Linköpings universitet | Institution för fysik, kemi och biologi Examensarbete, 16 hp | Kemisk Analysteknik Vårterminen 2020 | LITH-IFM-G-EX—20/3852--SE
Spårmängdsanalys av
explosivämnen
Författare: Cheryl Loorents
Examinator: Johan Dahlén Handledare: Hans Önnerud
Datum Date 2020-06-03 Avdelning, institution
Division, Department
Department of Physics, Chemistry and Biology Linköping University
URL för elektronisk version
ISBN
ISRN: LITH-IFM-G-EX--20/3852--SE
_________________________________________________________________
Serietitel och serienummer ISSN
Title of series, numbering ______________________________ Språk Language Svenska/Swedish Engelska/English ________________ Rapporttyp Report category Licentiatavhandling Examensarbete C-uppsats D-uppsats Övrig rapport _____________ Titel Title Spårmängdsanalys av explosivämnen Författare Author Cheryl Loorents Nyckelord Keyword
Spårmängdsanalys, explosivämnen, R-salt, TNT, PETN, LC-UV, SPE, LC-MS
Sammanfattning Abstract
There is an alarming increase of explosions with devastating consequences, the ultimate being loss of life. Furthermore, these kinds of substances have a toxic effect on animals, nature and humans if they are incorrectly disposed. In order to counteract the rising trend and increase the feeling of security within the society, the Swedish Defense Research Agency (FOI) has started a new project which in the future might be used by the police in order to prevent possible terrorist attacks. The aim with this new project is to perform trace analysis of explosives in wastewater in order to receive an indication of where illegal production of explosives takes place. This method has the potential to be used for other matrixes, such as soil instead of wastewater or other water matrixes, thereby exposing possible harmful and contaminated places.
The aim with this thesis was to develop a method for an Ultra-High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) instrument in order to perform trace analysis of explosives in wastewater. Furthermore, the aim was also to develop a method for an automated solid phase extraction (SPE) instrument for sample clean-up. Lastly mass spectrometry was performed with a triple-quadrupole. A performance analysis was made for the developed UHPLC-method which resulted in a good repeatability. Furthermore, several experiments were conducted on the SPE-instrument in order to receive a yield close to 100%. The different experiments included comparison between the most beneficial eluent, volume of eluent and evaporation step. The highest yield was received with 3 ml acetonitrile without any evaporation step. A performance analysis was made of the developed method for the SPE-robot, which resulted in a good accuracy and precision. In hopes of lowering the detection limit, mass spectrometry was conducted by a preciously validated instrument based at FOI. A lower detection limit was received for all substances; R-salt 0,025 µg/ml, TNT 0,094 µg/ml and PETN 0,103 µg/ml.
Förord
Detta arbete var den slutgiltiga delen av mina studier inom Högskoleingenjörsprogrammet i Kemisk Analysteknik vid Linköpings Universitet. Jag utförde arbetet på Totalförsvarets Forskningsinstitut (FOI) vid Grindsjön som har varit otroligt lärorikt och spännande att få sätta mina kunskaper på prov. Det har varit väldigt intensivt men samtidigt ytterst roligt att genomföra detta arbete. Med det vill jag tacka hela FOI vid Grindsjön för den stöttning jag fått samt för den fantastiska tiden jag fick spendera hos er.
Jag vill utbringa ett stort tack till Hans Önnerud som har handlett detta arbete med ett stort engagemang och entusiasm, utan dig hade jag inte kunnat slutföra detta arbete. Vidare vill jag rikta ett stort tack till Erik Holmgren som ställde upp med sin otroliga expertis och för att alltid sträcka ut en hjälpande hand. Jag vill även tack Emma Lundell som har hjälp till att integrera de sista kromatogrammen för masspektrometrianalysen som jag inte hann göra själv. Ett stort tack till Stefan Ek som har syntetiserat alla explosivämnena som har använts i arbetet. Dessutom vill jag tack Dennis Menning som bland annat har hjälpt till att portionera och väga upp samtliga explosivämnen. Sist går ett stort tack till min examinator Johan Dahlén som har gett ett oerhört bra stöd under arbetets gång.
Cheryl Loorents Linköping, maj 2020
Sammanfattning
Enligt statistik från Brottsförebyggande rådet ökar antalet sprängningar i Sverige. Denna ökning resulterar i allvarliga konsekvenser och är en stor fara för allmänheten. Explosivämnen har även en toxisk inverkan på djur, natur och människan vilket innebär att de är en miljö- och hälsofara för omgivningen, om de dumpas i naturen och inte omhändertas på rätt sätt. För att motarbeta denna oroväckande ökning och stärka tryggheten i samhället har Totalförsvarets Forskningsinstitut (FOI) påbörjat ett nytt forskningsarbete som i framtiden polisiära myndigheter skulle kunna utnyttja. Arbetet omfattar spårmängdsanalys av explosivämnen i avloppsvatten, vilket förhoppningsvis kan ge en indikation om att olaglig tillverkning av sprängämnen sker. Men det finns även potential att använda metoden för andra matriser som exempelvis markprover för att uppmärksamma miljö-och hälsofarliga platser (eller andra vattenprover som kan tänkas vara kontaminerade).
Syftet med detta arbete var att utveckla en Ultra-High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) metod för spårmängdsanalys av explosivämnen i avloppsvatten. En provupparbetningsmetod baserat på automatisk fastfasextraktion skulle även utvecklas. Vidare testades masspektrometri i form av trippel-kvadrupol. Repeterbarheten för den valda UHPLC-metoden analyserades som gav en låg spridning mellan mätningar, vilket resulterade i en god repeterbarhet. Vidare utfördes flera tester av fastfasextraktionsroboten för att identifiera det gynnsammaste elueringsmedlet och elueringsvolymen som var 3 ml acetonitril. Tester för olika indunstningssteg gjordes i syfte att sänka detektionsgränsen (LOD), men visade sig vara för komplext att hinnas med i detta arbete. När metoden var fastställd för fastfasextraktionsroboten analyserades noggrannheten som resulterade i både en god riktighet och precision. Masspektrometrianalys gjordes med förhoppningen att sänka LOD, vilket det gjorde för samtliga substanser. För R-salt var LOD 0,025 µg/ml, för TNT 0,094 µg/ml och för PETN 0,103 µg/ml.
Förkortningar
TNT 2,4,6-trinitrotoluen RDX 1,3,5-trinitroperhydro-1,3,5-triazin PETN [3-nitrooxy-2,2-bis(nitrooxymetyl)propyl]nitrat R-salt Hexahydro-1,3,5-trinitroso-1,3,5-triazin LC Liquid-Chromatography (Vätskekromatografi) UHPLC Ultra-High-Performance-Liquid-ChromatographySPE Solid-Phase-Extraction (Fastfasextraktion)
MS Masspektrometri
ESI Electrospray ionization
LOD Limit-Of-Detection (Detektionsgräns)
Innehåll
1. Introduktion... 1 1.1 Bakgrund ... 1 1.2 Explosivämnen ... 2 1.3 Syfte ... 3 1.4 Avgränsningar ... 42. System och process ... 5
2.1 Processbeskrivning ... 5 2.2 Processanalys ... 5 3. Teori ... 6 3.1 Fastfasextraktion ... 6 3.2 Vätskekromatografi ... 6 3.3 Detektion ... 8 3.3.1 Diode-Array-Detection ... 8 3.3.2 Masspektrometri... 9
4. Material och metoder ... 10
4.1 Kemikalier... 10
4.2 Arbetsgång för vätskeprover ... 10
4.3 Instrumentering ... 10
4.4 Statistiska beräkningar ... 11
5. Resultat och diskussion ... 13
5.1 Vätskekromatograf ... 13
5.1.1 Utveckling av kolonn och gradientprogram ... 13
5.1.2 Analys av repeterbarhet ... 16
5.2 Fastfasextraktionsrobot ... 17
5.2.1 Jämförelse mellan olika elueringsmedel ... 17
5.2.2 Jämförelse mellan olika volym elueringsmedel ... 17
5.2.3 Jämförelse mellan olika indunstningssteg ... 18
5.2.4 Analys av noggrannhet ... 20
5.3 Trippel-kvadrupol ... 21
6. Slutsats ... 23
Referenser ... 24
1
1. Introduktion
1.1 Bakgrund
Enligt statistik från Brottsförebyggande rådet ökar antalet sprängningar i Sverige. Under år 2018 var det i Sverige 162 anmälda brott mot Allmänfarlig ödeläggelse (3§) genom sprängning, vilket ökade under 2019 till 257 anmälda brott. Denna ökning resulterar i allvarliga konsekvenser och utgör en stor fara för allmänheten. Dessutom har explosivämnen en toxisk inverkan på djur, natur och människan [21], vilket innebär att de även är en miljö- och hälsofara för omgivningen ifall de dumpas i naturen och inte omhändertas på rätt sätt. För att motarbeta denna oroväckande ökning och stärka tryggheten i samhället har Totalförsvarets Forskningsinstitut (FOI) påbörjat ett nytt forskningsarbete som exempelvis polisiära myndigheter skulle kunna utnyttja resultaten ifrån. Arbetet omfattar spårmängdsanalys i avloppsvatten med syfte att erhålla en indikation om att olaglig tillverkning av sprängämnen sker. Men det finns även potential att använda metoden för andra matriser som exempelvis markprover för att uppmärksamma miljö- och hälsofarliga platser (eller olika vattenprover som kan tänkas vara kontaminerade).
För att analysera explosivämnen har bland annat tunnskiktskromatografi (TLC), kapillärelektrofores (CE), Gaskromatografi (GC) och vätskekromatografi (LC) tillämpats i tidigare studier. För ett antal år sedan implementerades ”Automated multiple development” som är baserad på TLC [17]. Fördelarna med denna metod är att den är relativt snabb då den inte kräver någon särskild provupparbetning samt kan utföra analys av 20 prover samtidigt. Metoden är dock inte lämplig för spårmängdsanalys då låga halter inte kan detekteras. På grund av detta är den mer användbar som en sållningsmetod för matriser med potentiellt hög koncentration, möjligen prover från en avfallsplats. Vid tillämpning av CE har kort separationstid, låg förbrukning av lösningsmedel samt god prestanda erhållits [13]. Även GC har implementerats [2] men eftersom vissa explosivämnen inte är särskilt lättflyktiga samt är relativt termiskt instabila vid höga temperaturer, är separationsmetoden inte lämplig för alla substanser [16]. Olika former av LC har också givit tillfredsställande resultat. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) med UV-detektion [18
]
samt HPLC kopplat till en masspektrometer (HPLC-MS) [8, 14, 20] har tillämpats för vissa typer av explosivämnen. I andra fall har Ultra-High-Performance Liquid Chromatograpy (UHPLC) med masspektroskopidetektion [16] applicerats i syfte att erhålla en kortare analystid, bättre upplösning samt mindre förbrukning av lösningsmedel.En utmaning med spårmängdsanalys i avloppsvatten är den ytterst komplexa matrisen. Vid masspektrometri uppstår oftast ”ion-supression” och ”ion-enhancement”, vilket genererar lägre respektive högre detektorrespons på grund av interferens från andra ämnen i matrisen [14]. För att öka känsligheten, selektiviteten och tillförlitlighet krävs en upparbetningsmetod för att rena upp provet från matrisen. Metoder som har implementerats är ”salting-out-solvent-extraktion” [9], ”solid-phase-extraction” [14], ”solid-phase-micro”salting-out-solvent-extraktion” [12],
2 microextraction” [3]. Generellt är fastfasextraktion (SPE) den mest förekommande metoden, kanske på grund av det enkla handhavandet, koncentreringsmöjligheterna och den låga förbrukningen av lösningsmedel. I en omfattande studie med SPE jämfördes 34 olika kolonner där Oasis HLB med acetonitril som elueringsmedel presterade bäst [14].
Vidare för att säkerställa selektivitet och känslighet vid masspektrometri, genererar en högre masstalsupplösning större sannolikhet att separera interfererande massor från målmassan. Tidigare har Orbitrap tillämpats [14, 20] som tillhör klassen Hög-Upplösande-Masspektrometri (HRMS), vilket genererar en hög masstalsupplösning samt noggrannhet. Ett oftast billigare och väl tillämpat alternativ är kvadrupolbaserade instrument [16] som tillhör klassen Låg-Upplösande-Masspektrometri (LRMS). Som namnet antyder genererar kvadrupol lägre upplösning och noggrannhet än Orbitrap. Till samtliga masspektrometrar krävs en jonkälla för att jonisera substanserna. ”Electrospray ionisation” (ESI) med negativ inställning (NI-ESI) har resulterat i en effektiv jonisering av framförallt nitraminer, då dessa föredrar att bilda negativa jonkomplex [5]. Dock generar NI-ESI en lägre intensitet för nitroaromater då dessa är svårare att jonisera [19]. Utöver ESI har även ”Atmospheric-pressure-chemical-ionization” (APCI) applicerats i tidigare studier [16]. Trots att känsligheten är högre hos ESI för de ämnen som metoden kan jonisera, föredras APCI då en större variation av substanser kan joniseras [8].
1.2 Explosivämnen
Explosivämnenas historia tog framfart efter att svartkrut introducerades till Europa under 1200-talet i framförallt militära sammanhang [1]. Därefter ökade efterfrågan i olika syften och till följd av detta påbörjades utvecklingen av nya explosivämnen. Under 1: a världskriget användes vanligtvis 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) men till 2: a världskriget var istället 1,3,5-trinitroperhydro-1,3,5-triazin (RDX) ett populärt alternativ samt en blandning av [3-nitrooxy-2,2-bis(nitrooxymetyl)propyl]nitrat (PETN) och TNT [21]. Vid analys av RDX är det även relevant att analysera Hexahydro-1,3,5-trinitroso-1,3,5-triazin (R-salt) då detta är en nedbrytningsprodukt av RDX [6]. Strukturformel för respektive substans visas i Figur 1–4.
Figur 1. Strukturformel för 2,4,6-trinitrotoluen (TNT). Figuren framställdes med programmet ChemSpace.
Figur 2. Strukturformel för
1,3,5-trinitroperhydro-1,3,5-triazin (RDX). Figuren framställdes med programmet ChemSpace.
3
Figur 3. Strukturformel för [3-nitrooxy-2,2-bis(nitrooxymetyl)propyl]nitrat (PETN). Figuren framställdes med programmet ChemSpace.
Figur 4. Strukturformel för Hexahydro-1,3,5-trinitroso-1,3,5-triazin (R-salt). Figuren framställdes med programmet ChemSpace.
Idag används TNT regelbundet inom Försvarsmakten som explosivämne tack vare dess stabila och icke-hygroskopiska egenskaper samt för att substansen är okänslig för friktion, stöt och elektrostatisk energi [21]. Ämnet genererar flera skadliga bieffekter hos människan om det inte hanteras på rätt sätt, så som aplastisk anemi (benmärg som producerar blodceller fallerar), leverskador, cyanos (missfärgning i hud), nervskador och hudceliaki [21]. RDX är liksom TNT relativt okänslig för bland annat friktion, har hög kemisk stabilitet (dock lägre än TNT) och ger upphov till större kraft i explosionen jämfört med TNT. Vid felhantering kan olika bieffekter framkallas av RDX, så som konvulsion (krampanfall), medvetslöshet, yrsel, huvudvärk och illamående [21]. PETN används ofta som ett additiv tack vare dess förmåga att med lätthet initiera en explosion. Därav adderas den ofta i detonatorer som primärt sprängämne [21]. Vid felhantering kan olika bieffekter framkallas av PETN (vid en större dos), så som blodtrycksfall, högt venöst- samt spinalttryck [21]. Samtliga explosivämnen kan utgöra en risk för vår miljö då man förr i tiden kasserade restprodukter fritt i havet och vattendrag samt grävde ner avfall i marken [21]. Därav är det ytterst relevant från ett miljö- och hälsoperspektiv att utföra analys av dessa ämnen.
Vid bombattentat används ofta hemmagjorda sprängämnen, så kallade Home-Made-Explosives (HME). Dessa används då startkemikalier kan införskaffas från vanliga konsumentprodukter med tillverkning i ett vanligt kök med enkel utrustning. Ett vanligt förekommande HME är 3,3,6,6,9,9-hexametyl-1,2,4, 5,7,8-hexaoxacyklononan (TATP) troligen på grund av låga tillverkningskostnader samt enkla tillverkningsmetod [10].
1.3 Syfte
Syftet med detta arbete var att utveckla en UHPLC-metod med UV-detektion för spårmängdsanalys av explosivämnen i avloppsvatten. En provupparbetningsmetod baserat på automatisk fastfasextraktion skulle även utvecklas. Vidare skulle masspektrometri i form av trippel-kvadrupol testas.
4
1.4 Avgränsningar
Optimering av UHPLC-instrumentet utförs inte i detta arbete, utan en validerad metod från tidigare studier kommer att appliceras och vid behov modifieras. Fokus kommer främst riktas mot fastfasextraktionsroboten då detta instrument inte har tillämpats med explosivämnen i tidigare studier. Eftersom instrumentet var oanvänt innan detta arbete, utfördes inga tester med riktigt avloppsvatten i farhågan att det sannolikt kunde orsaka blockeringar i instrumentet. Därför analyserades endast provmatrisen Milli-Q vatten (väl destillerat vatten).
Under en inledande fas i arbetet analyserades Hexahydro-1,3,5-trinitroso-1,3,5-triazin (R-salt), 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) och 3,3,6,6,9,9-hexametyl-1,2,4, 5,7,8-hexaoxacyklononan (TATP). Dock visade det sig att TATP var svåranalyserat med UV-detektion då dess absorbans inom instrumentets våglängdsområde (190-800nm) var för låg. Vid masspektrometri joniseras TATP effektivast vid positiv ESI, medan de andra substanserna joniseras effektivast vid negativ ESI. Detta innebär att båda joniseringsinställningarna skulle krävts men då hade det tagit för lång tid att utföra analyserna. På grund av dessa anledningar utgick TATP och ersattes med PETN, till följd av detta finns inget resultat för PETN i de inledande försöken.
5
2. System och process
2.1 Processbeskrivning
Projektet inleddes med en för-fas som innefattade projektplanering, upprättande av milstolpar (Tabell 1), litteratursökning samt introduktion till arbetsplatsen och instrumenten vid FOI. Efter godkänd projektplanering påbörjades det laborativa arbetet med diverse aktiviteter som presenteras i ett GANTT-schema (Bilaga 1). Därefter påbörjades skrivprocessen, följt av förberedelse för framläggning samt opponering (dock för att erhålla tillstånd att genomföra framläggningen krävs att man närvarat på två auskultationer). Sist färdigställdes rapporten och publicerades i DiVA, följt av upprättelse av en efterstudie som lämnades in till examinatorn.
Tabell 1. Milstolpar för projektet presenteras nedan med respektive beskrivning samt sista leveransdag.
Milstolpe Beskrivning Sista leveransdag
1 Skicka in projektplanering och beskrivning till examinator 2020-04-03 2 Skicka in utkast av rapport till examinator 2020-05-19
3 Skicka in rapport till opponent 2020-05-26
4 Genomföra framläggning och opponering 2020-06-03
5 Skicka färdigställd rapport samt reflektionsdokument till examinator 2020-06-13
6 Publicera rapporten i DiVA 2020-06-13
2.2 Processanalys
På grund av den rådande covid-19 situationen som förelåg under arbetets gång blev det tänkta Orbitrap-instrumentet inte färdigställt, varav planeringen var tvungen att justeras. Istället för Orbitrap användes en trippel-kvadrupol. Initialt fungerade inte detta LC-instrument då flera parametrar var ur funktion, bland annat läckte det från kopplingen mellan LC och MS delen. Dessa parametrar var tidskrävande att åtgärda, därav undersöktes även möjligheten att utföra GC-MS. Även där var det flera parametrar som inte stämde, exempelvis gick nålen för injicering av ett flertal gånger. Dock efter tidskrävande insatser kunde problemen med LC-systemet lösas och analys genomfördes med det instrumentet. Vidare utfördes justeringar i planeringen gällande TATP då detta var svårt att detektera, varav TATP byttes ut mot PETN. I övrigt kunde planeringen följas någorlunda väl och alla laborativa aktiviteter i GANTT-schemat (Bilaga 1) slutfördes.
6
3. Teori
3.1 Fastfasextraktion
Fastfasextraktion är en upparbetningsmetod som grundar sig på att fånga den önskade substansen med en stationärfas och därefter eluera ut den med ett lämpligt lösningsmedel [7]. Ett vanligt standardutförande är att konditionera kolonnen, applicera provet, tvätta kolonnen och sist eluera analyt. Det finns två huvudtyper av absorbenter; en opolär stationärfas Reversed-phase kolonn, samt en polär stationärfas Normal-Reversed-phase kolonn [7]. Till en opolär kolonn absorberas opolära substanser, vilket normalt explosivämnen är. Denna kolonn konditioneras vanligen med metanol för att penetrera ytan, följt av vatten för att effektivt väta stationärfasen. När provet har applicerats avlägsnas oönskade substanser med ett polärt lösningsmedel, vilket avlägsnar polära föreningar. Sist elueras den önskade analyten med ett mindre polärt lösningsmedel som exempelvis metanol, acetonitril eller etylacetat. Beroende på elueringsvolym och provvolym kan substansen koncentreras och låter man även provet indunstas koncentreras substansen ytterligare [7].
3.2 Vätskekromatografi
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) är en analysmetod som separerar kemiska substanser baserat på deras fördelning mellan en stationärfas och en mobilfas. Pumpar driver mobilfasen genom en kolonn som är packad med partiklar bestående av stationärfas. Separationen baseras på att interaktionen mellan stationärfas och analyt är unik för varje substans. Olika separationer erhålles när instrumentella parametrar som pH, mobilfassammansättning, flödeshastighet samt val av stationärfas varieras. När separationen är slutförd påbörjas detektion.
Som tidigare nämnts finns det två typer av kromatografi, vilka är Reversed-phase och Normal-phase, där Reversed-phase är vanligast [7]. I Reversed-phase är stationärfasen opolär och mobilfasens elueringsstyrka (förmåga att eluera analyt) ökar därför när mobilfasen blir mer opolär. Mobilfasen består oftast av en blandning mellan metanol, acetonitril eller vattenbuffert men kan i vissa fall bestå av en av de tre alternativen [7]. Mobilfasens sammansättning påverkar både retentionsfaktorn k (Ekvation 1) och separationsfaktorn α (Ekvation 2) [7]. Retentionsfaktorn beskriver kvoten mellan tiden som analyten har spenderat i stationärfasen och tiden som den har spenderat i mobilfasen. I Ekvation 1 är tr retentionstiden för analyten
och tm är retentionstiden för mobilfasen (vilket erhålles med en substans som inte integrerar
med stationärfas). Separationsfaktorn beskriver istället hur väl två toppar är separerade och är oberoende av flödeshastighet. I Ekvation 2 är k2 retentionsfaktorn för substansen med högst
värde och k1 är retentionsfaktorn för substansen med lägst värde.
Retentionsfaktor: 𝑘 = (Ekvation 1) Separationsfaktor: 𝛼 = (Ekvation 2)
7 Den vanligaste byggstenen för stationärfasen är kiseldioxid (silika) [7]. Till dessa partiklar sammanförs olika stationärfaser via kovalentbindning, och beroende på vilken typ av stationärfas som binds in erhålls olika egenskaper. Detta påverkar både retentionsfaktorn och separationsfaktorn om retentionsfaktorerna för substanserna ändras i olika omfattning. Dock kommer inte alla silanolgrupper att binda till stationärfas, vilket orsakar ett svansande utseende av topparna i kromatogrammet [7]. Dessa svansade toppar uppstår på grund av en sekundär interaktion mellan analyten och fria silanolgrupper. Detta kan minimeras genom inaktivering av de fria silanolgrupperna genom så kallad endcapping. Dessutom kan det svansande utseendet även minskas genom att använda en mobilfas med lågt pH eftersom då är silanolgrupperna neutrala, vilket minskar den sekundära interaktionen. Vid pH-värden under pH 2 kommer dock siloxanbindningar att hydrolysernas [7]. Därför går det inte att analysera med allt för låga pH värden. Det går inte heller att analysera med för höga pH värden eftersom då börjar kiseldioxidpartiklarna att lösas upp [7]. Det är dock möjligt att använda olika stationärfaser som skyddar bindningar vid höga respektive låga pH.
Kiseldioxidpartikeln besitter flera fysikaliska egenskaper som påverkar diverse parametrar. Exempelvis frambringar den sfäriska formen ett lägre mottryck, vilket genererar ett lägre kolonntryck [7]. En annan viktig egenskap är porstoleken. En silikapartikel med mindre porer har en större partikelyta, vilket medför att analyten exponeras för mer stationärfas varvid retentionen ökar [7]. Vidare är partikelstorleken av stor betydelse då den påverkar bottentalet N (Ekvation 3), där N står för teoretiskt antal bottnar, L för längden av kolonnen och H bottenhöjd. I UHPLC är storleken på partiklarna 2 µm eller mindre, jämfört med HPLC som är över 2 µm [7]. En minskad partikelstorlek medför att bottenhöjden H minskar och därmed att bottentalet N ökar (Ekvation 3). Dessutom ökar bottentalet N med kolonnens längd (Ekvation 3). Vidare visar Van Deemter-ekvationen hur bottenhöjden H beror av mobilfasens linjära flödeshastighet (Ekvation 4). I Ekvation 4 står H för bottenhöjd, A för Eddy-diffusions konstanten, B för longitudinell diffusions konstant, C för masstransfer konstant och sist står ux
för linjärt flöde av mobilfasen.
Bottental: 𝑁 = (Ekvation 3) Van Deemter ekvationen: 𝐻 = 𝐴 + + 𝐶𝑢 (Ekvation 4)
Konstanten A i van Deemter-ekvationen innebär multipla flödesvägar. En mindre partikelstorlek reducerar Eddy diffusionen till följd av att distinktionen mellan lägsta och kortaste väg genom kolonnen minskar [7]. Även en jämn distribution av partiklar samt en väl packad kolonn reducerar Eddy diffusionen. Konstanten C står för ”masstransfer” vilket beskriver jämnvikten mellan mobilfas och stationärfas. En liten partikelstorlek medför att (i) diffusionsavstånden mellan stationärfas och mobilfas, samt (ii) diffusionsavstånden i stillastående mobilfas i partiklarna minskar. Detta medför att jämnvikten ställer in sig snabbare, vilket reducerar konstanten C [7]. Vidare står konstanten B för longitudinell diffusion av analytbandet. Om flödeshastigheten minskas, minskas termen Cux men istället ökar termen
B/ux (Ekvation 4). Enligt van Deemter-kurvan kan högre linjära flödeshastigheter användas
utan att försämra bottentalet när en mindre partikelstorlek används [7]. En ökad flödeshastighet är önskvärd eftersom analystiden blir kortare.
8 Ytterligare en parameter som är viktigt att ta hänsyn till är temperaturen i kolonnugnen. Beroende på ugnens temperatur påverkas retentionsfaktorn och även separationsfaktorn om substansernas retentionsfaktorer påverkas i olika omfattning. En ökad temperatur kan medföra att en större andel av analyten migrerar till mobilfasen, vilket minskar retentionsfaktorn som i sin tur genererar en kortare retentionstid [7].
Samtliga nämnda parametrar har en gemensam påverkan på upplösningen (Ekvation 5) vilket är ett mått på hur väl två toppar är separerade [7]. I ekvationen står N för bottentalet, k2 för retentionsfaktorn och α för separationsfaktorn. För att erhålla en tillfredsställande upplösning kan därmed bottentalet, retentionsfaktorn eller separationsfaktorn angripas.
Effekt på upplösning: 𝑅 =√ × × (Ekvation 5)
3.3 Detektion
3.3.1 Diode-Array-Detection
Diode-Array-Detection (DAD) är en spektrofotometrisk metod som grundar sig på absorption av fotoner [7]. Absorptionen sker i molekylens kromoforer där molekylen övergår från grundtillstånd till ett energirikare läge, ett så kallat exciterat tillstånd. En kort stund senare återgår molekylen till det lägre energitillståndet (grundläget) genom att emittera den tillförda energin. När absorptionen mäts i ett prov är den inkommande energin av ljuset högre än den utgående energin, med andra ord sker en minskning av ljusintensitet. Transmittans, T, beskriver minskningen av ljusintensiteten när en ljusstråle passerar ett prov (Ekvation 6). I ekvationen är P0 intensiteten av ljusstrålen före passering av prov, medan P avser intensiteten efter passering
av prov [7].
Transmittans: 𝑇 = (Ekvation 6)
Utifrån transmittansen definieras absorptionen i ett logaritmiskt samband enligt Ekvation 7 [7]. Absorption är enhetslöst men kan ofta beskrivas som ”absorbans enhet”.
Absorption: 𝐴 = log( ) = − log 𝑇 (Ekvation 7)
Vidare beskriver Beer-Lambert lag att absorption är proportionell mot koncentrationen i provet (Ekvation 8) [7]. Lagen omfattar den molära absorptionen ε som beskriver hur mycket ljus som absorberas vid en viss våglängd av en viss substans, termen b beskriver längden som ljusstrålen passerar i provet och termen c står för koncentrationen i provet. Med hjälp av Beers lag är det därför möjligt att mäta koncentrationen i ett okänt prov. Detta görs genom att analysera en serie med kända koncentrationer för att sedan upprätta en kalibreringskurva. Utifrån denna kalibreringskurva kan sedan okända provers koncentration mätas.
9 Beroende på vilken spektrofotometer som används kan antingen endast en inställd våglängd mätas eller ett helt våglängdsintervall (DAD tillhör den sistnämnda varianten). En DAD kopplat till ett LC-instrument består av en ljuskälla som kan bytas beroende på vilket våglängdsområde man vill mäta. Oftast används en deuteriumlampa för mätning av UV/VIS-området [7]. Det inkommande ljuset från lampan bestrålas genom en flödescell innehållande mobilflöde från LC-kolonnen. Det utgående ljuset träffar därefter en polykromator som delar upp ljuset i respektive väglängd för att sedan nå olika fotodioder. Därmed kan alla våglängder i ett område mätas samtidigt.
3.3.2 Masspektrometri
Masspektrometri baseras på detektion av olika masstal, antingen av en hel atom eller molekyl eller fragment av dessa. En masspektrometer består av en jonkälla, en massanalysator och en detektor. De två vanligaste joniseringsteknikerna för LC-MS är ”Electrospray ionization” (ESI) och ”Atmospheric pressure chemical ionization” (APCI) [7]. Till ESI leds mobilflödet från kolonnen in i en nebulizer. Vid utloppet av nebulizern föreligger hög spänning, varvid en aerosol med laddade partiklar bildas. För att effektivisera joniseringen tillsätts oftast ett additiv i mobilfasen som bildar ett komplex mellan modermolekylen och jon från additivet (en addukt). Vidare grundar sig APCI istället på att en metallnål med hög spänning riktas mot aerosolen. Runt nålen formas en elektrisk korona (en plasma med laddade partiklar) varvid jonisering sker när elektroner injiceras till aerosolen som bildats runt nålen. Båda joniseringsteknikerna är en så kallad mjukjonisation eftersom fragmentjoner sällan bildas.
När joniseringen är utförd sker separation med en massanalysator. Ett vanligt alternativ är kvadrupolbaserad teknik som består av fyra parallella metallstavar över vilka en likspänning och en radiofrekvent växelspänning läggs [7]. Genom att ändra spänningen över metallstavarna kan olika masstal tillåtas att passera och därefter nå detektorn, vilken vanligtvis utgörs av en elektronmultiplikator. Det finns två generella tillvägagångssätt att mäta masstal, vilka är via SCAN eller Selected ion monitoring (SIM) [7]. I ett SCAN mäts alla masstal i ett givet intervall från lägsta till högsta masstalet. Tiden man ägnar åt varje masstal i ett SCAN påverkar utfallet då en starkare intensitet på signalen erhålls när respektive masstal mäts under en lägre tid. Men när man mäter masstalen under en lägre tid tar varje SCAN längre tid, vilket ger färre mätpunkter i kromatogrammet. Detta kan leda till dålig beskrivning av kromatografin eftersom minst åtta mätpunkter i toppen krävs för att möjliggöra korrekt kvantifiering. Ett snabbare SCAN ger motsatt effekt; en lägre intensitet av signal då varje masstal mäts under en kortare tid, men ger flera mätpunkter i kromatografin då fler SCAN hinner att utföras. I ett SIM mäts istället en eller några få utvalda masstal, vilket ökar intensiteten för signalen jämfört med SCAN. Därav kan detektionsgränsen minskas vid tillämpning av SIM, dock ges bland annat inget masspektrum som man erhåller med SCAN.
10
4. Material och metoder
4.1 Kemikalier
Respektive explosivämnen framställdes av en synteskemist på FOI i Grindsjön. Utifrån dessa bereddes stamlösningar (100 ml) av R-salt 987 mg/l, TNT 973 mg/l, PETN 1049 mg/l samt RDX 1003 mg/l. Stamlösningarna späddes med acetonitril från företaget Fisher Chemical (Belgien). För UV-DAD bereddes en mixad arbetslösning genom att späda respektive stamlösning med en faktor 10 till en och samma lösning, vilken användes för att bereda sex kalibreringslösningar (se Bilaga 2 för spädningsschema). För MS bereddes två olika arbetslösningar; till den ena späddes respektive stamlösning med en faktor 10 och till den andra med en faktor 2000, vilka användes för att bereda sex kalibreringslösningar (se Bilaga 3 för spädningsschema). Samtliga arbetslösningar späddes med samma acetonitril som stamlösningarna. RDX användes som intern standard.
För SPE-roboten användes metanol från företaget Fischer Chemical (Belgien) samt etylacetat och acetonitril från företaget Merck (Tyskland). För UHPLC användes metanol från Merck (Tyskland).
4.2 Arbetsgång för vätskeprover
För validering och utveckling av analysmetoderna spikades Milli-Q vatten med olika volym arbetslösningar inom intervallet 0,21–0,017 mg/l. Tillsatts av intern standard RDX genomfördes efter att provet genomgått fastfasextraktion med en koncentration som motsvarade mitten av det tillhörande kalibreringsintervallet.
4.3 Instrumentering
Vätskekromatografi utfördes med Thermo Scientific™ Vanquish Duo UHPLC Systems (USA). Två kolonner med olika stationärfaser jämfördes med olika gradientprogram. Först testades Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish aQ1 kolonn (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm
partikelstorlek). Tre olika gradientprogram (Bilaga 4) tillämpades. Vidare utfördes analys med
kolonnen Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish PFP 2 (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm
partikelstorlek) som med följande gradientprogram blev den utvecklade UHPLC-metoden. Mobilfas bestod av A; 100 % Milli-Q vatten, samt B; 100 % metanol. Inledningsvis bestod mobilfasen av 25 % B vilket ökades linjärt till 30% B under 1 min. Gradient B stegrades sedan linjärt till 55 % under 9 min. Från 55 % ökades B till 80 % under 2 min, sedan till 95 % under 1,1 min. Denna sammansättning av mobilfas bevarades i 2,9 min där sedan gradient B sjönk till 25 % under 0,5 min. Sist bevarades denna mobilfassammansättning i 1,5 min, vilket gav en total analystid 18 min. Flödeshastigheten var 0,5 ml/min, temperaturen på kolonnugnen var 35°C och temperaturen i provtagningskammaren var 20 °C. Våglängder för UV detektion var 250 nm (R-salt, RDX, TNT) och 210 nm (PETN) men även 3D-field (som mäter hela intervallet 190–800 nm) var påslaget för de flesta analyserna.
1 Reversed phase- C18 (octadecyl) 2 Reversed phase- Pentafluorophenyl
11 Provupparbetning genomfördes med Freestyle Xana (LCTech, Tyskland) som var utrustad med SPE-kolonnen Oasis HLB ”barrel” med dimensionerna 6 ml × 200 mg (Waters Corporation, USA). Kolonnen konditionerades med 5 ml metanol, tvättades med 10 ml Milli-Q vatten, laddades med 100 ml prov, tvättades med 5 ml Milli-Milli-Q vatten, torkades i 15 min med kvävgas samt eluerades med 3 ml acetonitril. Extraktet överfördes till 4 ml vial från företaget Scantec Nordic (Sverige), för att sedan överföras till LC vialer erhållet från VWR International (Belgien). Indunstning genomfördes med Freestyle EVAporation (LCTech, Tyskland). Temperaturen i indunstningskammaren var 50 °C.
För masspektroskopi användes ett Acquity UPLC System (vätskekromatograf) kopplat till en Xevo TQ-S (trippel-kvadrupol) med negativ ESI från företaget Waters (USA). Till vätskekromatografen användes samma kolonn och gradient som den utvecklade metoden beskrivet tidigare. Skillnaden var att flödeshastigheten istället var 0,45 ml/min, temperaturen på kolonnugnen var 50°C och mobilfas bestod av A; Milli-Q vatten med 0,1 promille dibrommetan, samt B; 100% metanol. Detektion utfördes med SIM. För R-salt mättes 253 m/z, för RDX 300,95 m/z, för TNT 226 m/z och sist för PETN 394,93 m/z.
4.4 Statistiska beräkningar
Analys av linjärt samband utfördes genom att upprätta en kalibreringskurva från ett antal kalibreringslösningar med olika koncentrationer. Vid analys av metodens prestanda upprättades sex kalibreringslösningar (Bilaga 2 och 3). De kända koncentrationerna av kalibreringslösningarna lades in på x-axeln och på y-axeln lades kvoten mellan topparea för substans delat med topparea för intern standard (RDX). Förhoppningen var att upprätta en linjärregressionslinje med korrelationskoefficient R2 nära 1 [11]. Vidare användes det linjära
sambandet för att beräkna den okända koncentrationen i proverna som upparbetades med fastfasextraktionsroboten. Dessutom beräknades detektionsgränsen (Limit of detection, LOD), med sex kalibreringslösningar för UV-DAD och fyra för MS-detektion (Ekvation 6 [11]). Standardavvikelsen baserades på fyra replikat av den lägsta koncentrationen av kalibreringslösningarna. Lutningen bestämdes från linjens ekvation som erhölls vid kalibreringen. För att till sist erhålla koncentrationen sattes det beräknade värdet från Ekvation 6 in i linjens ekvation.
𝐿𝑂𝐷 = ∗ (Ekvation 6)
Repeterbarheten för LC-UV-instrumentet skattades genom att analysera sex replikat av fyra olika kalibreringslösningar i intervallet 30–152 ug/ml. Utifrån de sex replikaten av respektive lösning beräknades medelkoncentrationen vilken erhölls från linjens ekvation, samt standardavvikelsen av koncentrationerna mellan replikaten. Utifrån dessa värden erhölls variationskoefficienten, CV%, genom att dela standardavvikelsen med medelvärdet (samt gånger 100 för att få procent). Dessutom utfördes även en kontroll av att topphöjd, topparea samt retentionstid var reproducerbar för de sex replikaten inom varje koncentrationsnivå.
12 Vidare beräknades noggrannheten för fastfasextraktionsroboten, bestående av parametrarna riktighet och precision. Noggrannheten beskriver hur väl instrumentet kan ge det sanna värdet. Detta beräknades genom att spika in Milli-Q-vatten på fyra koncentrationsnivåer för att sedan analysera sex replikat av varje nivå. Precisionen, eller spridningen, redovisades som CV% inom varje koncentrationsnivå och beräknades enligt tidigare beskrivning. Riktigheten bestämdes genom att beräkna utbytet av respektive replikat för att sedan uppskatta ett medelvärde mellan replikaten inom varje koncentrationsnivå. Utbytet beräknades genom att dividera den erhållna koncentrationen (det observerade värdet) för ett spikat vattenprov som genomgått extraktion, med en kalibreringslösning som ej genomgått extraktion (det teoretiska värdet som motsvarar 100% utbyte).
13
5. Resultat och diskussion
5.1 Vätskekromatograf
5.1.1 Utveckling av kolonn och gradientprogram
Separationen som erhölls med två olika kolonner med olika stationärfaser jämfördes. Den första kolonnen som testades var Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish aQ (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm partikelstorlek). Tre olika gradientprogram (Bilaga 4) tillämpades för denna kolonn för att erhålla en bra upplösning mellan topparna i kromatogrammet. För version 1 urskiljs erhållet kromatogram i Figur 5. Då man visuellt kan se att R-salt eluerar tätt inpå lösningsmedlet samt att RDX eluerar tätt inpå R-salt, gjordes justeringar i gradienten för att förhoppningsvis öka separationen mellan dessa. Erhållet kromatogram för version 2 åskådliggörs i Figur 6. Men av okänd anledning erhölls istället delade toppar, vilket inte är önskvärt. Målet var att få så smala toppar som möjligt för att bland annat erhålla en bättre upplösning. Ytterligare en gradient testades (version 3) med syfte att förbättra upplösningen och att få bort de delade topparna. Erhållet kromatogram urskiljs i Figur 7. För samtliga kromatogram redovisas inte PETN då denna mättes på våglängden 210 nm medan R-salt, RDX och TNT mättes på 250 nm.
Figur 5. Analys med Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish aQ kolonn (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm partikelstorlek), version 1 av gradientprogrammet.
14
Figur 6. Analys med Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish aQ kolonn (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm partikelstorlek), version 2 av gradientprogrammet.
Figur 7. Analys med Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish aQ kolonn (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm partikelstorlek), version 3 av gradientprogrammet.
15 Vidare utfördes analys med kolonnen Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish PFP (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm partikelstorlek) med tillhörande gradient beskrivet under rubriken ”4.3 Instrumentering”. Denna gradient utvecklades i en tidigare studie [16] och tillämpades i denna studie med några mindre justeringar. Erhållet kromatogram åskådliggörs i Figur 8.
Figur 8. Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish PFP (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm partikelstorlek) med mobilfassammansättning samt gradient beskrivet under rubriken ”4.4 Instrumentering”.
Efter jämförelse mellan Vanquish aQ och PFP kolonnen, valdes den sist nämnda kolonnen eftersom den gav tillfredsställande separation av substanserna och en kort analystid. För version 1 av gradienten för aQ kolonnen genererades visserligen en kortare analystid, men man kunde se en visuellt sämre separation mellan topparna än för version 3. En jämförbar separation erhölls mellan version 3 av aQ kolonnen och PFP kolonnen, men den först nämnda genererade en längre analystid. Därav valdes PFP kolonnen på grund av den goda separationsförmågan samt korta analystid för den utvecklade metoden. Eftersom studien var avgränsad till att endast applicera tidigare validerade metoder för UHPLC-instrumentet, genomfördes ingen metodoptimering. I framtida projekt vore det därför möjligt att optimera upplösningen för LC-metoden på ett mer genomgående sätt, genom att bland annat undersöka olika mobilfaser, gradientprogram, kolonntemperaturer och stationärfaser.
16
5.1.2 Analys av repeterbarhet
När metoden för LC-instrumentet var fastställd undersöktes repeterbarheten. Resultatet redovisas i Tabell 2 (se Bilaga 5 för de beräknade medelvärdena och standardavvikelserna). Då PETN ännu inte var adderad till studien erhålls inget resultat för PETN. Men för R-salt och TNT påvisades en god repeterbarhet då CV% för sex replikat var 0,055% eller bättre.
Tabell 2. Repeterbarhet för den erhållna koncentrationen för substanserna R-salt och TNT (CV% för fyra olika koncentrationer, n=6) med den utvecklade LC-metoden.
R-salt (CV%) TNT (CV%) Inom kalibreringslösning 1 0,053 0,014 Inom kalibreringslösning 2 0,022 0,041 Inom kalibreringslösning 3 0,022 0,055 Inom kalibreringslösning 4 0,041 0,035
5.1.3 Detektionsgräns med UV-DAD
Experiment utfördes för att bestämma LOD för respektive ämne med UV-DAD som detektor. Eftersom syftet med studien var att utföra spårmängdsanalys är det högst relevant att undersöka hur små halter som kan detekteras. Utförandet beskrivs under ”4.4 Statistiska beräkningar”. Erhållet resultat redovisas i Tabell 3 (se Bilaga 6 för respektive standardavvikelse och lutning).
Tabell 3. Detektionsgräns för respektive ämne med UV-DAD. Resultatet är baserat på sex kalibreringslösningar (n=4).
LOD (µg/ml)
R-salt 0,17
TNT 0,16
17
5.2 Fastfasextraktionsrobot
5.2.1 Jämförelse mellan olika elueringsmedel
Etylacetat, metanol och acetonitril jämfördes för att identifiera vilket lösningsmedel som gav det bästa utbytet vid fastfasextraktionen. Målsättningen var att erhålla utbyten nära 100%. Försöken gjordes med den utvecklade metoden för LC-UV samt med SPE kolonnen 6 ml × 200 mg Oasis HLB ”barrel”. För etylacetat gavs inget resultat, vilket betyder att denna har en för svag elueringsstyrka (förmåga att eluera ut analyt). Därför presenteras endast resultat för acetonitril och metanol, se Tabell 4 (se Bilaga 7 för koncentration av kalibreringslösningarna samt de beräknade medelvärdena och standardavvikelserna). Utifrån tabellen genererar acetonitril ett betydligt högre utbyte än metanol, varför denna betraktades som det mest fördelaktiga elueringsmedlet. För att erhålla bättre statistiskdata bör fler prover ha analyserats, men då slutsatsen även överenskommer med tidigare studier [14] valdes detta lösningsmedel för den utvecklade metoden.
Tabell 4. Två spikade Milli-Q-vattenprover med samma koncentration upparbetades med en fastfasextraktionsrobot med 6 ml × 200 mg Oasis HLB ”barrel” kolonn. Jämförelse utfördes mellan olika elueringsmedel för att erhålla det mest gynnsamma elueringsmedlet som genererar ett utbyte nära 100% (n=2) för TNT och R-salt.
Utbyte acetonitril (%) Utbyte metanol (%)
TNT 78,1 ± 5,7 32,3 ± 16, 7
R-salt 79 ± 5,9 27,3 ± 22, 2
5.2.2 Jämförelse mellan olika volym elueringsmedel
Olika volym elueringsmedel jämfördes i syfte att optimera extraktionsutbytet i detta avseende. Försöken gjordes med den utvecklade metoden för LC-UV samt med SPE kolonnen 6 ml × 200 mg Oasis HLB ”barrel”. En större elueringsvolym bör teoretiskt kunna eluera ut mer substans, vilket skulle medföra i ett ökat utbyte. Dock genererar en större volym mindre koncentrering av analyt, vilket i sin tur kan generera en högre detektionsgräns. Således kan en mindre elueringsvolym frambringa en lägre detektionsgräns då det koncentrerar provet, vilket är fördelaktigt i detta arbete då syftet är att utföra spårmängdsanalys. Ytterligare fördelar med att förbruka mindre elueringsvolym är det blir ekonomiskt gynnsammare att använda mindre lösningsmedel, samt att det genererar mindre miljöfarligt avfall. Jämförelse mellan utbyten för 2,5 ml, 3 ml och 3,5 ml elueringsvolym åskådliggörs i figur 9 (se Bilaga 8 för kompletterande data av respektive utbyten).
18
Figur 9. Jämförelse mellan olika elueringsvolymer för fastfasextraktionen med kolonnen 6 ml × 200 mg Oasis HLB ”barrel”. Resultatet åskådliggör det procentuella utbytet för respektive elueringsvolym.
I figur 9 noteras ett bättre utbyte för 3 ml jämfört med 2,5 ml, vilket är högst rimligt. Det är dock mindre begripligt att utbytet försämras vid 3,5 ml eftersom det teoretiskt bör eluera ut mer analyt när elueringsmedlets volym ökas. Detta kan möjligen förklaras av att LOD ökades på grund av minskad koncentrering av analyt när en större elueringsvolym applicerades, ifall all analyt eluerades runt 3 ml. Trots detta resonemang inträffade det med större sannolikhet något fel vid analyserna med elueringsvolymen 3,5 ml; antingen ett mänskligt fel (felaktig provberedning) eller ett instrumentellt fel. Ytterligare tester bör genomföras för att säkerställa var felet låg, men eftersom 3 ml frambringade ett tillfredsställande utbyte mellan 90–95 %, valdes denna volym för den utvecklade metoden.
5.2.3 Jämförelse mellan olika indunstningssteg
Ett sätt att generera en lägre detektionsgräns (LOD) är via koncentrering av provet, bland annat genom indunstning av lösningsmedlet. För att detta ska fungera bör substanserna ha en hög kokpunkt så att de inte evaporerar vid indunstningen. R-salt, TNT och PETN har alla en kokpunkt över 200 °C [4], därav användes 50 °C i indunstningskammaren för att säkerställa att substanserna inte skulle evaporera. Indunstningsexperimenten gjordes med den utvecklade metoden för LC-UV samt med SPE kolonnen 6 ml × 200 mg Oasis HLB ”barrel”. Resultatet visas i Figur 10 (se Bilaga 9 för kompletterande data av respektive utbyten), där procentuella utbyten för R-salt, TNT och PETN för tre olika koncentreringsförsöken presenteras. I de olika testerna undersöktes olika elueringsvolymer, indunstningsvolymer samt val av kväve eller vakuum som indunstningsmetod.
70 75 80 85 90 95 100 R-salt TNT PETN
Utbyte (%) med olika elueringsvolymer
19
Figur 10. Jämförelse av olika elueringsvolymer, indunstningsvolymer samt val av kväve eller vakuum som indunstningsmetod för fastfasextraktionsroboten. Försöken utfördes med kolonnen 6 ml × 200 mg Oasis HLB ”barrel”.
Baserat på tidigare studier [14] utfördes ett inledande försök med 2,5 ml elueringsvolym för att sedan indunsta till 0,2 ml med kväveinblåsning (därav finns inget resultat för PETN då denna ännu inte hade tillförts till studien). Metoden resulterade i ett jämt och högt utbyte jämfört med de andra metoderna (dock endast med avseende på R-salt och TNT; jämför Figur 10). Indunstning under lätt vakuum genererade en större spridning på utbytet för de olika substanserna jämfört med de två kväveblåsbaserade försöken (Figur 10). Ytterligare analys bör genomföras för att erhålla kunskap om spridningen beror på vakuumindunstning som metod eller om det beror på den högre slutgiltiga indunstningsvolymen (0,4 ml istället för 0,2 ml). Teoretiskt borde utbytet inte bli sämre med indunstning av lösningsmedlet jämfört med utan indunstning. Detta eftersom substansernas kokpunkt är över fyra gånger högre än temperaturen i indunstningskammaren samt är relativt oflyktiga då de har låga ångtryck [4]. Det betyder att substanserna bör kvarstå i indunstningskammaren medan lösningsmedlet avdunstar. Trots att 2,5 ml eluering till 0,2 ml med kväveblåsning genererade ett utbyte runt 80 %, erhölls ett mer fördelaktigt utbyte utan indunstning (90–95%). Därför valdes indunstningssteget att bortses i detta arbete för den utvecklade metoden. Koncentrering visade sig vara för tungt och komplext i denna studie att utveckla, men området bör undersökas vidare i ett senare projekt för att förhoppningsvis erhålla en lägre detektionsgräns. I framtida experiment bör man undersöka varför låga utbyten erhölls i dessa experiment. Eventuellt kan det berott på att substanserna skvätte upp på väggarna i indunstningskammaren och därav erhölls en lägre koncentration i vätskan som överfördes till vialen. Vidare bör man undersöka närmare om kväve eller vakuum genererar högst utbyte, men då bör elueringsvolymen vara samma i dessa experiment för att erhålla ett jämförbart resultat. Vidare bör man även optimera indunstningsvolymen för att hitta den slutvolym som generar högst utbyte.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 R-salt TNT PETN
Utbyte (%) med olika indunstningssteg
20
5.2.4 Analys av noggrannhet
När metoden för fastfasextraktionsroboten var fastställd, utfördes ett omfattande försök för att utvärdera metodens riktighet och precision. Försöken gjordes med den utvecklade LC-UV metoden samt med kolonnen 6 ml × 200 mg Oasis HLB ”barrel”. Resultatet redovisas i Tabell 5 (se Bilaga 10 för de beräknade medelvärdena och standardavvikelserna samt respektive utbyten). Från tabellen erhålls en tillfredsställande riktighet nära 100% för samtliga koncentrationsnivåer och medelvärdena mellan nivåerna, vilket var önskvärt. Vidare bör CV% vara så lågt som möjligt eftersom detta betyder att metodens precision är bra. Värden under 20 % anses dock vara acceptabla i detta fall [11]. Därav är samtliga medelvärdena av CV% som understiger 5,92 % ett bra mått på en god precision. Då metoden frambringade både i en god riktighet och precision, erhålles även en god noggrannhet vilket är önskvärt för att tilldelas en repetitiv och selektiv upparbetning.
Tabell 5. När metoden för fastfasextraktionsroboten var fastställd, utfördes ett omfattande försök för att erhålla metodens riktighet och precision. Till testet spikades Milli-Q vatten på fyra koncentrationsnivåer för att sedan genomföra sex replikat (n=6) av varje nivå. Riktigheten presenteras som ett medelvärde av procentuellt utbyte och precision redovisas som CV%.
R-salt TNT PETN Riktighet (%) Precision (CV%) Riktighet (%) Precision (CV%) Riktighet (%) Precision (CV%) Nivå 1 95,39 3,39 92,29 4,77 94,53 3,84 Nivå 2 94,45 9,22 88,14 10,15 93,12 9,01 Nivå 3 96,11 3,54 85,18 4,52 95,86 5,04 Nivå 4 106,28 1,49 92,28 4,26 108,03 1,28 Medel mellan 98,06 4,41 89,47 5,92 97,88 4,79
I tidigare studier har man genomfört SPE manuellt [14]. Jämförs resultatet mellan den tidigare studien för manuell upparbetning och aktuellt arbete baserat på automatisk upparbetning, ser man en tydlig förbättring av noggrannheten med den sist nämnda metoden (Tabell 6). I Tabell 6 urskiljs en jämnare riktighet för samtliga substanser samt en betydligt lägre spridning med den automatiska metoden, vilket genererar en bättre noggrannhet. Detta innebär även att en bättre repeterbarhet erhålles med SPE-roboten eftersom spridningen är lägre.
21
Tabell 6. Jämförelse mellan resultatet från en tidigare studie med manuell SPE [14] och resultatet från denna studie med automatisk SPE. Resultatet består av riktighet och precision som tillsammans beskriver noggrannheten. Riktighet (%) ± Precision (CV%) Automatisk Manuell R-salt 98 ± 4 90 ± 11 TNT 90 ± 6 124 ± 10 PETN 98 ± 5 86 ± 12
I ett framtida utvecklingsprojekt för SPE-roboten bör en större provvolym appliceras för att undersöka om en lägre detektionsgräns kan erhållas. Vidare bör det uppmärksammas att denna studie är begränsad till Milli-Q vatten. Metodens prestanda bör testas för analys av avloppsvatten eftersom det är den matris för vilken den utvecklade metoden är avsedd för. Eventuellt kan prestandan bli sämre vid analys av avloppsvatten, eftersom dess komplexa matris innehåller fler interfererande substanser jämfört med Milli-Q-vatten.
5.3 Trippel-kvadrupol
Intentionen var att analysera med en Ortitrap, men eftersom detta instrument inte blev färdig installerat i det nya laboratoriet användes istället en trippel-kvadrupol med beskriven LC-MS/MS metod under ”4.3 Instrumentering”. Tanken med att använda masspektroskopi var att erhålla en lägre LOD då syftet med studien var att analysera så låga halter som möjligt. Resultatet visas i Tabell 7 (se Bilaga 11 för de beräknade standardavvikelserna och lutningarna). Kalibreringskurvan är dock endast baserad på fyra lösningar då de två lägsta var under detektionsgränsen (se Bilaga 3 för spädningsschema).
Tabell 7. Detektionsgräns för respektive ämne med MS detektion samt värden för UV-DAD detektion för jämförelse. Värden för MS är baserad på fyra kalibreringslösningar då de två lägsta var under detektionsgränsen (n=4). LOD för MS (µg/ml) LOD för UV-DAD (µg/ml) R-salt 0,025 0,17 TNT 0,094 0,16 PETN 0,103 0,92
22 Ett betydligt lägre LOD erhölls med MS för PETN och R-salt då resultaten blev 8,9 respektive 6,8 gånger lägre jämfört med UV-DAD. Ett något bättre LOD erhölls även för TNT då värdet var 1,7 gånger lägre. En förbättring till ett framtida projekt är att beräkna matriseffekten för att notera om det skett någon ”ion suppression” eller ”ion enhancement”. Vidare bör man testat att byta jonkälla från ESI till APCI, eller till och med testa GC-MS för att se om joniseringen sker effektivare och därmed minska LOD. Utöver detta vore det intressant att testa olika additiv (som analyt bildar ett laddat komplex med) för att effektivisera joniseringen.
23
6. Slutsats
Efter olika tester med tidigare validerade metoder erhölls en god separation med en rimlig analystid genom användning av kolonnen Thermo Scientific Hypersil GOLD™ Vanquish PFP (2,1 mm × 100 mm, 1,9 µm partikelstorlek). Metoden var repeterbar med ett CV% som understiger 0,06% för samtliga substanser inom olika koncentrationsnivåer. Erhållen LOD med UV-DAD var 0,17 µg/ml för R-salt, 0,16 µg/ml för TNT µg/ml och 0,92 µg/ml för PETN. Vidare till SPE-roboten jämfördes flera elueringsmedel och elueringsvolymer varav 3 ml acetonitril genererade ett tillfredsställande utbyte på 90–95 %. Därefter testades olika indunstningssteg i förhoppning att minska LOD, men arbetet var för omfattande för att rymmas i detta arbete. Sist utfördes ett omfattande test för att analysera noggrannheten för den utvecklade metoden av SPE-roboten genom att beräkna riktigheten och precisionen. Metoden gav upphov till en god riktighet mellan 90–98% samt en god precision mellan 4–6 CV% (baserat på medelvärde mellan fyra koncentrationsnivåer), vilket även medför en god noggrannhet. Avslutningsvis genomfördes masspektrometrianalys analys i förhoppning att erhålla en lägre detektionsgräns, vilket åstadkoms för samtliga substanser. För R-salt var LOD 0,025 µg/ml, för TNT 0,094 µg/ml och för PETN 0,103 µg/ml.
Detta arbete har framgångsrikt utfört spårmängdsanalys av R-salt, TNT och PETN i Milli-Q vatten. Dock behöver ytterligare tester genomföras för att säkerställa tillfredsställande resultat även för avloppsvatten som metoden är avsedd för. Arbetet har därmed lagt en grund för FOI:s nya projekt att bekämpa terrordåd samt för att skapa en trygg vardag i samhället. Avslutningsvis skulle metoden teoretiskt även kunna utföras i syfte att upptäcka miljö- och hälsofarliga platser, genom att analysera sprängämnen i olika vattenprover och eventuellt även markprover.
24
Referenser
(1) Akhavan, Jacqueline. Chemistry of Explosives. 2: uppl. Cambridge: Royal Society of Chemistry. År 2004.
(2) Collin, Olivier; Zimmermann, Carolyn; Jackson, Glen. Fast gas chromatography negative chemical ionization tandem mass spectrometry of explosive compounds using dynamic collision-induced dissociation. International Journal of Mass Spectrometry, vol 279(2-3): 93-99. År 2009.
(3) Cortada, Carol; Vidal, Lorena; Canals, Antonio. Determination of nitroaromatic explosives in water samples by direct ultrasound-assisted dispersive liquid–liquid microextraction followed by gas chromatography–mass spectrometry. Talanta, vol 85(5): 2546–2552. År 2011. (4) Dykyj, J; Svoboda, J: Wilhoit, R.C; Frenkel, M; Hall, K.R. 2 Organic Compounds, C0 to C84. | Hall, K.R (red). Vapor Pressure and Antoine Constants for Nitrogen Containing Organic Compounds. Berlin: Springer vol20; 14-122. År 2001. (5) Gapeev, Alexei; Sigman, Michael; Yinon, Jehuda. Liquid chromatography/mass spectrometric analysis of explosives: RDX adduct ions. Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol 17(9): 943-948. År 2003.
(6) Halasz, Annamaria; Manno, Dominic; Perreault, Nancy N; Sabbadin, Federico; Bruce, Neil; Hawari, Jalal. Biodegradation of RDX Nitroso Products MNX and TNX by Cytochrome P450 XplA. Environmental Science & Technology, vol 46(13): 7245-7251. År 2012.
(7) Harris, Daniel. Quantitative Chemical Analysis. 9: onde uppl. New York: W. H. Freeman and Co. År 2016.
(8) Irlam, Rachel; Parkin, Mark; Brabazon, Dermot; Beardah, Matthew; O´Donnell, Michael; Barron, Leon. Improved determination of femtogram-level organic explosives in multiple matrices using dual-sorbent solid phase extraction and liquid chromatography-high resolution accurate mass spectrometry. Talanta, vol 203(1): 65-76. År 2019.
(9) Jenkins, Thomas; Walsh, Marianne; Miyares, Paul; Hewitt, Alan; Collins, Nicholas; Ranney, Thomas. Use of snow-covered ranges to estimate explosives residues from high-order detonations of army munitions. Thermochimica Acta, vol 384(1-2): 173-185. År 2002.
(10) Miao, Zongcheng; Li, Faan; Luan, Yi. Theoretical studies on triacetonetriperoxide (TATP) derivatives to improve their performance. Quimica Nova, vol 42(1): 22-27. År 2019. (11) Miller, James; Miller, Jane. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. 6: e uppl. Harlow: Pearson Education. År 2010.
(12) Monteil-Rivera, Fanny; Beaulieu, Chantale; Beschamps, Stéphane; Paquet, Louise; Hawari, Jalal. Determination of explosives in environmental water samples by solid-phase microextraction–liquid chromatography. Journal of Chromatography A, vol 1048(2): 213-221. År 2004.
(13) Nie, Dongxia; Li, Ping; Zhang, Dan; Zhou, Tianshu, Zhou; Liang, Ying; Shi, Guoyue. Simultaneous determination of nitroaromatic compounds in water using capillary electrophoresis with amperometric detection on an electrode modified with a mesoporous nano‐structured carbon material. Electrophoresis, vol 31(17): 2981-2988. År 2010.
(14) Rapp-Wright, Helena; McEneff, Gillian; Murphy, Bronagh; Gamle, Sally; Morgan, Ruth; Beardah, Matthew; Barron, Leon. Suspect screening and quantification of trace organic explosives in wastewater using solid phase extraction and liquid chromatography-high resolution accurate mass spectrometry. Journal of Hazardous Materials, vol 329(1): 11-21. År 2017.
(15) Reza Sobhi, Hamid; Kashtiaray, Amir; Farahani, Hadi; Javaheri, Majid; Reza Ganjali, Mohammad. Quantitation of mononitrotoluenes in aquatic environment using dispersive liquid–liquid microextraction followed by gas chromatography–flame ionization detection. Journal of Hazardous Materials, vol 175(1-3): 279-283. År 2010. (16) Schramm, Sébastien; Léonço; Huber, Cécile; Tabet, Jean-Claude; Bridoux. Development and validation of an isotope dilution ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the reliable quantification of 1,3,5-Triamino-2,4,6-trinitrobenzene (TATB) and 14 other explosives and their degradation products in environmental water samples. Talanta, vol 143(1): 271–278. År 2015.
(17) Steuckart, Carsten; Berger-Preiss, Edith; Levsen, Karsten. Determination of Explosives and Their Biodegradation Products in Contaminated Soil and Water from Former Ammunition Plants by Automated Multiple Development High-Performance Thin-Layer Chromatography. Analytical Chemistry, vol 66(15): 2570-2577. År 1994.
(18) Tachon, Romain; Pichon, Valérie; Barbe Le Borgne, Martine; Minet, Jean-Jacques. Comparison of solid-phase extraction sorbents for sample clean-up in the analysis of organic explosives. Journal of Chromatography A, vol 1185(1): 1-8. År 2008.
(19) Vigneau, Oliver; Machuron-Mandard. A LC–MS method allowing the analysis of HMX and RDX present at the picogram level in natural aqueous samples without a concentration step. Talanta, vol 77(5): 1609–1613. År 2009. (20) Xu, Xiaoma; Koeberg, Mattijs; Kuijpers, Chris-Jan; Kok, Eric. Development and validation of highly selective screening and confirmatory methods for the qualitative forensic analysis of organic explosive compounds with high performance liquid chromatography coupled with (photodiode array and) LTQ ion trap/Orbitrap mass spectrometric detections (HPLC-(PDA)-LTQOrbitrap). Science & Justice, vol 54(1): 3-21. År 2014. (21) Yinon, Jehuda. Forensic and Environmental Detection of Explosives. Chichester; John Wiley & Sons Ltd. År 1999.
Bilagor (1–11)
Bilaga 1 – GANTT-schema Upprättat GANTT-schema för projektet.
Bilaga 2 – Spädningsschema 1 Spädningsschema för UV-DAD analys.
Bilaga 3 – Spädningsschema 2
Spädningsschema för MS analys. Kalibreringslösning 1 och 2 hade för låga signal-brusförhållande att dessa inte kunde betraktas som signifikanta toppar. Därför är dessa två rödmarkerade och kunde inte användas.
B ila ga 5 – A n aly s a v p re sta nd a f ör L C K om ple tte ra nd e da ta fö r an aly s av p re sta nd a fö r de n utv ec kla de U H P LC -m eto de n. D ett a utf ör de s ge no m a tt an aly se ra s ex r ep lik at av fy ra k ali br er in gs lö sn in ga r m ed o lik a ko nc en tra tio ne r. D ata o m fa tta r a re a f ör re sp ek tiv e s ub sta ns o ch a na ly s s am t b er äk na t x -v är de (v ilk et be rä kn ad es m ed e kv ati on en e rh åll en fr ån k ali br er in gs lö sn in ga r, se B ila ga 2 fö r s pä dn in gs sc he m a) . V id ar e b er äk na de s e tt m ed elv är de a v d e e rh åll na x -v är de na in om v ar je n iv å s am t s pr id nin ge n m ell an d e b er äk na de x -v är de na fö r a tt t ill si st sk att a C V % .
Bilaga 6 – LOD för UV-DAD
Kompletterande data för LOD beräkning. Fyra replikat genomfördes för att erhålla standardavvikelsen mellan de erhållna y-värdena. Lutningen erhölls från upprättad kalibreringskurva (se Bilaga 2 för kalibreringsintervall). LOD beräknades med Ekvation 6. För att till sist erhålla koncentrationen sattes det beräknade värdet från Ekvation 6 in i linjens ekvation.
B ila ga 7 – J äm fö re lse a v o lik a e lu er in gs m ed el F yr a k ali br er in gs lö sn in ga r b er ed de s f ör a tt up pr ätt a e n k ali br er in gs ku rv a f ör R -s alt o ch T N T. T vå M illi -Q -v att en pr ov er sp ik ad es ti ll ko nc en tra tio ne n 0 ,3 8 u g/m l R -sa lt oc h 0,3 0 ug /m l TN T. A re a re do vis as fö r ka lib re rin gs lö sn in ga rn a sa m t fö r pr ov er na fö r att på så sä tt be rä kn a x-v är de m ed lin je ns ek va tio n frå n ka lib re rin gs lö sn in ga rn a. D es sa x -v är de n a nv än de s f ör a tt t ill si st be rä kn a u tb yte fö r r es pe kti ve e lu er in gs m ed el, v ilk et be rä kn ad es g en om a tt d ela x-vä rd et er hå lle t fr ån M ill i-Q -p ro ve t o ch k ali br er in gs lö sn in g s om m ots va ra de 1 00 % u tb yte (s ist g ån gr a m ed 1 00 fö r a tt f å i p ro ce nt) .
Bilaga 8 – Jämförelse av olika elueringsvolymer
Utbyten för respektive försök med olika elueringsvolymer. Till respektive analys spikades Milli-Q vatten till samma koncentration; 0,29 µg/ml R-salt, 0,29 µg/ml TNT, 0,32 µg/ml PETN. Koncentrationen för respektive vattenprov beräknades med ekvationen erhållen av tre kalibreringslösningar för 2,5 ml och för 3,5 ml men för 3 ml bestod ekvationen av sex kalibreringslösningar. Två replikat utfördes för 2,5 ml och 3,5ml men för3 ml utfördes sex replikat. Det är givetvis mer föredömligt att både analysera samma antal kalibreringslösningar och antal replikat för att erhålla en mer rättvis statistiskdata. Men detta kunde inte utföras på grund av tidsbrist. Utbytet beräknades genom att dela x-värdet från Milli-Q-provet och kalibreringslösning som motsvarade 100% utbyte (sist gångra med 100 för att få procent).
Bilaga 9 – Jämförelse av olika indunstningsmetoder
Utbyten för respektive försök med olika indunstningsmetoder. Till samtliga analyser spikades Milli-Q vatten till samma koncentration; R-salt 0,29 ug/ml, TNT 0,29 ug/ml och PETN 0,32 ug/ml. Koncentrationen för respektive vattenprov beräknades med ekvationen erhållen av fyra kalibreringslösningar för 2,5 ml till 0,4 ml; sex lösningar för 4 ml till 0,2 ml och sist tre lösningar till 2,5 ml till 0,2 ml. Två replikat utfördes för första metoden, sex replikat för andra metoden och för sista metoden utfördes två replikat. Det är givetvis mer föredömligt att både analysera samma antal kalibreringslösningar och antal replikat för att erhålla en mer rättvis statistiskdata. Detta kunde dock inte utföras på grund av tidsbrist. Utbytet beräknades genom att dela x-värdet från Milli-Q-provet och kalibreringslösning som motsvarade 100% utbyte (sist gångra med 100 för att få procent).
Bilaga 10 – Analys av prestanda för SPE-robot
Kompletterande data för analys av prestanda för den utvecklade SPE-robot-metoden. Testet innebar inspikning av Milli-Q vatten i fyra koncentrationsnivåer för att sedan genomföra sex replikat av varje nivå. Till nivå 1 spikades Milli-Q vatten till ca 0,3 µg/ml för respektive substans, för nivå 2 ca 0,15 µg/ml, för nivå 3 ca 0,05 µg/ml och sist för nivå 4 ca 0,025 µg/ml. Data innefattar area för respektive substans och analys, det beräknade x-värdet (vilket beräknades med ekvationen erhållen från sex kalibreringslösningar, se Bilaga 2 för kalibreringsintervall) samt utbyte för varje försök. Sist beräknades ett medelvärde för x-värde och spridningen mellan de beräknade x-värdena för att beräkna CV% samt ett medelvärde av utbytet. Utbytet beräknades genom att dela x-värdet från Milli-Q-provet och kalibreringslösning som motsvarade 100% utbyte (sist gångra med 100 för att få procent).
Bilaga 11 – LOD för MS
Kompletterande data för LOD beräkning. Fyra replikat genomfördes för att erhålla standardavvikelsen mellan de erhållna y-värdena. Lutningen erhölls från upprättad kalibreringskurva (se Bilaga 3 för kalibreringsintervall). LOD beräknades med Ekvation 6. För att till sist erhålla koncentrationen sattes det beräknade värdet från Ekvation 6 in i linjens ekvation.
