tunntarmen, där de blandas med trypsin som fortsätter nedbrytningen tills fragmenten absorberas i tarmväggarna [11]. Långa
prolamin-, och glutaminpeptidfragment passerar genom epitelcellagret och basalmembranet tills de når lamina propria (bindvävslager med mycket blodkärl som är en del av slemhinnan) [12]. I lamina propria finns vävnadstransglutaminas, ett enzym som katalyserar
omvandlingen av de kvarstående glutaminfragmenten till glutamat. I samband med katalyseringen ökar glutamatets affinitet till så kallade HLA-DQ2/DQ8 receptorer på antigenpresenterande celler (dendritiska celler, makrofager och B-celler), som visar upp glutamatet för glutenkänsliga CD4+ celler och som då aktiveras till T-hjälparceller [13–14].
T-hjälparceller utsöndrar proinflammatoriska cytokiner såsom interferon-gamma (IFN-γ) och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-⍺), vilket resulterar i att en inflammation uppstår (Figur 1) [3,15]. T-hjälparcellerna främjar även klonal expansion av B-celler, vilket innebär att B-celler differentierar till plasmaceller och börjar utsöndra antikroppar främst mot
vävnadstransglutaminas [16–17].
Figur 1. Efter intag av glutenhaltig mat uppstår en immunologisk reaktion hos individer med celiaki.
Transglutaminas (kan vara både humant och bakteriellt) katalyserar omvandlingen av glutamin till glutamat. Glutamatets affinitet ökar till HLA-DQ2/DQ8 receptorer som finns på antigenpresenterande celler. Glutenkänsliga CD4+ celler aktiveras till T-hjälparceller och utsöndrar proinflammatoriska cytokiner, såsom IFN-γ och TNF-⍺.
Celiaki behandlas med strikt glutenfri diet [18]. Majoriteten av glutenintoleranta individer mår bättre av dieten, men upp till 20 % kan få kvarstående eller återkommande symtom trots glutenfri kost [6,19–20]. Celiaki skiljer sig från andra autoimmuna sjukdomar, då en
fullständig återhämtning av mag-tarmkanalen kan ske om behandlingen följs (komplett uteslutande av gluten) [21]. Om inte sjukdomstillståndet kan fastställas och behandlas eller den glutenfria dieten inte följs, kan allvarliga komplikationer uppstå som följd [7]. Av denna anledning är det ytterst viktigt att upptäcka sjukdomen även hos individer som visar inga eller endast milda symtom.
I dagsläget diagnostiseras celiaki primärt med hjälp av blodprov för att påvisa antingen cirkulerande autoantikroppar mot vävnadstransglutaminas eller närvaron av HLA-DQ2/DQ8- genen hos leukocyter (95 % som bär på HLA-DQ2/DQ8-genen är glutenintoleranta, medan 30–40 % av glutenintoleranta individer saknar anlaget) [20]. Vid positiva blodprov utförs gastroskopiundersökning för att bedöma tarmslemhinnans tillstånd (villusatrofi) innan den slutgiltiga diagnosen celiaki ställs [6,17,22–23].
Saliv
Saliv produceras av spottkörtlar som är omgivna av kapillärer. Biokemiska eller
immunologiska komponenter i saliv kan antingen produceras lokalt av spottkörtlarna eller komma från blodet genom passiv diffusion eller aktiv transport. Om komponenterna kommer från blodet kan halterna i saliv återspegla halterna i det cirkulerande blodet. Saliv innehåller flera olika sorters proteiner och celler, såsom enzymer, cytokiner, hormoner, immunceller, antikroppar och epitelceller - något som möjliggör att saliv kan användas för diagnostiska tester [24–29]. Fördelningen mellan cellerna i saliv är varierande, men ungefär hälften av cellerna utgörs av epitelceller. De övriga cellerna är immunceller varav neutrofila
granulocyter är de vanligaste (cirka 58 %), men även lymfocyter (cirka 34 %) och övriga mononukleära celler (cirka 8 %) återfinns i saliv [25]. Nya studier visar att biomarkörer i saliv kan indikera systemiska förlopp i kroppen, såsom autoimmuna sjukdomar [30–31]. Det finns flera studier som bekräftar att celiaki kan påvisas med hjälp av salivprov där
antikroppar mot biomarkörer respektive biomarkörers genuttryck detekteras [32–34].
Saliv sammankopplar kroppens matspjälkningssystem, från munnen till magen. Saliv som sväljs innehåller även stora mängder av aeroba och anaeroba bakterier. Munhålan är den andra mest bakteriekoloniserade delen av mag-tarmkanalen (tarmarna innehåller allra flest bakterier). Studier visar att orala bakterier delvis kan bryta ner gluten. Det finns även teorier om att glutennedbrytningen fortsätter ett tag till i magsäcken [35]. Bakterier producerar mikrobiellt transglutaminas, ett enzym som är mycket likt humant vävnadstransglutaminas.
Mikrobiellt transglutaminas kan inte bara katalysera nedbrytningen av de kvarstående glutenfragmenten, utan även aktivera glutenkänsliga T-celler (Figur 1). Det finns hypoteser om att mikrobiellt transglutaminas som produceras av olika bakterier i kroppens normalflora kan vara involverad i utvecklingen av celiaki [36–37].
Proinflammatoriska cytokiner
IFN-γ och TNF-α kan detekteras i blod och i saliv, och produceras efter inflammatoriska stimuli [38]. Produktionen av IFN-γ är associerat med kroniska inflammationer och autoimmuna sjukdomar [39]. IFN-γ har en dominerande roll bland alla cytokiner som samverkar i celiaki [40–41]. Även TNF-⍺ förknippas med inflammatoriska sjukdomar och betraktas som en inflammationsmarkör [42–43]. Dessutom har TNF-⍺ en nyckelroll i immunreaktioner associerade med celiaki [44]. Stimulerade och aktiverade T-hjälparceller (Th-celler) uppreglerar uttrycket av IFN-γ, TNF-⍺ i tarmslemhinnan hos glutenintoleranta individer i samband med glutenintag [40–41,45]. Koncentrationen av IFN-γ och TNF-⍺ i kroppsvätskor kan detekteras på olika sätt, bland annat genom enzymkopplad
immunadsorberande analys (ELISA) eller analysering av genuttryck med quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) [46–47].
IFN-γ produceras av naturliga mördarceller (NK) celler, cytotoxiska T-celler, Th-celler och makrofager [48]. Th-celler kan differentieras till fyra distinkta typer, bland annat Th1- och Th2-celler. Th1-celler är proinflammatoriska (som fokuserar på att skydda kroppen från patogena mikrober genom ett cellmedierat immunsvar), medan Th2-celler medierar ett humoralt immunsvar [49–50]. Cytokinet IFN-γ signalerar genom IFN-γ receptorer, som finns på cellmembranet på de allra flesta celler. Detta gör att cytokinet kan binda till nästan alla celltyper och framkalla respons genom att antingen inducera eller inhibera cellulära
funktioner via direkt påverkan på genuttryck [51–53]. IFN-γ:s primära roll är aktivering av makrofager, som intracellulärt dödar patogener. IFN-γ stimulerar makrofager att producera interleukin-12, ett cytokin som är nödvändig för proliferation av Th1-celler som stödjer kontinuerlig utsöndring av IFN-γ [54]. IFN-γ är känd för att inhibera Th2-celler, på så sätt kan Th2-celler inte förhindra Th1-celler från att proliferera och utsöndra proinflammatoriska cytokiner.
TNF-⍺ produceras av aktiverade makrofager, monocyter, T-celler, B-celler, NK celler och flera andra celltyper. Cytokinet har pleiotropisk effekt på normala och maligna celler, vilket innebär att cytokinet kan binda till flera olika receptorer och påverka cellerna på diverse sätt [55–56]. Inom immunsystemet har TNF-⍺ både endokrint och parakrint medierande
funktioner. Cytokinet är också känt för att reglera tillväxt och differentieringsgrad hos olika celltyper [55–57].
Mitogener
Cellstimulering kan utföras på olika sätt, bland annat med hjälp av mitogener. Mitogener kallas de substanserna som stimulerar cellkulturer till polyklonal proliferation [58]. Några exempel är fytohemagglutinin (PHA) som naturligt finns i Phaseolus vulgaris (röd
kidneyböna) och phorbol myristate acetate (PMA), en phorbol ester som kontrollerar
cellsignalering [59]. Det är dokumenterat att både PHA och PMA uppreglerar B- och T-cells proliferation [60]. Ett annat exempel är endotoxinet lipopolysackarid (LPS) som finns i gramnegativa bakteriers cellvägg. Lipid A är lipiddelen i LPS och har toxiska egenskaper.
LPS utsöndras som små mikroskopiska vesiklar från cellmembranet eller frisätts när bakterier dör eller lyseras. LPS aktiverar främst monocyter och stimulerar dem att bilda
proinflammatoriska cytokiner [50].
Syfte
Syftet med studien var att undersöka om gluten- och gliadinstimulering av cellerna i helsaliv in vitro kan inducera produktion av IFN-γ och TNF-⍺. Halterna av inducerad IFN-γ och TNF-⍺ jämfördes hos individer med och utan diagnostiserad celiaki.
MATERIAL OCH METOD
Studien genomfördes med 12 försökspersoner (6 individer med bekräftad celiaki och 6 individer utan celiaki). Helsaliv samlades in och cellerna i saliv stimulerades in vitro med gluten och gliadin för att inducera produktion av IFN-γ och TNF-⍺. Rekrytering av försökspersonerna påbörjades i samband med metodutvecklingen. Pilotstudier för att bestämma koncentrationer och inkubationstider utfördes med två försökspersoner (med och utan celiaki) innan salivprov från resten av försökspersonerna samlades in.
Urval
Frivilliga försökspersoner över 18 år godkändes oavsett kön, ålder, vikt, etnicitet,
medicinering eller levnadsvanor. Studien annonserades ut i sällskapskretsar för att samla frivilliga försökspersoner. Studien skapade inga begränsningar för försökspersonerna, varken i medicinsk aspekt eller i avseende på deras dagliga levnadsvanor. Etikansökan utfördes, eftersom studien involverade människor och biologiskt provmaterial. Ett godkännande erhölls av Etikrådet vid Malmö universitet, Fakulteten för Hälsa och samhälle, 2022-01-14 (HT 2021/löp nr 11). Studien fokuserade endast på resultatet med avseende om personen har celiaki eller inte, därför begärdes inga officiella personuppgifter. All information
avidentifierades, i stället fick försökspersonerna ett nummer som kopplade dem till proven.
Studien var inte en blindstudie. Det var ytterst viktigt att påpeka att deltagandet var frivilligt.
Försökspersonerna hade rätt att ångra sitt deltagande, då deras välmående prioriterades över studien.
Provtagning
Försökspersonerna ombads att varken dricka eller äta 30 minuter innan provtagningen.
Helsaliv (cirka 8 mL) samlades med hjälp av passive drooling metoden, varvid
försökspersonerna fick hålla ett 15 mL sterilt provrör (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) mot läpparna och låta saliven rinna ner i röret. I samband med provtagningen fick
försökspersonerna fylla i en enkät om deras levnadsvanor, vilket endast användes för att identifiera felkällor vid behov (Bilaga 1). Provtagningsrören förvarades inför analys vid 4 ℃.
Stimuleringen av cellerna i helsaliv påbörjades inom 8 timmar efter provtagningen.
Pilotstudier
Metodutveckling innefattade flertal pilotstudier för att hitta de mest optimala parametrarna för studien. Alla prover analyserades i dubbletter (med och utan stimulering) för att utvärdera förändringar. Med pilotstudier undersöktes hur stimuleringskoncentrationer och
inkubationstid påverkade inducerad produktion av de proinflammatoriska cytokinerna IFN-γ och TNF-⍺ på gen och proteinnivå.
En stamlösning av enzymatiskt nedbrutet gliadin bereddes med hjälp av gliadin (100 mg/mL;
Sigma-Aldrich, MO, USA) och pepsin (2 mg/mL; Kebo, Stockholm, Sverige) som löstes upp i saltsyra (0,2 M), samt inkuberades i 2 timmar vid 37 ℃. Lösningens pH justerades till 7,4 med hjälp av natriumhydroxid (1 M) innan trypsin (2 mg/mL; Merck, Darnstadt, Tyskland) tillsattes och lösningen inkuberades på skak (250 rpm) under 4 timmar vid 37 ℃. Den enzymatiska reaktionen stoppades genom inkubation i 30 minuter vid 100 ℃ [61].
Stamlösningen delades upp i alikvoter (<100 mg/mL gliadin) och förvarades vid -20 ℃.
Försökspersonernas helsaliv (cirka 8 mL) centrifugerades först 300× g i 5 minuter, för att pelletera cellerna i saliven. Majoriteten av supernatanten avlägsnades. Pelleten
resuspenderades i den återstående supernatanten och delades upp i 750 µL alikvoter för respektive analys. Initialt testades stimulering med både gluten och gliadin genom att i olika omgångar stimulera cellerna i 750 µL saliv med 0,05 g gluten- respektive gliadinpulver (Sigma-Aldrich, MO, USA), samt 500 µL av stamlösningen (<100 mg/mL gliadin). Även olika mitogener användes för att förstärka proliferation och reaktivitet hos immunceller i saliv. Vid varje analys stimulerades cellerna i helsaliv separat med PHA (5 µg/mL i totalvolymen; Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), PMA (50 ng/mL i totalvolymen;
Sigma-Aldrich, MO, USA) eller LPS från Escherichia coli O111:B4 (1 µg/mL i totalvolymen; Sigma-Aldrich, MO, USA) för att kontrollera om inducering av IFN-γ respektive TNF-⍺ var möjlig [59]. Under varje stimulering inkuberades proverna på vagga vid 37 ℃ (2, 4, 6 respektive 20 timmar). Därefter centrifugerades salivproverna 13 000× g i 10 minuter och en kvantitativ bestämning av IFN-γ och TNF-⍺ i supernatanten utfördes med ELISA.
Efter utvärdering av pilotstudierna, fastslogs att salivproverna alikvoteras i tre rör för
respektive cytokin: ostimulerat; mitogenstimulerat; stimulerat med nedbrutet gliadin (<40 mg gliadin). Mitogenerna PHA (5 µg/mL) och PMA (50 ng/mL) valdes för IFN-γ inducering, samt LPS (1 µg/mL) valdes för TNF-⍺ inducering. Inkubationstiden fastslogs till 20 timmar.
ELISA
Cytokinerna IFN-γ och TNF-⍺ kvantifierades med hjälp av sandwich ELISA enligt företagets protokoll (Human IFN-γ ELISA, Invitrogen, USA och Human TNF-⍺ DuoSet ELISA, R&D Systems, USA som komplementerades med Ancillary Reagent Kit 2, R&D Systems, USA).
Plattorna coatades med respektive antikropp och blockerades sedan för att förhindra ospecifik bindning. Standardserierna och salivsupernatanterna förbereddes och applicerades på
respektive 96-hålsplatta. Biotinylerade detektionsantikroppar mot IFN-γ och TNF-⍺ tillsattes i respektive platta. Peroxidasmärkt streptavidin, TMB substrat (möjliggör färgframkallning) och stopplösning tillsattes till respektive platta innan spektrofotometrisk analys utfördes (Biotek PowerWave XS) vid våglängd 450 nm med 540 nm som referensvåglängd. Efter varje tillsats inkuberades plattan och brunnarna tvättades noga mellan tillsatserna. De erhållna absorbansvärdena sammanställdes och 4 parameter logistiska regressioner skapades baserat på respektive standardserie i plattläsarens mjukvaruprogram Gen5™ 2.05.5 Microplate Data Collection & Analysis Software (Biotek). Funktionerna användes för
koncentrationsbestämning av salivproven.
RT-qPCR
På grund av att inget IFN-γ kunde detekteras i supernatanterna med ELISA kontrollerades genuttrycket i cellerna med RT-qPCR, innan salivprov från resten av försökspersonerna samlades in. RT-qPCR kan detektera och relativt kvantifiera ribonukleinsyra (RNA) i provmaterial. Provtagning, stimulering och inkubation utfördes enligt den optimerade metoden. Efter inkubation centrifugerades salivproverna 13 000× g i 10 minuter och supernatanterna avlägsnades. RNA extraherades från cellpelleten med hjälp av Isolate II RNA Mini Kit (Bioline, USA) enligt företagets protokoll. cDNA bereddes av RNA i respektive prov enligt SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit (Bioline, USA) i PCR Thermal Cycler XT96 Gradient (VWR International) instrumentet. Vid respektive cDNA
syntetiseringen användes kitets reagenser, samt 10 µL nukleasfritt vatten och 5 µL extraherat RNA. cDNA späddes 1:2 med dubbeldestillerat vatten. Koncentrationen och renheten av cDNA kontrollerades med NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific) enligt instrumentet protokoll. Absorbansmaximum för dubbelsträngat DNA (dsDNA) är vid våglängd 260 nm. Absorbanskvoten för värdena erhållna vid 260 och 280 nm, A (260/280) ger information om renheten hos DNA:t. Kvotvärde på 1,8 betecknar rent DNA, medan högre värden än så innefattar RNA kontamination (rent RNA vid kvotvärdet 2,0). A (260/230) kvoten upplyser om kemikalierester i provmaterial. Kvotvärde på 2,0–2,2 betecknar frånvaron av oönskade kemikalier, medan lägre värde tyder på kontamination. I väntan på analys förvarades RNA:t vid -80 ℃ och cDNA:t vid -20 ℃.
Generna för IFN-γ och TNF-⍺ var av intresse, men även glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH) analyserades som housekeeping gen. GAPDH finns i alla humana celler och fungerar som en intern kontroll [62–63]. GAPDH genen verifierar att
amplifieringen utfördes på humant genom och att ingen PCR inhibering föreligger, samt de erhållna värdena för genen används som jämförelsevärde vid kvantifiering av inducerad IFN- γ och TNF-⍺ i salivproverna. Inför qPCR pipetterades proverna som triplikat i en FrameStar® 96-hålsplatta (4titude, Surrey, UK). Varje brunn innehöll 3 µL nukleasfritt vatten, 10 µL SensiFAST™ SYBR® No-ROX (Meridian Bioscience, USA), 1 µL forward primer (10 μM) med tillhörande 1 µL reverse primer (10 μM) (Tabell 1), samt 5 µL av respektive cDNA eller vatten (negativ kontroll). Plattan centrifugerades 1500× g i 2 minuter och förvarades inför analys vid 4 ℃. Analysen utfördes med realtids-PCR LightCycler 480 II (Roche). Proverna värmdes till 95 ℃ innan amplifieringen påbörjades. Under 45 cykler upprepades denaturering (95 ℃ i 10 sekunder), annilering (60 ℃ i 10 sekunder) och elongering (72 ℃ i 10 sekunder).
Icke sekvensspecifik detektion med SYBRgreen tillämpades, vilket innebar att flourescenssignaler detekterades i realtid under elongeringsfasen. Flourescenen var proportionell mot den amplifierade nukleinsyramängden i provmaterialet. Även
smältpunktsanalys utfördes. Olika amplikon har olika smältpunkt baserat på deras struktur och uppbyggnad. Genom att derivera fluorescensvärden beroende på temperaturen för respektive amplikon erhölls deras smältpunkt. Smältpunktsanalys kan beteckna om olika amplikon har olika nukleotidsammansättning (exempelvis mutation bland nukleotiderna) eller om det finns flera olika amplikon i ett provmaterial (exempelvis flera olika gensekvenser) [63–64]. Ct-värde (antal cykler) kallas tröskelvärdet då den detekterade fluorescensen från provmaterialet överstiger bakgrundssignalen [63–65]. De erhållna Ct-värdena och rådata från smältpunktsanalys sammanställdes i mjukvaruprogrammet LightCycler® 480 Software, version 1.5.0.39 (Roche) och tolkades.
Medel Ct-värden för triplikaterna av GAPDH och TNF-⍺ genen beräknades. Produktionen av TNF-⍺ (normaliserat värde) noterades som differensen mellan GAPDH:s och TNF-⍺:s medel Ct-värde. Fold expression termen beskriver hur många gånger kvantiteten av en analyt
fördubblas mellan två olika mätningar. Fold expression erhölls genom att beräkna 2 upphöjt till differensen mellan olika medel Ct-värden. Signifikant avvikande förändring betecknas av fold expression term som ärstörre än 2,5 [66]. Ostimulerat salivprov jämfördes dels med endast PHA och PMA stimulerat salivprov, dels med enzymatiskt nedbrutet gliadin, PHA och PMA stimulerat salivprov.
Tabell 1. Sammanställning av primersekvenserna som användes för qPCR.
Genotyp Primersekvens
GAPDH Forward 5’ AACAGCGACACCCACTCCTC Reverse 5’ GGAGGGGAGATTCAGTGTGGT IFN-γ Forward 5’ GAGTGTGGAGACCATCAAGGA Reverse 5’ TGCAGGCAGGACAACCATTA TNF-⍺ Forward 5’ CTGCTGCACTTTGGAGTGAT
Reverse 5’ CTGGTTATCTCTCAGCTCCA
RESULTAT
Med hjälp av sandwich ELISA undersöktes produktionen av IFN-γ och TNF-⍺ i salivprover.
I pilotstudier kunde ingen cytokinproduktion induceras efter stimulering med gluten-
respektive gliadinpulver. Även i salivprover som inkuberades kortare tid än 20 timmar kunde inga cytokiner detekteras. Enligt den framtagna metoden undersöktes salivprover som var ostimulerade, samt stimulerade med mitogen och enzymatiskt nedbrutet gliadin (<40 mg gliadin) efter 20 timmars inkubation. IFN-γ halterna hos båda försökspersonerna var under detektionsgränsen (4 pg/mL), även i PHA (5 µg/mL) och PMA (50 ng/mL) stimulerade prover. Efter utvärdering av pilotstudierna noterades att stimulering med enzymatiskt
nedbrutet gliadin (<40 mg gliadin i totalvolymen) och LPS (1 µg/mL i totalvolymen) efter 20 timmars inkubation inducerade TNF-⍺ produktion hos försökspersonen utan celiaki. I
ostimulerad saliv detekterades 62 pg/mL TNF-⍺, medan cytokinproduktionen var 856 pg/mL i LPS stimulerat saliv och 386 pg/mL i saliv stimulerat med nedbrutet gliadin. TNF-⍺ halten hos försöksperson med celiaki var under detektionsgränsen (15,6 pg/mL) i ostimulerad saliv samt saliv stimulerat med LPS respektive nedbrutet gliadin.
Eftersom inget IFN-γ kunde detekteras i salivsupernatanterna undersöktes genuttrycket av IFN-γ och TNF-⍺ med RT-qPCR. Koncentration och renhet av det syntetiserade cDNA visas i tabell 2.
Tabell 2. Sammanställning av koncentration och renhet av det syntetiserade cDNAt. FD betecknar försöksperson utan celiaki, medan CD är försöksperson med celiaki. A= absorbans.
Koncentration,
ng/µL A(260
280) A(260
230)
FD ostimulerat 574,15 1,73 1,18
FD PHA/PMA 573,35 1,74 1,19
FD enzymatiskt nedbrutet gliadin + PHA/PMA 568,11 1,75 1,20
CD ostimulerat 560,36 1,74 1,18
CD PHA/PMA 575,16 1,75 1,20
CD enzymatiskt nedbrutet gliadin + PHA/PMA 554,91 1,76 1,20
Efter utförandet av qPCR sammanställdes Ct-värden med hänsyn till data från
smältpunktsanalys (Tabell 3). Erhållna värden för GAPDH validerade analysmetoden och det erhållna resultatet. GAPDH respektive TNF-⍺ genen hade överensstämmande värden i smältpunktsanalysen, medan smältkurvan för IFN-γ genen hade flera avvikande toppar.
Enligt RT-qPCR kunde IFN-γ genen varken amplifieras eller kvantifieras, vilket innebar att inducering av IFN-γ inte var möjligt med den framtagna metoden och kunde uteslutas från nästa stadie där saliv från försökspersonerna samlades in. Försökspersonen utan celiaki visade förhöjt genuttryck av TNF-⍺ efter stimulering, medan någon ökning i genuttryck hos försökspersonen med celiaki kunde fortfarande inte detekteras (Tabell 3).
Tabell 3. Sammanställning av RT-qPCR resultat. Provernas medel Ct-värden och differensen emellan samt fold expression redovisas. Fold expression är beräknat i förhållande till ostimulerad saliv för respektive individ. FD betecknar försöksperson utan celiaki, medan CD är försöksperson med celiaki.
Ct GAPDH Ct TNF-⍺ Ct (TNF-⍺ - GAPDH) Fold expression
FD ostimulerat 25,72 33,90 33,90 – 25,72 = 8,18 2−(8,18−8,18)
= 1,00
FD PHA/PMA 25,47 33,12 33,12 – 25,47 = 7,65 2−(7,65−8,18)
= 1,44
FD enzymatiskt nedbrutet
gliadin + PHA/PMA 27,10 32,53 32,53 – 27,10 = 5,43 2−(5,43−8,18)
= 6,70
CD ostimulerat 28,37 32,54 32,54 – 28,37 = 4,17 2−(4,17−4,17)
= 1,00
CD PHA/PMA 27,68 32,45 32,45 – 27,68 = 4,77 2−(4,77−4,17)
= 0,66
CD enzymatiskt nedbrutet
gliadin + PHA/PMA 27,19 31,82 31,82 – 27,19 = 4,64 2−(4,64−4,17)
= 0,73
Inducering av TNF-⍺ i helsaliv
Efter pilotförsöken genomfördes studien med 12 försökspersoner (6 individer utan respektive med bekräftad celiaki), de stimulerade salivproverna utvärderades enbart medTNF-⍺ ELISA.
Resultatet visade att TNF-⍺ endast kunde kvantifieras i saliv från två av försökspersoner, en med celiaki och en utan. Enzymatiskt nedbrutet gliadin gav en inducering av TNF-⍺ jämfört med ostimulerad kontroll hos båda försökspersonerna (Tabell 4). För övriga 10 deltagare var koncentrationen av TNF-⍺ under detektionsgränsen i alla prov (15,6 pg/mL).
Tabell 4. Sammanställning av TNF-⍺ produktion efter 20 timmars inkubation i salivproverna från två försökspersoner. FD betecknar försöksperson utan celiaki, medan CD är försöksperson med celiaki.
TNF-⍺, pg/mL
FD CD
Ostimulerat 166 118
LPS (1 µg/mL) 160 134
Enzymatiskt nedbrutet gliadin (<40 mg gliadin) 232 150
DISKUSSION
Celiaki är en kronisk, autoimmun sjukdom som drabbar cirka 0,7 % av världens befolkning [6]. Celiaki diagnostiseras med hjälp av gastroskopi och blodprov, genom att påvisa antingen
cirkulerande autoantikroppar mot vävnadstransglutaminas eller närvaro av HLA-DQ2/DQ8- genen hos leukocyter [20, 22–23]. Glutenintoleranta individer kan ha mycket diffusa
symptom, vilket försvårar utredningen. Förutom de oklara symtomen, kan även den befintliga diagnosmetoden vara en bidragande faktor till att sjukdomen är svår att diagnostisera.
Utredning av sjukdomstillståndet är dock viktigt för att förbättra livskvaliteten hos de
drabbade [5]. Diagnostisering i saliv, vilket är en icke-invasiv metod, kan eventuellt bidra till förenklad diagnostik. Provtagningen är snabb, smärtfri och behöver inte tas av utbildad vårdpersonal, till skillnad från blodprover. Även förvaring och transportering av saliv är enklare [25–26,29,38].
Syftet med studien var att undersöka om glutenkänslighet kan påvisas i form av inducerad IFN-γ och TNF-⍺ produktion i helsaliv efter gluten- och gliadinstimulering in vitro. Individer utan celiaki användes som kontroller, detta eftersom vid avsaknad av den autoimmuna
sjukdomen, förväntades ingen immunologisk reaktion induceras vid stimulering med gluten och gliadin. Teoretiskt sett kan kroppens enzymer, bakterier och bakteriella enzymer i saliv bryta ned gluten och gliadin till mindre peptidfragment i en viss utsträckning. Därefter kan mikrobiellt transglutaminas i saliv påverka nedbrytningsprodukterna från gluten och gliadin så att immunceller såsom glutenkänsliga T-celler i saliv aktiveras. På så sätt kan
immunreaktionen som uppstår i tarmens slemhinna efter intag av glutenhaltig mat eventuellt återskapas i saliv (in vitro). Utsöndring av IFN-γ och TNF-⍺ kan tolkas som en del av den framkallade immunreaktionen. Hypotesen var att hos individer med diagnostiserad celiaki, kommer IFN-γ och TNF-⍺ produktionen att öka efter gluten- och gliadinstimulering medan hos kontrollerna sker ingen detekterbar ökning. Cytokinerna IFN-γ och TNF-⍺ valdes för studien eftersom deras roll studerats och kvantifierats i tidigare studier av celiaki [41,44]. Låg cytokinproduktion förväntades, därför prioriterades metoder för kvantifiering med hög
sensitivitet (4 pg/mL för IFN-γ och 15,6 pg/mL för TNF-⍺).
Antal försökspersoner valdes med hänsyn till att kunna validera resultatet och utesluta eventuella falskt positiva utslag. Sammansättningen av saliv är individuell, särskilt med avseende på antalet och typer av celler respektive bakterier. I studien användes
försökspersonernas egen ostimulerade saliv som negativ kontroll. Samma salivprov delades upp i alikvoter inför analys, vilket innebär att dess innehåll innan stimulering var
överensstämmande. Av denna anledning varken beräknades cellantalet eller identifierades bakteriearter i respektive salivprov. De stimulerade och ostimulerade prover har behandlats och inkuberats på samma sätt, vilket gjorde att de kunde jämföras. Litteraturstudier
genomfördes för att utforma processen för provtagningen [28]. Efter granskning av ELISA Sample Preparation Protocols från Thermo Fisher Scientific, bestämdes även hur salivprover ska centrifugeras för att utnyttja maximalt antal celler. Vid låg centrifugeringshastighet pelleteras celler utan att lyseras.
I studien stimulerades celler i helsaliv in vitro för att försökspersonerna inte skulle påverkas negativt av kontakt med gluten. De flesta glutenintoleranta individer kan konsumera upp till 50 mg gluten dagligen utan att uppleva några symtom [5]. Men för vissa räcker det med 10 mg gluten per dag för att tarmskada ska uppkomma [67]. Gliadin som har bearbetats av både pepsin och trypsin, är tillräckligt nedbrutet för att antigenpresenterade celler ska aktiveras av det och sedan presentera det till glutenkänsliga T-celler [68]. Stimulering med mitogener gav information om cytokinproduktion kunde induceras i respektive salivprov. Stimulering med mitogener kunde även bekräfta närvaro av T-celler och/eller monocyter i helsaliv.
I pilotstudierna kunde TNF-⍺ detekteras med ELISA hos försökspersonen utan celiaki.
Resultatet överensstämde inte med litteraturen och resultatet kontrollerades i ett senare stadie med 12 försökspersoner. Trots att TNF-⍺ kvantifierades hos två av 12 försökspersoner (med och utan celiaki), kunde ingen cytokinproduktion induceras hos de övriga försökspersonerna.
Detta implicerade att immunreaktionen som uppstår hos glutenintoleranta individer in vivo inte kunde återskapas i saliv in vitro. Efter utvärdering av enkäterna (Bilaga 1) drogs slutsatsen att den detekterade cytokinproduktionen förmodligen berodde på lokal
inflammation i munhålan. I enkäten avslöjades också att majoriteten av de glutenintoleranta försökspersonerna inte höll en strikt glutenfri diet. Det fanns misstanke om otillräcklig stimulering med enzymatiskt nedbrutet gliadin, eftersom endast <40 mg nedbrutet gliadin i totalvolymen användes för respektive salivprov. Men även den låga halten borde ha
framkallat en immunreaktion med tanke på att försökspersonerna var redan stimulerade med gluten in vivo vid deras sista måltid innan provtagningen. Eftersom alla preanalytiska
förberedelser skedde in vitro misstänks den icke detekterbara cytokinproduktionen i stället bero på följande felkällorna. Det finns risk för att outforskade detaljer eller agens saknades från reaktionskedjan, exempelvis ifall ämnesutbytet mellan blod och saliv in vivo är större vid gliadinstimulering än det som finns dokumenterat, och därmed kunde den förväntade
immunreaktionen inte återskapas. Även brist på näring i saliv kunde försvåra cytokininduceringen, trots det användes inget näringsmedium, just för att förhindra okontrollerad bakterieväxt. Alternativt fanns för få celler i respektive salivprov eller
övervägande delen av cellerna var epitelceller från munhålan i stället för immunceller. Vidare finns det risk för att mängden mikrobiellt transglutaminas som producerades hos
försökspersonerna var otillräcklig.
Inför undersökning av cytokinernas genuttryck med RT-qPCR, var kvotvärdet A (260/230) hos det syntetiserade cDNA:t i respektive salivprov mycket lågt, vilket tyder på
kontamination. Extraktionskitet var inte specifikt framtaget för saliv utan andra sorters kroppsvätskor, därför kunde inte ett högre A (260/230) kvotvärde förväntas. Mycket kemikalierester kan orsaka överskattning av DNA-koncentration och potentiellt störa
efterföljande analyser. Detta hade påverkat sekvenseringsanalyser men hade liten betydelse i denna studie, eftersom endast detektion och kvantifiering av gener utfördes. Kvotvärdet A (260/280) nära 1,8 i alla prover tydde på rent cDNA och frånvaro av RNA. Vid
koncentrationsbestämning skildes dock inte olika typer av nukleinsyror åt från vilka cDNA hade producerats, cDNA:et kunde förutom från cellernas mRNA även ha producerats från cellernas genomiska DNA eller från mRNA och DNA med bakteriell härkomst. Vid detektion med SYBRgreen finns risk för ospecifika signaler, eftersom primers binder till ospecifikt amplifierat dsDNA. Vid icke sekvensspecifik detektion kan inte specifika signaler skiljas från ospecifika. Ct-värden över 35 erhållna med SYBRgreen är opålitliga, i stället prioriteras Ct-värden mellan 20–30 [69]. Smältpunktsanalys utfördes för att undersöka specificiteten hos det amplifierade dsDNA:t. Värdena erhållna från smältpunktsanalysen tillsammans med Ct-värden för GAPDH respektive TNF-⍺ genen, bekräftade att humant cDNA undersöktes.
Med tanke på att ingen cytokinproduktion kunde induceras i saliv in vitro, behöver andra aspekter granskas. Nu för tiden prioriteras molekylärbiologiska metoder alltmer som diagnostiska analyser, exempelvis utredning av HLA:s genomiska nomenklatur [23]. HLA kan både typas och subtypas för att ta reda på den genetiska uppsättningen hos en individ.
Som tidigare beskrevs används i dagsläget blodprov för HLA undersökningar för att diagnostisera celiaki. Även saliv är validerat som provmaterial för genetiska analyser [28].
Jämförelse av HLA-DQ2/DQ8-genen hos leukocyter i blod och saliv skulle därför kunna vara
nästa steg mot en icke-invasiv diagnostisering. I så fall skulle det inte ens krävas någon stimulering av saliv innan analys. Metodens sensitivitet och specificitet i saliv måste valideras men bör överensstämma med blod förutsatt att det finns tillräcklig mängd leukocyter i erhållna salivprov.
KONKLUSION
Syftet med studien var att undersöka om gluten- och gliadinstimulering av celler i helsaliv in vitro kunde inducera produktion av IFN-γ och TNF-⍺. Immunreaktionen som uppstår in vivo hos glutenintoleranta individer kunde inte återskapas i saliv in vitro med den framtagna metoden. Hos övervägande delen av salivproverna kunde varken IFN-γ eller TNF-⍺
kvantifieras.
REFERENSER
1. Kochhar GS, Singh T, Gill A, Kirby DF, (2016) Celiac disease: Managing a multisystem disorder. CCJM, 83(3), 217–27.
2. Bengtsson U, Astma- och allergiförbundet, (2006) Mat och överkänslighet: ett kunskapsunderlag. Stockholm: Astma- och allergiförbundet.
3. Wei G, Helmerhorst EJ, Darwish G, Blumenkranz G, Schuppan D, (2020) Gluten Degrading Enzymes for Treatment of Celiac Disease. Nutrients, 12(7), 2095.
4. Kelly CP, Bai JC, Liu E, Leffler DA, (2015) Advances in Diagnosis and Management of Celiac Disease. Gastroenterology, 148(6), 1175–86.
5. Tye-Din JA, Galipeau HJ, Agardh D, (2018) Celiac Disease: A Review of Current Concepts in Pathogenesis, Prevention, and Novel Therapies. Front. Pediatr. 6:350.
6. Glissen Brown JR, Singh P, (2019) Coeliac disease. Paediatrics and International Child Health, 39(1), 23–31.
7. Pinier M, Fuhrmann G, Verdu E, Leroux J-C, (2010) Prevention Measures and Exploratory Pharmacological Treatments of Celiac Disease. American Journal of Gastroenterology, 105(12), 2551–61.
8. Bromilow SNL, Gethings LA, Langridge JI, Shewry PR, Buckley M, Bromley MJ, m.fl. (2017) Comprehensive Proteomic Profiling of Wheat Gluten Using a
Combination of Data-Independent and Data-Dependent Acquisition. Front. Plant Sci.
7:2020.
9. Kuhn C, Weiner HL, (2016) How does the immune system tolerate food? Science, 351(6275), 810-11.
10. Kong F, Singh RP, (2008) Disintegration of Solid Foods in Human Stomach. J Food Science, 73(5), R67–80.
11. Fu Z, Akula S, Thorpe M, Hellman L, (2021) Marked difference in efficiency of the digestive enzymes pepsin, trypsin, chymotrypsin, and pancreatic elastase to cleave tightly folded proteins. Biological Chemistry, 402(7), 861–7.
12. Gutiérrez S, Pérez-Andrés J, Martínez-Blanco H, Ferrero MA, Vaquero L, Vivas S, m.fl. (2017) The human digestive tract has proteases capable of gluten hydrolysis.
Molecular Metabolism, 6(7), 693–702.
13. Schuppan D, (2000) Current concepts of celiac disease pathogenesis.
Gastroenterology, 119(1), 234–42.
14. Stemcell Technologies, (2019) The Human Leukocyte Antigen (HLA) Complex.
>www.stemcell.com< PDF (2022-03-21)
15. Parzanese I, Qehajaj D, Patrinicola F, Aralica M, Chiriva-Internati M, Stifter S, m.fl.
(2017) Celiac disease: From pathophysiology to treatment. WJGP, 8(2), 27.
16. Björck S, Lindehammer SR, Fex M, Agardh D, (2015) Serum cytokine pattern in young children with screening detected coeliac disease: Cytokines in coeliac disease.
Clin Exp Immunol, 179(2), 230–5.
17. Dewar D, Pereira SP, Ciclitira PJ, (2004) The pathogenesis of coeliac disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36(1), 17–24.
18. Daum S, Cellier C, Mulder CJJ, (2005) Refractory coeliac disease. Best Practice &
Research Clinical Gastroenterology, 19(3), 413–24.
19. Laurikka P, Nurminen S, Kivelä L, Kurppa K, (2018) Extraintestinal Manifestations of Celiac Disease: Early Detection for Better Long-Term Outcomes. Nutrients, 10(8), 1015.
20. Lebwohl B, Sanders DS, Green PHR, (2018) Coeliac disease. The Lancet, 391(10115), 70–81.
21. Sciurti M, Fornaroli F, Gaiani F, Bonaguri C, Leandro G, Di Mario F, m.fl. (2018) Genetic susceptibilty and celiac disease: what role do HLA haplotypes play? Acta Bio Medica Atenei Parmensis, 89(9-S), 17–21.
22. Di Sabatino A, Corazza GR, (2009) Coeliac disease. The Lancet, 373(9673), 1480–
93.
23. Dahle C, Truedsson L, (2012) Immunologiska analyser vid celiaki. I: Truedsson L, (Red) Klinisk immunologi. Lund: Studentlitteratur.
24. Naiff PF, Ferraz R, Cunha CF, Orlandi PP, Boechat AL, Bertho ÁL, m.fl. (2014) Immunophenotyping in Saliva as an Alternative Approach for Evaluation of Immunopathogenesis in Chronic Periodontitis. Journal of Periodontology, 85(5), e111–20.
25. Theda C, Hwang SH, Czajko A, Loke YJ, Leong P, Craig JM, (2018) Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Sci Rep, 8(1), 6944.
26. Tiwari M, (2011) Science behind human saliva. J Nat Sc Biol Med, 2(1), 53.
27. Pay JB, Shaw AM, (2019) Towards salivary C-reactive protein as a viable biomarker of systemic inflammation. Clinical Biochemistry, 68, 1–8.
28. Middleton LYM, Dou J, Fisher J, Heiss JA, Nguyen VK, Just AC, m.fl. (2020) Saliva cell type DNA methylation reference panel for epidemiology studies in children.
>https://www.medrxiv.org< HTML (2021-09-11)
29. Yoshizawa JM, Schafer CA, Schafer JJ, Farrell JJ, Paster BJ, Wong DTW, (2013) Salivary Biomarkers: Toward Future Clinical and Diagnostic Utilities. Clin Microbiol Rev, 26(4), 781–91.
30. Rahim MAA, Rahim ZHA, Ahmad WAW, Hashim OH, (2015) Can Saliva Proteins Be Used to Predict the Onset of Acute Myocardial Infarction among High-Risk Patients? Int J Med Sci, 12(4), 329–35.
31. Baum BJ, Yates JR, Srivastava S, Wong DTW, Melvin JE, (2011) Scientific Frontiers: Emerging Technologies for Salivary Diagnostics. Adv Dent Res, 23(4), 360–8.
32. Bonamico M, Nenna R, Montuori M, Luparia RPL, Turchetti A, Mennini M, m.fl.
(2011) First Salivary Screening of Celiac Disease by Detection of Anti- transglutaminase Autoantibody Radioimmunoassay in 5000 Italian Primary Schoolchildren. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition, 52(1), 17–20.
33. Bonamico M, Ferri M, Nenna R, Verrienti A, Di Mario U, Tiberti C, (2004) Tissue transglutaminase autoantibody detection in human saliva: a powerful method for celiac disease screening. The Journal of Pediatrics, 144(5), 632–6.
34. Sebastian-delaCruz M, Olazagoitia-Garmendia A, Huerta Madrigal A, Garcia-
Etxebarria K, Mendoza LM, Fernandez-Jimenez N, m.fl. (2021) A Novel Noninvasive Method Based on Salivary Inflammatory Biomarkers for the Screening of Celiac Disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology, 12(4), 1511- 1513.
35. Tian N, Faller L, Leffler DA, Kelly CP, Hansen J, Bosch JA, m.fl. (2017) Salivary Gluten Degradation and Oral Microbial Profiles in Healthy Individuals and Celiac Disease Patients. Appl Environ Microbiol, 83(6), e03330-16.
36. Caminero A, Galipeau HJ, McCarville JL, Johnston CW, Bernier SP, Russell AK, m.fl. (2016) Duodenal Bacteria From Patients With Celiac Disease and Healthy
Subjects Distinctly Affect Gluten Breakdown and Immunogenicity. Gastroenterology, 151(4), 670–83.
37. Fatima SW, Khare SK, (2018) Current insight and futuristic vistas of microbial transglutaminase in nutraceutical industry. Microbiological Research, 215, 7–14.
38. Lynge-Pedersen AM, (2015) Saliv som diagnostiskt redskap – möjligheter och begränsningar. Tandläkartidningen, 2, 66-72.
39. Mühl H, Pfeilschifter J, (2003) Anti-inflammatory properties of pro-inflammatory interferon-γ. International Immunopharmacology, 3(9), 1247–55.
40. Rueda B, Martínez A, López-Nevot MA, Mas-Fontao A, Paco L, Ortega E, m.fl.
(2004) A functional variant of IFNγ gene is associated with coeliac disease. Genes Immun, 5(6), 517–9.
41. Wapenaar MC, van Belzen MJ, Fransen JH, Fariña Sarasqueta A, Houwen RHJ, Meijer JWR, m.fl. (2004) The interferon gamma gene in celiac disease: augmented expression correlates with tissue damage but no evidence for genetic susceptibility.
Journal of Autoimmunity, 23(2), 183–90.
42. Basu PP, Shah NJ, Hampole HN, Krishnaswamy N, Pacana T, Rayapudi K, (2010) S2032 Assessment of Tissue Tumor Necrosis Factor Alfa as a Novel Marker for Latent Celiac Disease. Gastroenterology, 138(5), S-305.
43. Li P, Zheng Y, Chen X, (2017) Drugs for Autoimmune Inflammatory Diseases: From Small Molecule Compounds to Anti-TNF Biologics. Front Pharmacol, 8:460.
44. Rezaei-Tavirani S, Rostami-Nejad M, Vafaee R, Khalkhal E, Keramatinia A, Ehsani Ardakani MJ, m.fl. (2019) Introducing tumor necrosis factor as a prominent player in celiac disease and type 1 diabetes mellitus. Gastroenterology and Hepatology from Bed to Bench, (Vol 12 (2019): Supplement 1-Autumn, 123–9.
45. Feighery C, O’Keefe J, (2003) TNF-α production by intraepithelial T cells in celiac disease. Gastroenterology, 125(5), 1560–1.
46. Sánchez-Tirado E, González-Cortés A, Yáñez-Sedeño P, Pingarrón JM, (2020) Electrochemical immunosensor for the determination of the cytokine interferon gamma (IFN-γ) in saliva. Talanta, 211, 120761.
47. Peinnequin A, Mouret C, Birot O, Alonso A, Mathieu J, Clarençon D, m.fl. (2004) Rat pro-inflammatory cytokine and cytokine related mRNA quantification by real-time polymerase chain reaction using SYBR green. BMC Immunol, 5(1), 3.
48. Griffin DE (2008) Cytokines and Chemokines. III: Mahy BWJ, Van Regenmortel MHV, (Red) Encyclopedia of virology. Amsterdam: Elsevier/Academic Press.
49. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, m.fl. (2001) The mucosal immune system. V.
Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. New York: Garland Science.
50. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S, Baker DL, (2020) Basic immunology: functions and disorders of the immune system. VI. Elsevier.
51. Payne S, (2017) Viruses: From Understanding to Investigation. Elsevier/Academic Press.
52. Young HA, Hodge DL, (2003) Interferon-γ. Henry HL, Norman AW, (Red) Encyclopedia of hormones. Amsterdam: Academic Press.
53. Tau G, Rothman P, (1999) Biologic functions of the IFN-gamma receptors. Allergy, 54(12), 1233–51.
54. Ratcliffe MJH, (2016) Encyclopedia of immunobiology. Boston, Massachusetts:
Elsevier/Academic Press.
55. Meyler’s Side Effects of Drugs, (2016) Tumor necrosis factor alfa. XVI: Elsevier.
230–2.
56. Atzeni F, Sarzi-Puttini P, (2013) Tumor Necrosis Factor. II: Brenner’s Encyclopedia of Genetics. Elsevier, 229–31.
57. Fitzgerald KA, O’Neill LAJ, Gearing AJH, Callard RE, (2001) TNFα. II: The Cytokine FactsBook and Webfacts. Elsevier, 474–80.
58. Winqvist O, (2012) Analyser av immunceller. I: Truedsson L, (Red) Klinisk immunologi. Lund: Studentlitteratur.
59. Truedsson L, (2012) Analysmetoder. I: Truedsson L, (Red) Klinisk immunologi. Lund:
Studentlitteratur.
60. Jeon RL, Gilbert C, Cheng J, Putz AM, Dyck MK, Plastow GS, m.fl. (2021)
Proliferation of peripheral blood mononuclear cells from healthy piglets after mitogen stimulation as indicators of disease resilience. Journal of Animal Science, 99(8), skab084.
61. Hudec M, Riegerová K, Pala J, Kútna V, Černá M, O´Leary VB, (2021) Celiac Disease Defined by Over-Sensitivity to Gliadin Activation and Superior Antigen Presentation of Dendritic Cells. IJMS, 22(18), 9982.
62. Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, De Borman B, Coumans B, Hennen G, m.fl. (1999) Housekeeping genes as internal standards: use and limits. Journal of Biotechnology, 75(2–3), 291–5.
63. Bankowski MJ, Anderson SM, (2004) Real-time nucleic acid amplification in clinical microbiology. Clinical Microbiology Newsletter, 26(2), 9–15.
64. Rapley R, (2018) Recombinant DNA Techniques and Molecular Cloning. VIII:
Wilson K, Walker JM, Hofmann A, Clokie S, (Red) Wilson and Walker’s principles and techniques of biochemistry and molecular biology. Cambridge, United Kingdom;
New York, NY, USA: Cambridge University Press.
65. Sidstedt M, Rådström P, Hedman J, (2020) PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS—mechanisms and solutions. Anal Bioanal Chem, 412(9), 2009–23.
66. Goni R, García P, Foissac S, (2009) The qPCR data statistical analysis. Integromics White Paper.
67. Spector Cohen I, Day AS, Shaoul R, (2019) Gluten in Celiac Disease—More or Less?
Rambam Maimonides Medical Journal, 10(1), e0007.
68. Jabri B, Sollid L, (2009) Tissue-mediated control of immunopathology in coeliac disease. Nature Reviews Immunology, 9, 858–870.
69. Rao X, Sun J, (2015) Development of SYBR Green I Based Real-Time RT-PCR Assay for Specific Detection of Watermelon silver mottle Virus. Iranian Journal of Biotechnology, 13(3), 20–24.
BILAGA 1.
Celiaki (glutenintolerans) innebär att kroppen reagerar på proteinet gluten som finns i de flesta sädesslag såsom vete, havre och råg. Celiaki är en autoimmun sjukdom, vilket innebär att kroppen attackerar sina egna celler i samband med nedbrytningen av gluten. Celiaki har mycket diffusa symtom och således är det svårt att upptäcka sjukdomen. Målet med studien är att utveckla en icke-invasiv diagnostiseringsmetod med hjälp av salivprov, så att flera ska våga testa sig och få rätt behandling vid behov. Som försöksperson kommer Du varken att påverkas eller gynnas av studien, förutom att Du bidrar till att studien kan utföras. För att skona kroppen så mycket som möjligt, utnyttjas den befintliga bakteriefloran i munnen i stället för någon extra stimulans. Salivproven kommer stimuleras in vitro med gluten på laboratorium, på så sätt kommer Du som försöksperson inte få några negativa konsekvenser av studien. Kroppen och bakteriefloran förändras beroende på medicinering och
levnadsvanor, därför ställs ingående frågor för att optimalt kunna utvärdera resultatet av studien. Varken namn eller personnummer krävs för studien. Vid eventuell publicering av provresultat kommer all information hållas anonymt. Deltagandet är frivilligt och alla har rätt att ångra sitt deltagande. Både enkäten och provmaterialet kommer strikt att endast användas för examensarbetet.
Testnummer Provtagningsdatum
Ålder Kön
Vikt Längd
Finns det något Du utesluter från din kost? Om ja, vad?
Konsumerar du probiotisk bakteriekultur? Om ja, hur ofta? När gjorde Du det sist?
Har Du under de senaste 6 månaderna konsumerat antibiotika? Om ja, när?
Tränar Du? Om ja, hur ofta?
Röker Du? Om ja, hur ofta?
Konsumerar Du droger? Om ja, hur ofta?
Konsumerar Du sprit? Om ja, hur ofta?
Markera om det är något av följande:
Öl Whiskey Scotch Vodka Bourbon
Har Du borstat tänderna inom de senaste 6 timmarna innan provtagningen? Om ja, när?
………
Upplever du någon eller några av följande symtom/sjukdom? Hur ofta?
● Inget alls
● Buksmärta
● Kräkning
● Illamående
● Uppblåsthet
● Kronisk diarré
● Förstoppning
● Gaser i magen
● Laktosintolerans
● Lös, oljig, klumpig och illaluktande faeces
● Järnbristanemi
● Kliande hudblåsor
● Diabetes
● Övrigt …...
Har Du celiaki (glutenintolerans)?
● Ja (diagnostiserad) sedan ………….
● Jag tror det (odiagnostiserad)
● Jag tror inte det (odiagnostiserad)
● Nej (bekräftat, negativt provresultat eller aldrig upplevt några av de tidigare nämnda symtomen)
Är Du immunsupprimerad (har nedsatt immunförsvar)?
● Ja
● Nej
