Formulering av kutana beredningar och dess inverkan på hudbarriären
– med fokus på penetrationsegenskaper
Hoda Albazi
Fördjupningsprojekt i farmaceutisk teknologi och kvalitetssäkring, 15 hp, VT 2021 Examinator: Göran Alderborn
Handledare: Erik Björk
Institutionen för farmaceutisk biovetenskap Farmaceutiska fakulteten
Sammanfattning
Introduktion: Huden är människans största organ och dess funktion är att skydda kroppen mot uttorkning och främmande ämnen. Huden kan delas upp i flera lager: underhuden, läderhuden och överhuden. Överhuden utgörs av stratum corneum som huvudsakligen ansvarar för hudbarriärens egenskaper och som begränsar dess penetration.
Syfte: Syftet med studien är att studera vilken typ av formulering som kan förbättra
penetrationen av vattenlösliga och svårpenetrerande ämnen som hyaluronsyra och azelainsyra genom hudbarriären.
Metod: En systematisk litteraturöversikt har gjorts genom att söka efter originalartiklar via databasen Web of Science med hjälp av inklusions- och exklusionskriterier.
Resultat: Penetrationstester av olika nanoformuleringar av hyaluronsyra och azelainsyra utfördes. Variationer i molekylvikt och partikelstorlek av hyaluronsyra, liksom mängden ytaktiva, ämnen gav olika penetreringsdjup i huden.
Diskussion: För att förbättra penetrationen av hyaluronsyra och azelainsyra genom stratum corneum bör aspekter såsom molekylvikt, partikel/droppstorlek, viskositet, koncentration liksom val av vehikel tas hänsyn till vid formulering.
Slutsats: Nanoemulsioner visade sig vara en optimal formulering för att förbättra
penetrationen av hyaluronsyra och azelainsyra, tack vare minskning av partikelstorlek samt de lipofila egenskaperna i gemenskap med hudbarriären.
Innehållsförteckning
1. Förkortningar……….…….4
2. Introduktion……….………5
2.1 Hudens anatomi och funktion……….5
2.2 Permeabilitet genom hudbarriären ………..…………...……6
2.3 Hyaluronsyra………..…7
2.4 Hudsjukdomar………..…..7
2.5 Formuleringsutveckling……….8
3. Syfte och frågeställningar……….9
4. Metod………...…..…10
5. Resultat……….12
5.1 Penetration av hyaluronsyra med olika molekylvikter………12
5.2 Nanoformulering och penetration av hyaluronsyra………..……...13
5.3 Nanoformulering och penetration av azelainsyra.……….………..16
5.4 Stabilitetstester……….17 6. Diskussion………..18 6.1 Molekylvikt av hyaluronsyra………18 6.2 Partikelstorlek………20 6.3 Reologi (viskositet)………22 6.4 Stabilitet……….23
6.5 Ytaktiva ämnens inverkan på penetration……….….24
6.6 Vattenhaltiga beredningar eller emulsioner?...24
7. Slutsats……….26
8. Framtida perspektiv………26
9. Tack………..27
1. Förkortningar
• AZA = azelainsyra • DMSO = dimetylsulfoxid
• Da = Dalton (enhet för molekylvikt) • HA = hyaluronsyra
• HANP = nanopartiklar av hyaluronsyra • IPP = isopropyl palmitate
• MCTG = medium chain triglycerides • o/v = olja i vatten
• SC = stratum corneum
• S/C = surfaktant/co-surfaktant
• SCLL = stratum corneums intercellulära lipid • v/o = vatten i olja
• P = Pluronic F127
2. Introduktion
2.1 Hudens anatomi och funktion
Huden utgör människans största organ och har en yta på cirka 2 kvadratmeter. Huden skyddar kroppen mot mikroorganismer, främmande ämnen och solens skadliga UV-strålning. Huden skyddar även mot uttorkning och reglerar vår kroppstemperatur. Huden delas upp i tre lager: överhuden, läderhuden och underhuden. Underhuden ligger under läderhuden och består mestadels av fettceller. Läderhuden (dermis) ligger över underhuden och utgör huvuddelen av huden. Den består huvudsakligen av kollagen och elastin i en mucopolysackarid gel – denna kombination utgör en vattenhaltig miljö i liknelse med en hydrogel. Läderhuden består även av blodkärl, nervändar, hårsäckar, talgkörtlar och svettkörtlar. Läderhuden ansvarar för reglering av kroppstemperatur, sårreperation, tillförsel av syre och näringsämnen samt transport av avfall.
Överhuden (epidermis) är det yttersta lagret av huden och består av stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosom, stratum lucidum och stratum corneum. Stratum corneum ansvarar huvudsakligen för hudbarriärens egenskaper och begränsar dess permeabilitet genom huden. Stratum corneums tjocklek varierar på olika delar av kroppen. Hud som utsätts för mycket slit som handflator och fotsolur har tjockare överhud medans överhuden är som tunnast på läppar och ögonlock (Aulton och Taylor, 2018).
Figur 1. Schematisk bild av hudens anatomi (Wikipedia länk 1).
2.2 Permeabilitet genom hudbarriären
För att en molekyl ska passera hudbarriären via stratum corneum finns det olika diffusionsvägar via passiv diffusion (från hög till låg koncentration): intercellulära,
intracellulära samt shuntvägar (fördelning genom sebum eller svett via talg- eller svettkörtlar). Vilken väg det blir beror på molekylens fysikalkemiska egenskaper. För både intercellulär och intracellulär transport måste molekylen passera flera dubbla lipidskikt mellan corneocyterna och därmed är delning och diffusion genom dessa lipidmiljöer nödvändiga (Aulton och Taylor, 2018). Lipofila ämnen tar sig igenom stratum corneum via den intercellulära vägen, medan hydrofila ämnen via den intracellulära vägen (Barry, 1987). Molekylvikten är också en avgörande faktor för transport genom huden. Hudbarriären skyddar mot externa kemikalier och förhindrar därmed passage av större molekyler, som peptider och proteiner.
Molekylvikten bör därför vara mindre än 500 Da och ha ett log P 1–4 för penetration genom hudbarriären (Aulton och Taylor, 2018).
2.3 Hyaluronsyra
HA är en hydrofil polymer med en hög molekylvikt. Generellt är ämnen med hög molekylvikt (1200 kDa) och vattenlöslighet svåra att diffundera genom huden (Shigefuji och Tokudome, 2020; Tokudome et al, 2018). HA har en hög adsorptivitet till keratinocyter via intracellulära vägen, därför penetrerar det inte lika djupt i huden och blir kvar på ytan (Shigefuji och Tokudome, 2020).
Figur 2. Kemisk struktur av hyaluronsyra (Wikipedia länk 2).
2.4 Hudsjukdomar
Hårsäckar och tillhörande talgkörtlar utsöndrar sebum, vilket består av fettsyror, vax och triglycerider. Dessa smörjer in hudytan och behåller pH värdet runt 5. Antalet hårsäckar per kubikcentimeter varierar med hudområdet och på pannan upptas cirka 13 % av hudytan av hårsäckar (Aulton och Taylor, 2018). Individer med akne har en bland annat ökad
talgproduktion vilket ger upphov till pormaskar som orsakar en tillväxt av bakterier och till följd av detta en inflammation (Läkemedelsboken, 2017). Dessa kanaler som upptas av svett eller sebum kan även blockera läkemedelsupptaget (Aulton och Taylor, 2018).
Azelainsyra är ett vattenlösligt läkemedel mot akne som också har sämre penetration genom huden, vilket minskar dess terapeutiska effekt och ökar den hudirriterande potentialen (Salimi et al, 2020). Men med hjälp av formulering av nanopartiklar kan penetrationen förbättras och komma åt folliklarna för att behandla exempelvis akne (Aulton och Taylor, 2018).
2.5 Formuleringsutveckling
Vid val av formulering måste hänsyn till molekylens fysikalkemiska egenskaper tas såsom molekylvikt, löslighet och pKa. Formuleringen måste vara hållbar och ha god stabilitet och den aktiva substansen och hjälpämnen måste vara kompatibla med varandra. Slutligen måste formuleringen vara kosmetiskt acceptabel av användarna, kännas bra på huden, samt ha en godtagbar textur och doft. Halvfasta beredningar som emulsioner i krämer, tillåter en längre residenstid på huden än flytande formuleringar samt är mer accepterande av användarna (Aulton och Taylor, 2018). Hudtyp och hudtillstånd, liksom egenskaperna hos
applikationsstället, bör också tas hänsyn till när vehikel utses (Tomic et al, 2019).
En hydrofil substans som befinner sig i en hydrofil formulering kommer inte att frisättas lika effektivt och penetrera hudbarriären som en hydrofil substans som befinner sig i en lipofil formulering. Den valda vehikeln ska självklart tillåta en viss löslighet av substansen men ska inte behålla substansen genom att vara ett för bra lösningsmedel. En hög koncentration av en aktiv substans skapar en koncentrationsgradient mellan den applicerade beredningen på huden och hudbarriären. Detta leder till en passiv diffusion av substansen genom hudbarriären och därmed en förbättrad penetrationsförmåga hos substansen (Aulton och Taylor, 2018).
HA och AZA är två substanser som används inom hudvård och som båda har
penetrationssvårigheter genom hudbarriären. Nanopartiklar av dessa är således ideala formuleringar för hydrofila molekyler som HA och AZA, tack vare de
penetrationsförbättrande egenskaperna. Nanoformuleringar kan öka den lokala eller
systematiska biotillgängligheten av läkemedel (Alkrad et al, 2016) då de är designade för att effektivt passera hudbarriären (Tokudome et a al, 2018).
3. Syfte
Syftet med studien är att studera vilken typ av formulering som kan förbättra penetrationen av vattenlösliga och svårpenetrerande ämnen som HA och AZA genom hudbarriären.
Frågeställningar:
• Vilken av formuleringarna vattenhaltiga nanoformuleringar respektive
nanoemulsioner är den mest optimala formuleringen för penetration av HA och AZA? • Vilken av formuleringarna är mest hållbar?
• Vilken koncentration av substanserna krävs för god penetration och samtidigt undvika
4. Metod
För resultatdelen har en systematisk litteraturöversikt gjorts genom att söka efter
originalartiklar med hjälp av databasen Web of Science. De artiklar som exkluderades var de som var publicerade innan år 2000, som inte var på engelska, som inte fanns tillgängliga i full text samt alla översiktsartiklar. De artiklarna som inkluderades hittades med hjälp av följande sökord (inklusionskriterier): skin, penetration, barrier, hyaluronic acid, azelaic acid,
molecular weight, stability, formulation, microemulsion*.
Tabell 1. Datasökning i databasen Web of Science. Antal träffar redovisas efter att sökningen
begränsats med exklusionskriterier. Urval 1 visar antalet relevanta rubriker, urval 2 visar vilka av dessa som hade en relevant sammanfattning och urval 3 visar hur många artiklar som till slut valdes ut med relevant syfte och som behandlade angivna inklusionskriterier.
Databas Sök# Sökord Antal träffar Urval 1 Urval 2 Urval 3
Web of Science 1 Skin, penetration, hyaluronic acid 27 3 2 2 Web of Science 2 Skin, penetration, azelaic acid 18 6 4 1 Web of Science 3 Skin, penetration, hyaluronic acid, barrier
19 3 3 2 Web of Science 4 Skin, penetration, hyaluronic acid, molecular weight 23 3 2 1 Web of Science
5 Skin, hyaluronic acid, stability, formulation
30 1 1 1
Web of Science
6 Skin, hyaluronic acid, microemulsion*
7 4 3 1
Web of Science
7 Skin, azelaic acid, microemulsion*
*Sökordet microemulsion användes istället för nanoemulsion då dessa typer av formuleringar också hade en droppstorlek på nanometer vilket underlättade sökningen.
Ytterligare en artikel har valts efter att ha gjort en sekundärsökning i artikeln ”Transdermal transport of collagen and hyaluronic acid using water in oil microemulsion” skriven av Szumala et al, 2019 där referenslistan har granskats.
Artiklar som sållades bort vid urval 2 var:
• artiklar som fokuserade på andra typer av hjälpämnen
• artiklar som inte var av god kvalitet, hade låg evidensstyrka samt otillförlitliga resultat
efter att ha granskats med hjälp av SBU:s granskningsmallar
• artiklar som hade allt för breda studieupplägg och avancerade resultat, då de använde
5. Resultat
Penetrationstester av olika nanoformuleringar av HA och AZA utfördes. Variationer i molekylvikt och partikelstorlek av HA och AZA (se tabell 2), liksom mängden ytaktiva ämnen, resulterade i olika penetreringsdjup i huden.
Tabell 2. Sammanställning av resultat från olika studier med nanoformuleringar som undersöktes för
penetrationstester. Dessa resultat presenteras sedan nedan. Formulering Substans Molekylvikt
(kDa) Partikel/dropp- storlek (nm) Surfaktanter/co-surfaktanter Oljefaser
Emulsion (o/v) HA 1200 100 Pemulen TR-2 Diisopropyladipat
Squalance Emulsion (v/o) HA < 10 - > 1000 10–100 Tween 80
Span 80 - Emulsion (v/o) HA 22 10 37 Tween 80 + Span 20 Span 20 IPP MCTG
Emulsion (o/v) AZA - 48–151 Tween 80
Capryol 90
Oljesyra + Transcutol-P
Suspension AZA - 59,2 +/- 3,8 Polysorbat 60
Pluronic F127
-
5.1 Penetration av hyaluronsyra med olika molekylvikter
Vid kutana penetrationstester har det möjliggjorts detektering och lokalisering av 1 % HA-molekyler med olika molekylvikter i huden. Detta har genomförts med hjälp av
Ramanspektroskopi vilket är en känslig spektroskopisk teknik som bland annat identifierar små variationer i huden. HA-molekyler fanns i hudavsnittet vid cirka 100 um (full epidermisk djup) för 20–50 kDa HA och cirka 50 um epidermisk djup för 100–300 kDa HA. Medan för HA-molekylen med högmolekylvikt (1000–1400 kDa) översteg inte penetrationen mer än 25 um djupt. Det observerades att för alla HA-molekyler hittades den största mängden i stratum
corneum, cirka 25 um från ytan. 20–50 kDa-HA var mycket närvarande i de djupaste epidermislagren av epidermis, medan 100–300 kDa-HA var lokaliserat i det överliggande lagret av epidermis under stratum corneum. 1000–1200 kDa-HA fanns endast i stratum corneum (Essendoubi et al, 2015).
5.2 Nanoformulering och penetration av hyaluronsyra
HA granulerades och nanopartiklar av HA (HANP) framställdes i syfte till att förbättra
hudpenetrationen. Penetrationen av HA och HANP genom stratum corneum detekterades med hjälp av flourescens i diffusionsceller för både vattenhaltiga beredningar och emulsioner. För de vattenhaltiga beredningarna undersöktes penetrationen genom full hudtjocklek eller avskalad hud av mus. Vattenhaltiga HA-lösningar och HANP-suspensioner penetrerade inte genom mushuden med full tjocklek. För den avskalade huden, förblev den vattenhaltiga HA-lösningen kvar på ytan (Tokudome et al, 2018) i keratinocyterna (Shigefuji och Tokudome, 2020), medan HANP-suspensionen penetrerade djupare genom huden (Tokudome et al, 2018) i stratum corneums lipid liposomer (SCLL). Interaktionen mellan HANP eller HA med
keratin och SCLL prövades därför. Keratin adsorptionen var högre för HA än för HANP, medan SCLL adsorptionen var högre för HANP än för HA. HA stannade därför kvar på ytan av stratum corneum för både avskalad och full hudtjocklek, medan penetrationen genom stratum corneum bekräftades för HANP (Shigefuji och Tokudome, 2020).
Figur 3. Hudpenetration genom SC av vattenhaltiga HA och HANP beredningar för avskalad hud (E,
F, G och H) respektive hud i full tjocklek (A, B, C och D). Fluorescens (grön) av HA (A, C, E och G) eller HANP (B, D, F och H) observerades. Bright-feld bilder visas i A, B, E och F och fluorescerande
bilder i C, D, G och H (Tokudome et al, 2018).
För emulsionerna (o/v) undersöktes penetrationen endast genom full hudtjocklek. HA eller HANP var emulgerad i olika oljor, antingen diisopropyladipat eller squalance. För
emulsionerna med squalance, observerades ingen fluorescens av HA i huden efter 48 h applicering, av varken HA eller HANP. För emulsionerna innehållande diisopropyladipat, observerades fluorescens av HA som penetrerade stratum corneum och även ännu djupare i huden för HANP (Tokudome et al, 2018).
Nanoemulsioner (v/o) med olika koncentrationer (2, 1 och 0,5 %) av lågmolekylvikt HA studerades. Formuleringen med 2 % HA gav den lägsta HA-frisättningen jämfört med andra
HA-koncentrationer. När koncentrationen av HA minskades, ökades frisättningsgraden av denna polymer. Nanoemulsionen med 0,5 % HA hade den högsta frisättningen och ingen signifikant skillnad i slutlig frisättning av HA (efter 24 h) observerades mellan
formuleringarna, oavsett deras olika sammansättningar.
Mängden frisatt högmolekylvikt HA från nanoemulsionen med den högsta koncentrationen av HA, var jämförbar med 2 % lågmolekylvikt HA-formuleringen. Dessutom erhölls låga värden från formuleringen med 1 % högmolekylvikt HA som hade liknande frisättningsvärden som 1 % lågmolekylvikt HA. För system med 1 % och 0,5 % högmolekylvikt HA, var frisättningen signifikant högre för nanoemulsioner med ett lågt och medium innehåll av S/C (Szumala et al, 2019). Två andra v/o nanoemulsioner med 2 % HA (22 kDa) och olika oljefaser (IPP eller MCTG) som stabiliserades med icke-joniska surfaktanter, antingen Tween 80 tillsammans med Span 20 eller endast Span 20, visade att HA-IPP hade högre in vitro tillgänglighet och den snabbaste upplösningen jämfört med HA-MCTG (Alkrad et al, 2016).
Den höga koncentrationen av lågmolekylvikt (cirka 2 kDa) HA som penetrerade hudbarriären visade att minskning av partikelstorleken av HA till 5 nm kunde tränga igenom de
intercellulära utrymmena och är därmed ett effektivt tillvägagångssätt för att transportera HA över hudceller. Den mest aktiva penetrationen av de två testade låga lågmolekylvikt HA-koncentrationerna observerades under de första 4–5 timmarna, där 50 % av serumet kunde passera hudbarriären. Detta indikerar på att mängden serum som kunde penetrera under de första 4 timmarna är direkt relaterad till molekylernas förmåga att passera hudbarriären och mindre beroende av nivån på dess initiala koncentration i serumet. Därefter saktade
penetrationshastigheten ner och ytterligare 20 % absorberades mellan 5:e och 8:e timmen innan den nådde jämviktstillståndet (Nashchekina et al, 2017).
5.3 Nanoformulering och penetration av azelainsyra
Penetrationsstudier av AZA-laddade nanoemulsioner (o/v) utfördes på både hårig och icke-hårig marsvinshud. Permeabilitetsparametrarna för de flesta nanoemulsionerna genom icke-hårig hud var mindre än för den icke-håriga huden. Detta överensstämmer med AZA’s hydrofila natur. Det verkade som att nanoemulsionerna signifikant ökade AZA’s löslighet genom den epidermala vägen. Läkemedelsfrisättningsprofilen visade att 36–42 % av AZA släpptes under experimentets 24 timmar. Lösligheten av AZA i nanoemulsionen var fullständig och så diffusionen var det hastighetsbestämmande steget. Resultaten visade att vid penetration genom den håriga huden, är endast effekten av surfaktantkoncentrationen viktig medan effekten av olja och vatten är försumbar. I denna studie, påvisades ackumulering av AZA i folliklarna av nanoemulsionerna. Nanoemulsionen med hög surfaktantkoncentration hade den högsta penetrationen genom epidermis för icke-hårig hud (Salimi et al, 2020).
En vattenlöslig nanokristallsuspension av AZA-laddad hydrogel med antingen P (Pluronic F127) eller PHA förbereddes för att förbättra penetration av AZA genom stratum corneum. Våtmalning av AZA genomfördes genom att använda sig av olika koncentrationer av
polysorbat 60 (en icke-jonisk surfaktant) för att öka stabiliteten och minska aggregation (och därmed partikelstorlek) av nanokristallerna. Penetrationen genom huden är beroende av partikelstorleken, målet var därför att erhålla minsta möjliga storlek av AZA nanokristaller genom att använda den lägsta möjliga koncentrationen av polysorbat 60, eftersom surfaktanter även kan orsaka hudirritation. Nanokristallernas storlek ökade något vid minskad polysorbat 60 koncentration – detta påverkade dock inte effekten.
Penetrationstester mellan AZA-PHA hydrogeler (hydrofil) och en 20 % AZA referenskräm (lipofil) jämfördes och visade liknande total penetrationsdjup genom stratum corneum av
AZA för alla formuleringar. Mängden AZA penetrerad genom stratum corneum nådde endast värden mellan 5–6 % av applicerad dos för alla formuleringar. Frisättningshastigheten
(diffusion) för AZA-laddad PHA hydrogeler var cirka 10 gånger högre än för referenskrämen, vilket frisatte 5 % AZA inom samma tid (Tomic et al, 2019).
5.4 Stabilitetstester
Fyra olika formuleringar innehållandes lika mycket HA (300–1000 kDa), undersöktes för stabilitetstest. Prov A och B var emulsioner och prov C och D var mjuka salvor (se tabell 3).
Tabell 3. Kemisk komposition av formuleringarna som undersöktes för stabilitetstest (Olejnik et al,
2015).
Formulering Komposition
A Stearinsyra, lanolin, trietanolamin, destillerat vatten, glycerin, allantoin, natriumlaurylsulfat, citronsyra, HA
B Polyoxyetelenstearyleter, lanolin, trietanolamin, destillerat vatten, glycerin, allantoin, citronsyra, HA
C Cetylalkohol, bivax, vegetabilisk olja, destillerat vatten, citronsyra, HA D Vaselin, paraffinolja, lanolin, borax, vegetabilisk olja, bivax, citronsyra,
destillerat vatten, HA
Under ett analysprov observerades omvänd sedimentation av prov C som ledde till en gradvis koncentrationsminskning vid botten av provet. Detta fenomen kallas för gräddsättning. Dropparna i prov C rörde sig uppåt eftersom de hade en lägre densitet än den omgivande vätskan. Enorma förändringar i partikelstorlek observerades när resultaten direkt efter beredning jämfördes med det som erhölls efter 6 månaders lagring i rumstemperatur.
Prov proverna A, B och D var flockulering den viktigaste observationen för
emulsionsdestabilisering vilket också påverkade droppstorleken. Beroende på vilka typer av ingredienser som användes för att erhålla formuleringarna, var ändringarna i droppstorlek olika. För prov D inträffade nästan inga förändringar under de första dagarna och sedan skedde en snabb flockulering som inträffade under de första 14 dagarna av lagring. Efter denna tid upptäcktes inga fler förändringar i droppstorlek. Partikelstorleken hos dropparna i prov A förändrades något under de första 14 dagarna och förblev sedan stabil. De minsta förändringarna i partikelstorlek observerades i prov B där det skedde en lätt aggregering av partiklarna. Närvaron av ett mindre hydrofobiskt fettsyraderivat som polyoxyetelenstearyleter som användes istället för stearinsyra (prov A) i oljefasen, påverkade förmodligen
emulsionsstabiliteten (Olejnik et al, 2015).
6. Diskussion
För att förbättra penetrationen av vattenlösliga substanser som HA och AZA genom stratum corneum bör, enligt studien, aspekter såsom molekylvikt, partikel- och droppstorlek,
viskositet, koncentration liksom val av vehikel tas hänsyn till vid formulering.
6.1 Molekylvikt av hyaluronsyra
Resultaten från Essendoubi et al (2015) visade att penetrationen av HA ökar med minskande molekylvikt av HA. Detta överensstämmer med andra studier som visar att HA med låg molekylvikt (50 kDa) var associerad med en betydande förbättring av hudåterfuktning och rynkor, vilket berodde på en förbättrad penetrationsförmåga tack vare lägre molekylvikt av HA. HA med högmolekylvikt (> 1000 kDa) håller sig däremot på ytan av huden där det skapar ett lager som minskar avdunstning och skyddar huden mot miljöfaktorer såsom
temperatur, fuktighet och UV-strålning. I dessa fall krävs ingen penetration genom hudbarriären (Essendoubi et al, 2015).
Resultatet från Szumala et al (2019) kan associeras med struktur och liten partikelstorlek. Ju högre HA-koncentration och solubilisering, desto lägre penetration av HA. Och ju större mängd S/C som användes, desto mindre partikelstorlek mättes i nanoemulsionerna. De mindre partiklarna kommer att kunna tränga igenom, och kvar blir de större partiklarna som skapar ett blockerande lager på hudytan.
Molekylvikten av HA påverkar starkt partikelstorleken hos nanoemulsionerna. Det kan ha förväntats att en så stor skillnad i molekylvikt mellan HA < 10 kDa och HA > 1000 kDa skulle haft en större inverkan på deras frisättning, men förklaringen till detta kan vara den specifika strukturen för partiklarna i nanoemulsionerna med högmolekylvikt HA (Szumala et al, 2019). Som beskrivits i tidigare studie (Kupper et al, 2017) kan ”pre-micellära” aggregat bildas av HA – Tween liknande surfaktantinteraktioner – som resulterar i intramicellär självaggregering av högmolekylvikts HA (Alkrad et al, 2016) med vatten inneslutet i gelstrukturen. Ytaktiva ämnen vid gränssnittet, som stabiliserar nanoemulsionen genom att bilda vätebindningar, kan därför dras in i dessa gelstrukturer och minska partikelstorleken i nanoemulsioner med högmolekylvikt HA. Dessutom, i bunden med en tensidform, kan HA lättare frigöras och få högre rörlighet på grund av minskningen av HA-aggregatets
hydrofilicitet efter ”fästning” med den hydrofoba delen av det ytaktiva ämnet (Szumala et al,
Figur 4. Ytaktiva ämnen vid gränssnittet och deras inflytande på strukturen av nanodroppar med
lågmolekylvikt (LMW) och högmolekylvikt (HMW) HA (Szumala et al, 2019).
Dessa resultat indikerar att partiklar med en högre molekylvikt kan ha penetrationsförmåga om de finns i form av nanopartiklar som underlättar deras penetration. Forskningen visade alltså att de variabler som påverkade penetrationen mest var i följande ordning: HA
koncentration i lösning > solubiliseringskapacitet > HA molekylvikt > PDI > partikelstorlek. Molekylens storlek och vikt var alltså inte den viktigaste faktorn som begränsade
penetrationen för de studerade storleksintervallen (Szumala et al, 2019).
6.2 Partikelstorlek
Resultaten bevisade att penetrationen av vattenlösliga högmolekylviktsämnen som hyaluronsyra kan förbättras med hjälp av nanoformulering av dessa. Diffusionen genom huden var lägre för HA och blev därmed förbättrad av nanoformuleringen som kunde
diffundera enkelt genom huden som en nanopartikel. Resultaten visade även att HA penetrerar huden via den intracellulära vägen, medan HANP penetrerar huden via den intercellulära vägen. Detta innebär att omvandling av HA till nanopartiklar, även förändrade
penetrationsvägen. HANP förbättrar även hudpenetrationen genom att den bildar en stark interaktion med biologiska membran via fosfolipid liposomer (Shigefuji och Tokudome, 2020).
Formulering av HA till nanopartiklar visade att HA var närvarande som nanopartiklar när de applicerades på huden, men som en icke-nanopartikulär molekyl efter penetration genom huden. Partikeldiametern och PDI förändrades kraftigt på grund av samexisterande joner. Nanopartiklar kan förstöras av joner i huden och existerar då som icke-nanopartiklar HA. Det upptäcktes även hur en applicering av en emulgerad beredning av HANP ledde till en passiv diffusion av HA genom huden. Det är också intressant hur hudpenetrationen av HANP varierade när olika oljor användes för att bereda emulsionerna (Tokudome et al, 2018).
De ytterligare 20 % som absorberades efter 5 timmar kan vara relaterad till den gradvisa koncentrationskillanden som skapades mellan området under epidermis och den
ackumulerade koncentrationen i självaste epidermis. Med tanke på HA’s hygroskopiska
egenskaper i en lipidrik miljö som epidermis, är det mycket möjligt att lågmolekylvikts HA, på grund av den hydrofoba effekten, bildar sfäriska aggregat av olika storlekar fördelade mellan keratinocyternas intercellulära utrymmen i epidermis. Dessa aggregat skapar en
gradvis koncentrationsskillnad och förbättrar penetrationen av molekylerna över huden. Dessa resultat kan jämföras med studien från Szumala et al (2019), där högmolekylvikts HA bildade aggregat som interagerade med ytaktiva ämnen i nanoemulsionerna. Olika fördelningar av de sfäriska aggregaten observerades bland dermala och epidermala celler med hjälp av konfokal mikroskopi. Med tanke på HA’s förmåga till att absorbera fukt, kan dessa aggregat även bilda
mycket fuktade positivt laddade kanaler över epidermis som kan underlätta transporten av andra aktiva substanser över epidermis och in i dermis (Nashchekina et al, 2017).
Det verkade som att AZA penetrationen genom huden styrs av droppdiffusionskoefficienten och droppstorleken hos nanoemulsionerna, men att effekten av droppstorleken är viktigare än droppdiffusionskoefficienten. I jämförelse mellan hårig och icke-hårig hud, visades att
effekten av droppdiffusionskoefficienten och droppstorleken på den håriga huden är större än för den icke-håriga huden. Därför är droppstorleken hos nanoemulsionen ett kritiskt kriterium för AZA penetration genom epidermis och follikulära vägar (Salimi et al, 2020).
Läkemedelsfrisättningen för PHA hydrogeler minskade med en ökad koncentration av P, detta eftersom en ökad P koncentration leder till en ökning av gelens viskositet, vilket påverkar diffusionen av läkemedlet. Upplösningshastigheten var något högre för AZA och kan bero på polysorbat 60’s effekt som leder till ökad vätbarhet och solubilisering av läkemedlet. Den höga upplösningshastigheten kan bero på att rent läkemedel kan relatera till ökad ytenergi av provet orsakad av nanosering (Tomic et al, 2019).
6.3 Reologi (viskositet)
Låga mängder frisatt HA kan bero på de fysikalkemiska egenskaperna hos dessa system. Det verkade som att skillnaderna i reologiskt beteende (Kupper et al, 2017) påverkade HA-frisättningen. Frisättningen av HA (både hög- och lågmolekylvikt) var lägre för prover med högre viskositet. En hög viskositet hos nanoemulsionen (v/o) kan minska
frisättningshastigheten genom att mekaniskt hindra fri diffusion av HA-molekyler (Szumala et al, 2019). Studien från Salimi et al (2020) visade däremot att viskositeten inte påverkade droppdiffusionskoefficienten. En signifikant korrelation hittades mellan vatten och
oljeprocenten med droppdiffusionskoefficienter. Detta betyder att vatten och olja kan spela en viktig roll i spridningsfasen (Salimi et al, 2020). Denna skillnad i resultat kan bero på
studiernas olika sammansättningar av nanoemulsionerna, då den ena var en v/o emulsion och den andra en o/v emulsion.
Det reologiska beteendet av en gel för kutan administrering kan påverka spridningen och täckningen av formuleringen över huden såväl som uppehållstiden på hudens yta och förbättra biotillgängligheten av läkemedlet. Därför studerades påverkan av P-koncentrationen och typer av AZA på det reologiska beteendet hos PHA-hydrogelen. Viskositeten ökade med ökad koncentration av P för både P hydrogels och PHA hydrogels. Viskositeten hos PHA-hydrogel kan justeras genom att kontrollera tillsatsen av P. De reologiska egenskaperna hos de
undersökta hydrogelsproverna hade dock en liten påverkan på hudpenetrationen, eftersom skillnader i reologisk beteende orsakad av P-koncentrationen inte var korrelerad med skillnader i hudpenetrationen (Tomic et al, 2019).
6.4 Stabilitet
Studien som jämförde den fysikaliska stabiliteten mellan krämer och salvor visade att återfuktande krämer innehållande HA var mycket mer stabila än salvor med HA. Detta fenomen kan förklaras med hjälp av de hygroskopiska egenskaperna hos HA som stabiliserade beredningarna som innehöll stora mängder vatten (både prov A och prov B bestod av 60 % vatten). Detta innebär att ju högre vattenhalten är i en HA-beredning, desto stabilare kan den vara på grund av HA’s hygroskopiska egenskaper. Därför kan de
återfuktande krämerna (prov A och B) var mer lämpliga för att transportera HA vid dermal absorption än salvor (Olejnik et al, 2015).
Nanoemulsionerna (o/v) av AZA visade sig också vara fysiskt stabila under en period av 6 månader utan fasseperation, flockulering eller koalescens under lagring vid olika
6.5 Ytaktiva ämnens inverkan på penetration
Skillnaden i upplösning mellan nanoemulsionerna (v/o) kan bero på vattenlösligheten hos de använda ytaktiva ämnena, eftersom båda nanoemulsionerna hade liknande viskositet, och i HA-MCTG användes bara Span20 som ytaktivt ämne och som inte är vattenlöslig. Däremot användes både Span20 och Tween80 i HA-IPP. Det är förmodligen tillsatsen av Tween 80 som är vattenlöslig som underlättade frisättningen av HA från HA-IPP och förkortade
upplösningshastigheten eftersom den inre fasen är vattenhaltig (Alkrad et al, 2016). Även om HA-MCTG även innehöll DMSO som fungerar både som penetrationsförbättrare,
co-surfaktant och för att förbättra HA’s effekt, hade emulsionen en något större droppstorlek jämfört med HA-IPP vilket också kan ha påverkat resultatet.
Den höga mängden ytaktiva ämnen som är nödvändig för att stabilisera nanoemulsioner, ökar dock den hudirriterande potentialen. Det är därför viktigt att leta efter andra alternativ för att minska koncentrationen av surfaktanter. Dessutom fungerar HA som co-surfaktant i de två nanoemulsionerna genom att dels öka vattenupptaget, utvidga nanoemulsionens existensarea i trefasdiagrammet och dels genom att minska mängden ytaktiva ämnen som krävs för att stabilisera nanoemulsionen (Alkrad et al, 2016).
6.6 Vattenhaltiga beredningar eller emulsioner?
Studien bekräftade att nanoemulsioner faktiskt möjliggör transport av makromolekyler som HA. Det visade sig att 1 % HA, oavsett molekylvikt, transporterades mest effektivt från en v/o nanoemulsion med ett medium innehåll av S/C. När det gäller system med 0,5 %
lågmolekylvikt HA, observerades det att penetrationen minskades med minskad halt av ytaktiva ämnen och ökning av partikelstorlek. Bland de högmolekylvikt HA-baserade
nanoemulsionerna, registrerades den högsta effektiviteten av penetration hos system med 1 % HA och medium/låg halt av S/C (Szumala et al, 2019).
I studien från Salimi et al (2020) användes AZA-laddade nanoemulsioner (o/v) för att få en högre AZA koncentration i folliklarna som är huvudvägen vid aknebehandling.
Nanoemulsionerna ökade AZA penetrationen genom epidermala och follikulära vägar jämfört med en vattenhaltig AZA lösning. Nanoemulsioner med en högre droppdiffusionskoefficient och lägre hydrodynamisk radie, gav en högre AZA penetration. Nanoemulsioner med en högre mängd ytaktiva ämnen ökade AZA’s affinitet för penetration genom den epidermala vägen. Baserat på det faktum att huvudvägen för AZA’s effekt vid aknebehandling är via den follikulära vägen, var nanoemulsionen med en låg mängd ytaktiva ämnen, låg hydrodynamisk radie och hög droppdiffusionskoefficient den optimala nanoemulsionen som ökade AZA’s affinitet via den follikulära vägen (Salimi et al, 2020).
Den ideala viskositeten hos nanoemulsioner som tillhörde newtonska vätskor, gör
applikationen och spridningen av HA på hudytan enkelt jämfört med halvfasta beredningar. Dessutom, tack vare deras små droppstorlekar, låga viskositet och termodynamiska stabilitet, ökar deras förmåga att tränga djupare in i huden. Detta faktum återspeglas av den höga in vitro tillgängligheten jämfört med halvfasta beredningar (Alkrad et al, 2016).
Emellertid gav nanonisering av AZA och dess införlivande i en PHA-komposit termokänslig hydrogel, en förbättrad biotillgänglighet eftersom samma effekt – när det gäller penetration genom stratum corneum – erhölls i jämförelse med en referenskräm som innehöll dubbel AZA-koncentration (20 %). AZA-nanokristallerna av önskvärd storlek kunde framställas med hjälp av låg koncentration av polysorbat 60 och enkel malningsprocess. Gelén som innehöll
15 % P, 1 % HA och 10 % nanokristall AZA suspension kan betraktas som en optimal formulering för dermal applicering, eftersom den visade de reologiska och önskvärda läkemedelsavgivande egenskaperna (Tomic et al, 2019).
7. Slutsats
Slutligen visade nanoformuleringar vara ett effektivt sätt för att förbättra penetrationen av makromolekyler och vattenlösliga ämnen som HA och AZA genom hudbarriären. HANP visade sig penetrera hudbarriären på samma sätt som lipofila substanser, genom den intercellulära vägen. Det visade sig att en lägre koncentration av HA, oavsett molekylvikt, transporterades mest effektivt från en v/o nanoemulsion med ett medium innehåll av S/C. HA stabiliserar även emulsioner tack vare de hygroskopiska egenskaperna. Nanoemulsioner visade sig därför vara en stabil och optimal formulering för god penetration av både HA och AZA, tack vare de lipofila egenskaperna i gemenskap med hudbarriären.
8. Framtida perspektiv
En formulering med god penetration kan ge en högre biotillgänglighet och därmed en förbättrad effekt av läkemedel med kutana administreringssätt. Om detta uppnås kan till exempel orala antibiotikakurer undvikas vid akne och minska risken för utveckling av antibiotikaresistens. Kutana formuleringar är enkla att administrera och tillför en både snabb och lokal effekt vid indikationer såsom smärta, klåda, inflammation och torrhet och är därför ett administreringssätt som bör utvecklas och forskas mer kring.
9. Tack
Jag vill ägna ett stort tack till min handledare Erik Björk för all hans tid, hjälp och
konstruktiva kritik under hela arbetets gång. Jag vill även tacka examinator Göran Alderborn som har besvarat eventuella frågor och funderingar.
10. Referenser
1. Alkrad, J.A., Mrestani, Y., Neubert, R.H.H., 2016. Development and characterization of microemulsions containing hyaluronic acid. European J Pharm Sci. 86:84-90. http://dx.doi.org/10.1016/j.ejps.2016.02.008.
2. Aulton, M.E., Taylor, K.M.G., 2018. Aulton’s Pharmaceutics: The Design and Manufacture of Medicines, femte upplaga. Elsevier, Edinburgh.
3. Barry, B.W., 1987. Mode of action of penetration enhancers in human skin. Journal of Controlled Release. 6:85-97. https://doi.org/10.1016/0168-3659(87)90066-6.
4. Essendoubi, M., Gobinet, C., Reynaud, R., Angiboust, J.F., Manfait, M., et al, 2015. Human skin penetration of hyaluronic acid of different molecular weights as probed by Raman spectroscopy. SkinResTechnol. 22:55-62.
https://doi-org.ezproxy.its.uu.se/10.1111/srt.12228.
5. Kupper, S., Klosowska-Chomiczewska, I., Szumala, P., 2017. Collagen and
hyaluronic acid hydrogel in water-in-oil microemulsion delivery systems. Carbohydr Polym. 175:347-354. http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2017.08.010.
6. Läkemedelsboken, 2017. Hudsjukdomar.
https://lakemedelsboken.se/kapitel/hud/hudsjukdomar.html (citerad 3 februari 2021). 7. Nashchekina, Yu. A., Raydan, M., 2017. Noninvasive penetration of 5 nm hyaluronic acid molecules across the epidermal barrier (in vitro) and its interaction with human skin cells. Skin Res Technol. 24(1):129–134.
https://doi-org.ezproxy.its.uu.se/10.1111/srt.12400.
8. Olejnik, A., Goscianska, J., Zielinska, A., Nowak, I., 2015. Stability determination of the formulations containing hyaluronic acid. IntJ Cosmet Sci. 37(4):401-407.
9. Salimi, A., Zadeh, B.S.M., Godazgari, S., Rahdar, A., 2020. Development and
Evaluation of Azelaic Acid-Loaded Microemulsion for Transfollicular Drug Delivery Through Guinea Pig Skin: A Mechanistic Study. Adv Pharm Bull. 10(2):239-246. https://doi.org/10.34172/apb.2020.028.
10. Shigefuji, M., Tokudome, Y., 2020. Nanoparticulation of hyaluronic acid: A new skin penetration enhancing polyion complex formulation: Mechanism and future potential. Materialia. 14:100879. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2020.117295.
11. Szumala, P., Jungnickel, C., Kozlowska-Tylingo, K., Jacyna, B., Cal, K., 2019. Transdermal transport of collagen and hyaluronic acid using water in oil microemulsion. Int J Pharm. 572:118738.
https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2019.118738.
12. Tokudome, Y., Komi, T., Omata, A., Sekita, M., 2018. A new strategy for the passive skin delivery of nanoparticulate, high molecular weight hyaluronic acid prepared by a polyion complex method. Sci Rep 8:2336. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20805-3.
13. Tomic, I., Juretic M., Jug, M., Pepic, I., Cizmek B.C., et al, 2019. Preparation of in
situ hydrogels loaded with azelaic acid nanocrystals and their dermal application
performance study. Int J Pharm. 563:249-258. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2019.04.016. 14. Wikipedia länk 1:
https://en.wikipedia.org/wiki/Subcutaneous_tissue#/media/File:Skin.png. 15. Wikipedia länk 2:
