Fryst majs – ett risklivsmedel för listerios?
En mikrobiologisk undersökning på förekomsten av Listeriamonocytogenes i fryst
Frozen sweet corn – a high-risk food for listeriosis? A microbiological study of the prevalence of Listeria
monocytogenes in frozen sweet corn
Författare: Linnéa Engström och Moa Hallqvist
Vårterminen 2020
Examensarbete kandidatkurs 15 hp
Huvudområde: Måltidskunskap och värdskap Måltidsekologprogrammet
Restaurang- och hotellhögskolan, Örebro universitet
Handledare: Wilhelm Tham, professor, Restaurang och hotellhögskolan, Örebro universitet
Examinator: Åsa Öström, professor, Restaurang- och hotellhögskolan, Örebro universitet
Kursnamn: Måltidskunskap och värdskap, Examensarbete, kandidatkurs Titel: Fryst majs – ett risklivsmedel för listerios?
Författare: Linnéa Engström och Moa Hallqvist Handledare: Wilhelm Tham
Examinator: Åsa Öström
Sammanfattning
Varje år uppskattas cirka en halv miljon människor drabbas av matförgiftningar i Sverige.
Listeria monocytogenes är en livsmedelsburen patogen bakterie som orsakar sjukdomen
listerios och har varit inblandad i allvarliga matförgiftningsutbrott. Majs är ett livsmedel som har visat sig vara kontaminationskällan till flera utbrott i Europa och kan därmed vara ett potentiellt risklivsmedel för listerios. Utifrån detta var det intressant att undersöka
förekomsten och halterna av L. monocytogenes i frysta majskorn från tio olika fabrikat på marknaden. Metod nr 136 från NMKL (2007) användes för att detektera och kvantifiera halten av L. monocytogenes. Resultaten visade att L. monocytogenes förekom i fyra av tio prover i halter under 10 cfu/g samt under 100 cfu/g. Detta indikerar på att L. monocytogenes förekommer i fryst majs, men som det ser ut idag, i en godkänd mängd för att kunna fortsätta säljas på marknaden. Konsumenter äter fryst majs utan upphettning och majs har dessutom visats gynna tillväxten av L. monocytogenes i tidigare studier. Slutsatsen var att de uppmätta halterna kan utgöra en hälsorisk om livsmedlet felhanteras och därmed bör ses som
risklivsmedel.
Nyckelord: Livsmedelshygien, kontamination, utbrott, ätfärdiga livsmedel
Abstract
It is estimated that about a half million people suffer from food poisoning every year in Sweden. Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that causes the disease listeriosis and have been involved in serious outbreaks of food poisoning. Sweet corn has been shown to
be the contamination source in several outbreaks in Europe and could therefore be a potential high-risk food for listeriosis. Therefore, it was interesting to investigate the presence and levels of L. monocytogenes in frozen sweet corn from ten different manufactures on the market. Method no 136 from NMKL (2007) was used for detection and enumeration of L.
monocytogenes. The result showed that L. monocytogenes was present in four out of ten
samples in levels below 10 cfu/g and below 100 cfu/g. This indicated that L. monocytogenes is present in frozen corn at the market, but as it is today, in approved levels to be able to continue selling the product on the market. The conclusion was that the enumerated levels can make up a health hazard if the foodstuff is handled wrong, and that frozen blanched sweet corn therefore should be seen as a risk food because it has been shown to support the growth of L. monocytogenes and that consumers eat the corn without proper cooking.
Förord
Vi vill rikta ett stort tack till vår handledare Wilhelm Tham för stort engagemang och god handledning genom hela arbetets gång. Den entusiasm som visats för studiens ämnesområde delar Vi med Dig och har givit oss motivation och glädje i arbetsprocessen. Vi vill även tacka vår förgranskare Marie-Louise Danielsson-Tham för givande kommentarer och synpunkter på uppsatsens innehåll. Slutligen vill vi tacka alla deltagare i grupphandledningar och seminarier för den konstruktiva respons som varit till stor hjälp. Inte minst vill vi som författare till studien tacka varandra för ett mycket gott samarbete.
Innehållsförteckning
Inledning ... 1 Bakgrund ... 1 Livsmedelshygien ... 2 Listeria monocytogenes ... 3 Sjukdomen listerios ... 4 Listeriosutbrott orsakade av majs ... 5 Majs som gröda och livsmedel ... 6 Kontaminering av L. monocytogenes i livsmedel ... 6 Reglering av L. monocytogenes i livsmedel ... 8 Syfte ... 8 Kunskapsbidrag ... 9 Metod och material ... 9 Metodval ... 9 Material ... 10 Urval ... 10 Genomförande ... 12 Hantering av prover ... 12 Detektering ... 12 Kvantifiering ... 14 Konfirmering ... 16Dataanalys ... 17 Kvalitativ analys ... 17 Kvantitativ analys ... 18 Litteratursökning ... 18 Etiska beaktanden ... 19 Resultat ... 20 Diskussion ... 21 Resultatdiskussion ... 22 Gränsvärden för L. monocytogenes ... 22 Hantering av fryst majs ... 23 Kontaminationsrisker i livsmedelskedjan ... 25 Metod- och materialdiskussion ... 26 Slutsatser ... 27 Praktisk användning och vidare forskning ... 28 Referenslista ... 29 Bilagor
1
Inledning
Varje år uppskattas cirka en halv miljon människor drabbas av matförgiftningar i Sverige (Livsmedelsverket, 2020b). Vanligt är att en matförgiftning orsakar illamående, diarré
och/eller kräkningar och går över inom några dagar till en vecka(ibid.). Det förekommer även matförgiftningar som ger upphov till betydligt allvarligare sjukdomstillstånd. Listeria
monocytogenes är en av de bakterierna som varit inblandad i de mer allvarliga
matförgiftningsutbrotten (Folkhälsomyndigheten, 2020). Bakterien är livsmedelsburen och orsakar listerios, en sjukdom som trots behandling har en dödlighet på 20–30 % hos
människor som tillhör riskgruppen för sjukdomen (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 124). Trots att de mest kända risklivsmedlen är väldefinierade har förekomsten av invasiv listerios ökat i Europa och i Sverige sedan 1980-talet (EFSA, 2018a, s. 67; Folkhälsomyndigheten, 2020). Listeria återfinns oftast i ätfärdiga köttprodukter och fiskprodukter samt opastöriserade ostar (EFSA, 2018a, s. 68). Flera risklivsmedel är identifierade men då listeriainfektioner ökar är det möjligt att det kan finnas fler livsmedelsgrupper som är oupptäckta bärare av L.
monocytogenes. I Italien 1997 skedde ett omfattande matförgiftningsutbrott som berodde på
tillväxten av L. monocytogenes i majs (Aureli, Fiorucci, Caroli, Marchiaro, Novara, Leone & Salmaso, 2000). Fler fall av listerios har därefter inträffat där den gemensamma
kontaminationskällan visats vara fryst majs (EFSA & ECDC, 2018). Med detta som grund kan majs därför anses vara ett potentiellt risklivsmedel för listerios. I denna laborativa studie kommer förekomsten av L. monocytogenes i fryst majs från tio olika fabrikat att undersökas.
Bakgrund
I detta avsnitt redogörs för det område som studien behandlar. Inledningsvis beskrivs livsmedelshygienens betydelse för måltiden och dess säkerhet. Därefter presenteras den livsmedelsburna bakterien L. monocytogenes och sjukdomen listerios. Vidare kommer frysta blancherade majskorn som möjligt risklivsmedel för listerios behandlas i förhållande till tidigare utbrott. Tillverkningsprocessen av fryst majs och möjliga kontaminationsvägar för L.
2
monocytogenes i livsmedel beskrivs. Slutligen lyfts bestämmelser och gränsvärden för
bakteriens förekomst i livsmedel.
Livsmedelshygien
Inom forskning, såväl som utbildning i ämnet måltidskunskap och värdskap kan modellen The
Five Aspects Meal Model (FAMM) användas för att utvärdera en måltidsupplevelse.
Modellen består av fem begrepp: rummet, mötet, produkten, styrsystemet och stämningen. Tillsammans verbaliserar dessa komplexiteten i en komplett måltidsupplevelse (Gustafsson, Öström, Johansson & Mossberg, 2006). Samtliga begrepp har på senare år utökats med dimensionen livsmedelshygien då livsmedelssäkerheten är viktig att ta i beaktande vid såväl produktion som hantering av mat (Danielsson-Tham, u.å. a). Vidare är det
livsmedelsföretagen som bär ansvar för att leverera säkra livsmedel (Livsmedelsverket, 2020c).
För att ta reda på ett livsmedels mikrobiella kvalitet såsom dess hållbarhet, produktionshygien och matförgiftningsrisk görs mikrobiologiska undersökningar (Danielsson-Tham, u.å. a). Dessa utförs bland annat för att se om ett livsmedel innehåller patogena bakterier. Vidare finns myndighetsfastställda gränsvärden för hur mycket patogena bakterier av en viss typ som ett livsmedel får innehålla för att säkerhetskraven skall uppfyllas (EG 2073/2005). L.
monocytogenes är ett exempel på en bakterie som inte får överstiga ett visst gränsvärde. Dessa
gränsvärden är satta för specifikt ätfärdiga livsmedel eftersom dessa kan utgöra en mikrobiell risk (ibid.).
Definitionen av ätfärdiga livsmedel är inte helt klarlagd och kan avse alltifrån råa till tillredda livsmedel som kan konsumeras utan vidare tillagning (Luber et al. 2011, s. 1539).
EU-kommissionens definition av ett ätfärdigt livsmedel avser livsmedel som producenten eller tillverkaren påstår ska ätas direkt utan upphettning eller vidare bakteriedödande behandling såsom exempelvis kokning (EG 2073/2005, s. 3). Luber et al. (2011, s. 1539) menar att en tydligare definition av ätfärdiga livsmedel krävs för att förtydliga för konsumenter vilka
3
livsmedel som är säkra för direkt konsumtion och vilka livsmedel som bör tillagas innan förtäring (Luber et al., 2011, s. 1539).
Listeria monocytogenes
Listeria är ett genus av bakterier och innefattar både patogena och icke-patogena arter (Tham
& Danielsson-Tham, 2014, s. 124). En av de patogena arterna är L. monocytogenes vilken kan orsaka allvarliga sjukdomstillstånd hos både människor och djur (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 125). Det är en tålig bakterie vilket innebär att den kan överleva och tillväxa i
varierande miljöer. Den optimala tillväxttemperaturen för L. monocytogenes är 37 ºC men den förökar sig redan från cirka 0 ºC (Livsmedelsverket, 2007, s. 25). Den tål salthalter upp till 10 %, låg vattenaktivitet och överlever i basiska så väl som i sura miljöer (pH 4,5–9)
(Livsmedelsverket, 2007, s. 25). L. monocytogenes är fakultativt anaerob och kan därför föröka sig i en atmosfär både med och utan syre. Den överlever frysning och dör vid pastörisering och kokning (Rhodes, 2009, s. 358).
L. monocytogenes utgör på grund av dess egenskaper en livsmedelshygienisk risk då den till
skillnad från många andra patogena bakterier kan tillväxa i kylskåpstemperaturer samt i vakuumförpackade livsmedel. Livsmedel som äts utan upphettning i kombination med att de förvaras länge i kylskåp kan vara risklivsmedel. Ett exempel är färdiglagade rätter med lång hållbarhet (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 133). Vanliga risklivsmedel för L.
monocytogenes är ätfärdiga fiskprodukter, färdiga sallader, ätfärdiga köttprodukter, mjuka
dessertostar samt frukt och grönsaker (EFSA, 2018a, s. 68). Även groddar har visats vara ett risklivsmedel för L. monocytogenes (Cauchon, Hitchins & Smiley, 2017, s. 40).
Tillväxten av L. monocytogenes i ett livsmedel beror på livsmedlets egenskaper där faktorer som pH, vattenaktivitet och temperatur spelar in (Zhu, Gooneratne, & Hussain, 2017, s. 4; Hunt, Blanc, Álvarez-Ordóñez & Jordan, Hunt, Lourenco & Pennone, 2018, s. 2). Utifrån dessa faktorer går det till viss del att förutspå en potentiell tillväxt av bakterien i ett specifikt livsmedel. Däremot behöver experimentella mikrobiella studier utföras för att bestämma den
4
faktiska tillväxten i ett livsmedel (Hunt et al., 2018, s. 4). En metod för att förhindra tillväxt av L. monocytogenes i livsmedel är frysning (Perera et al., 2015, s. 46; Kataoka, Wang, Elliot, Whiting & Hayman, 2017, s. 447). Som ovan nämnt överlever bakterien frysning men kan ej tillväxa vid så låga temperaturer. När det frysta livsmedlet tinas börjar dock en tillväxt av bakterien ske (Perera et al., 2015, s. 46).
Sjukdomen listerios
L. monocytogenes orsakar sjukdomen listerios och den huvudsakliga smittvägen är via
kontaminerade livsmedel (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 128). Infektionen är invasiv eller non-invasiv (Rhodes et al, 2009, s. 358; EFSA, 2013, s. 86). Non-invasiv listerios ger gastrointestinala symptom och feber och inkubationstiden är ca 24 h (Aureli et al, 2000, s. 1240). Invasiv listerios ger upphov till allvarliga sjukdomstillstånd då den orsakar sepsis och hjärnhinneinflammation (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 129; Perera, Abuladze, Li, Woolston & Sulakvelidze, 2015, s. 42; Jordan et al., 2018, s. 106). Hos gravida kvinnor kan den orsaka fosterdöd och spontanabort (Ibid.). Inkubationstiden för invasiv listerios kan vara mycket varierande, från 2 till 88 dagar efter konsumtion av ett kontaminerat livsmedel (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 129). Infektionsdosen för listerios har registrerats vara från 100 cfu/gram livsmedel (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 130).
Bakterien tar sig via tarmväggens celler in i blodomloppet (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 128). Hos individer med ett normalt fungerande immunsystem dödas bakterien av vita blodkroppar (ibid.). Därför är det sällsynt att personer som inte tillhör riskgrupperna drabbas av sjukdomen (ibid.). Till riskgruppen hör äldre personer, gravida kvinnor, foster och
spädbarn samt individer som på grund av underliggande sjukdom har ett nedsatt
immunförsvar (EFSA, 2013, s. 86; Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 124; EFSA, 2018a, s. 83). Sjukdomsfall av invasiv listerios är relativt sällsynta men mycket allvarliga då
dödligheten, trots behandling är 20–30 % (Rhoades, Duffy & Koutsoumanis, 2009, s. 358; Perera et al. 2015, s. 42, Jordan et al., 2018, s. 106, Hunt et al., 2018, s. 1).
5
Listeriosutbrott orsakade av majs
Ett livsmedel som misstänks vara orsaken till utbrott av listerios är majs. År 1997 inträffade ett extensivt utbrott av listerios i Italien orsakat av L. monocytogenes. Totalt 1566
grundskoleelever, pedagoger och universitetsstudenter drabbades av gastrointestinala symptom samt feber (Aureli et al., 2000, s. 1236). Man fann att en sallad bestående av majs och tonfisk innehöll höga halter av L. monocytogenes, mer än 106 cfu/gram livsmedel (Aureli et al., 2000, s. 1239). Oöppnade konservburkar med majs från samma varusändning som använts av cateringverksamheten genomgick mikrobiologisk undersökning, men visade sig var sterila (ibid.). När den konserverade majsen i ett experiment sedan inokulerades med L.
monocytogenes skedde dock en kraftig tillväxt i majsen (ibid.). Efter tio timmar i
rumstemperatur (25 ºC) tillväxte L. monocytogenes till en halt på över 106 cfu/gram livsmedel. En korskontamination under tillredningen av majs- och tonfisksalladen kan således ha varit orsaken till utbrottet (Aureli et al., 2000, s 1240)
Ett utbrott av listerios som orsakats av specifikt fryst majs finns dokumenterat (EFSA & ECDC, 2018). Mellan 2015 och 2018 har 47 personer som insjuknat i listerios kunnat kopplats till utbrottet genom att en hel-genomsekvensering av Listeria-bakteriens arvsmassa genomförts (EFSA & ECDC, 2018, s. 5). Hel-genomsekvensering är en molekylärbiologisk metod där bakteriens DNA kartläggs (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 25). Detta gör det möjligt att koppla sjukdomsfall till varandra samt identifiera kontaminationskällan (EFSA & ECDC, 2018, s. 1). L. monocytogenes återfanns i fryst majs och i fryst grönsaksmix
innehållande majs. Kontaminationen spårades till två livsmedelsfabriker som hanterar och fryser livsmedel, en i Ungern och en i Frankrike (ibid). Fryst majs som inokulerats med L.
monocytogenes har visat sig främja tillväxt av bakterien i temperaturer mellan 4 och 20 ºC
(Kataoka et al., 2017, s 452). Det har även visats att tillväxten av L. monocytogenes börjar tidigare och går fortare ju högre temperaturer majsen förvaras i (Kataoka et al., 2017, s 452). Ovan nämnda utbrott och studier visar att majs därmed kan vara ett bra tillväxtmedium för L.
6
Majs som gröda och livsmedel
Majs är en art inom familjen gräs och är en kulturväxt. Växten har odlats i runt 10 000 år i Mexiko och Sydamerika där domesticeringen av majs troligen fick sin början. För cirka 300 år sedan ökade antalet odlade varianter och under 1500-talet spreds grödan till Afrika, Europa, Indien och delar av Asien (Granström, Ohlsson, Hysing & Erlander, 2020). Majs odlas i varierande klimat, allt från svalare klimat till tropiska temperaturer (FAO, 2020). Mellan 2004–2013 var den genomsnittliga världsproduktionen 822 miljoner ton per år (Granström et al., 2020). År 2003 stod majs, tillsammans med ris och vete, för åtminstone 30 % av det totala energiintaget i 94 utvecklingsländer (Lunds universitet, 2020). Majsen är därmed en av de viktigaste och en av de mest odlade grödorna i världen (FAO, 2020). Majs som livsmedel har kommit att bli en stapelvara i många länder och matkulturer i form av brödsäd, mjölprodukter, majsstärkelse, olja, sirap och flingor och även som färsk, konserverad eller fryst råvara.
Fryst majs säljs i form av styckfrysta majskorn och kolvar. Tillverkningsprocessen för frysta grönsaker följer generellt samma produktionsprocess men variera mellan
livsmedelsanläggningar (EFSA, 2018b, s. 7). Grönsakerna skördas och fraktas vanligen i en container till livsmedelsanläggningen (EFSA, 2018b, s. 9). Därefter genomgår grönsakerna förberedande behandlingar såsom sortering, tvättning och rensning från insekter och blad (ibid.). Grönsakerna blancheras sedan, vilket innebär att livsmedlet upphettas i vatten eller ånga (EFSA, 2018b, s. 11). Temperatur och tid för denna värmebehandling kan variera beroende på livsmedel (ibid.). Majs behandlas vanligen vid 96 ºC i 100 sekunder (EFSA, 2018b, s. 11). Efter blanchering kyls grönsaken ner med vatten. Vid produktion av frysta majskorn separeras majskornen från kolven. Denna bearbetning av råvaran kan ske antingen före och efter blanchering (EFSA, 2018b, s. 12). När grönsaken genomgått de förberedande behandlingarna fryses den snabbt till -18 ºC och förpackas därefter i olika
förpackningsstorlekar beroende på användningsområde (EFSA, 2018b, s. 12).
Kontaminering av L. monocytogenes i livsmedel
Livsmedel kan kontamineras av L. monocytogenes i olika steg i livsmedelskedjan. Kontaminering kan till exempel ske under primärproduktionen då L. monocytogenes är naturligt förekommande i både naturen och i jordbruksmiljöer. Kontaminationskällor för
7
livsmedel kan vara jord, vatten, avlopp, ensilage eller avföring från människor och djur (Livsmedelsverket, 2007, s. 25; EFSA & ECDC, 2013, s. 86; Zhu et al., 2017, s. 6). I en studie av Kljujev et al. (2018, s. 27) undersöktes förekomsten av Listeria generellt samt L.
monocytogenes i obehandlade, råa grönsaker odlade i växthus och på fält. Listeria påvisades i
25 % av proverna varav ett av dem innehöll L. monocytogenes (ibid.). Listeria förekom i växthusodlade grönsaker men förekom i större utsträckning i de grönsaker som odlats på fält (ibid.). Detta visade att grönsaker kan bli kontaminerade redan i primärproduktionen via jorden. Ännu en studie har påvisat att L. monocytogenes etablerat sig i grödor under primärproduktionen där kontaminationen skett via bevattning. I en studie av Chitarra,
Decastelli, Garibaldi och Gullino (2014) bevattnades olika sorters sallad med vatten som var kontaminerat med L. monocytogenes. Studien visade att L. monocytogenes togs upp i
grönsakernas vävnader och kunde påvisas där i upp till 80 dagar efter kontamineringen (Chitarra et al., 2014, s. 142).
Livsmedel kan även kontamineras under förädlingen. Som tidigare nämnts är L.
monocytogenes en härdig bakterie som tolererar varierande miljöer. På grund av detta har
bakterien en förmåga att etablera sig i livsmedelsanläggningar. Bakterierna är svåra att få bort från anläggningarna när de väl etablerat sig (Livsmedelsverket, 2007, s. 25; Camargo,
Woodward, Call & Nero, 2017, s. 623; Jordan et al., 2018, s. 106). Detta beror på att L.
monocytogenes bildar biofilmer på ytor som golv och avlopp men även på verktyg och
utensilier (Camargo et al., 2017, s. 623). En biofilm bildas när mikroorganismer tillsammans bygger upp komplexa strukturer och koloniserar fasta ytor (Donlan & Costerton, 2002, s. 168). När biofilmer är etablerade kan bakterien överleva på ytor i flera år (Camargo et al., 2017, s. 623; Jordan et al., 2018, s. 106). När L. monocytogenes väl är etablerad i en livsmedelsanläggning kan den därmed kontaminera de livsmedel som hanteras i lokalerna (Livsmedelsverket, 2007, s 25; Jordan et al., 2018, s. 106).
Det är möjligt att L. monocytogenes överlever under produktionen av fryst majs. Vidare finns det metoder som är avsedda för att avdöda eventuell kontaminering som kan ha skett under primärproduktionen såväl som i förädlingen. Bland annat genomgår grönsakerna blanchering vilket är ett viktigt steg för livsmedelssäkerheten då det kan minska mängden
8
mikroorganismer i livsmedlet (EFSA, 2018b, s. 11). Däremot kan inte metoden förväntas att helt eliminera patogena bakterier såsom L. monocytogenes (ibid.). Således är det möjligt att en eventuell kontamination från primärproduktionen överlever detta steg. Även efter blanchering är kontamination möjlig då förpackning av livsmedlet sker först efter infrysning. Det är exempelvis viktigt att nedkylning efter värmebehandlingen sker snabbt och att kylvattnet är rent för att undvika efterkontaminering och tillväxt av patogena bakterier (EFSA, 2018b, s. 11).
Reglering av L. monocytogenes i livsmedel
Det finns myndighetsfastställda gränsvärden för hur mycket L. monocytogenes som ätfärdiga livsmedel får innehålla (EG 2073/2005). Det får ej förekomma detekterbara halter av L.
monocytogenes i livsmedel avsedda för spädbarn eller speciella medicinska ändamål (ibid).
Det får heller inte förekomma i livsmedel som gynnar tillväxten av L. monocytogenes vid det tillfälle då det lämnar livsmedelsföretaget (ibid). I övriga ätfärdiga livsmedel får halten av L.
monocytogenes ej överstiga 100 cfu/g livsmedel vid sista förbrukningsdag (EFSA, 2020, s. 4;
EG 2073/2005, s. 10). EU-kommissionen anser att frysta blancherade grönsaker bör bedömas som ätfärdiga livsmedel då de är möjliga att konsumeras utan vidare upphettning
(Livsmedelsverket, 2018; EU-kommissionen, 2018). EFSA (2020, s. 4) menar att en halt av L.
monocytogenes under 10 cfu/g livsmedel skulle vara acceptabelt i frysta blancherade
grönsaker under förutsättningen att de tillagas genom att följa de angivna
tillagningsinstruktionerna. Fryst majs som kontaminerats med L. monocytogenes kan dock utgöra en hälsorisk även i låga doser (under 10 cfu/g livsmedel) om livsmedlet ej tillagas ordentligt (EFSA & ECDC, 2018, s. 2; EFSA, 2020, s. 4). Frysta blancherade grönsaker som används utan vidare behandling bör därmed ej innehålla upptäckbara halter av L.
monocytogenes (EFSA, 2020, s. 4).
Syfte
Syftet med studien är att undersöka förekomsten av L. monocytogenes i frysta majskorn från tio olika fabrikat på marknaden och vid förekoms fastställa i vilka mängder.
9
Kunskapsbidrag
Styrsystemet som är ett av de fem begreppen i FAMM-modellen har som uppgift att föra samman övriga områden i modellen och skapa ett ramverk för det som utgör en måltid (Gustafsson et al., 2006). Inom begreppet styrsystemet ryms bland annat livsmedelshygien som viktig bidragande faktor till en god måltidsupplevelse då det bland annat behandlar livsmedelssäkerhet. Denna aspekt hamnar ofta i bakgrunden men brister denna del kan hela måltidsupplevelsen upplevas försämrad (Walter, Edwardsson & Öström, 2010, s. 249, 252). Denna studie bidrar därmed med kunskap till ämnet Måltidskunskap och värdskap genom att påpeka vikten av god livsmedelshygien och livsmedelssäkerhet vid hantering av livsmedel för att en måltid skall bli så bra som möjligt. Den föreliggande studien undersöker huruvida fryst majs kan vara en ny tänkbar smittkälla för L. monocytogenes. Genom att definiera nya tänkbara risklivsmedel kan studien bidra till att öka livsmedelssäkerheten i samhället genom att sprida kunskap om hur specifika livsmedel bland annat bör hanteras och regleras. Studien bidrar även med allmän kunskap om fryst majs.
Metod och material
I detta avsnitt presenteras val av metod, material, urval, genomförande samt dataanalys. Därefter kommer även litteratursökning och etiska beaktanden för studien att belysas.
Metodval
Till den föreliggande studien valdes en laborativ metod. För att påvisa förekomst och halt av
L. monocytogenes i fryst majs användes metoden Nr 136 från nordisk metodikkommitté för
Livsmedel (NMKL, 2007). Internationellt finns olika metoder för att påvisa L. monocytogenes men denna metod valdes då det var standardmetoden som användes i Norden. Metoden är granskad och utgår från den internationella standarden ISO-11290 (NMKL, 2007, s. 1). Metod Nr 136 från NMKL innefattar både kvantitativa och kvalitativa analyser (NMKL, 2007). Den kvalitativa analysen utgörs av detektering av L. monocytogenes, där det undersöks
10
om bakterien förekommer eller ej. I den kvantitativa analysen, kvantifieringen, mäts halterna av L. monocytogenes.
Material
Laborationerna som genomfördes utgick från NMKL (2007) standardmetod nr 136 för detektion och kvantifiering av L. monocytogenes i livsmedel. Metoden anpassades med viss avvikelse avseende de substrat som användes för bakterieodling. Substrat, även kallat odlingsmedium, används för att odla, isolera och identifiera bakterier. På odlingsmedier tillväxer enskilda bakterier genom att dela sig och på så sätt öka i antal och bilda kolonier. Den analys och bedömning som görs utifrån de kolonier som tillväxt kallas för avläsning. Enligt metoden nr 136 skall två olika selektiva odlingsmedier för L. monocytogenes användas. Ett selektivt odlingsmedium är utformat för att gynna tillväxten av en specifik bakterie och hämma tillväxten av oönskade bakterier. I föreliggande studie användes istället ett selektivt medium, Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) samt ett icke selektivt medium, blodagar. ALOA är ett kommersiellt odlingsmedium som är lämpligt att använda för att påvisa Listeria (NMKL, 2007, s. 5). Blodagar är ett substrat för bakterieodling och
innehåller näringsextrakt och blod (NMKL, 2007, s. 8).
Apparater som användes under laborationen var två inkubatorer av modell Termaks™ T 1056 U, en vortex-apparat av modell Vortex-Genie™ K-550-GE samt stomacher av modell
Stomacher® 400 circulator. Laborationsmaterialet som användes var sterila racklor, skedar, saxar och glaspippetter (1 ml). Det användes även peleusboll, provrör och provrörsställ samt stomacherpåsar.
Urval
I denna studie analyserades frysta majskorn från tio olika fabrikat för förekomst av L.
monocytogenes. De tio fabrikaten inhandlades från fem olika livsmedelsbutiker i Sverige.
Kraven var att förpackningarna enbart skulle innehålla majskorn och inga andra grönsaker. Majskornen hade sitt ursprung från olika europeiska länder. Fyra fabrikat var från Ungern, ett från Polen, ett från Belgien, ett från Spanien och tre av fabrikaten angav två eller tre
11
europeiska länder som ursprungsland (Tabell 1). Majskornen från de olika fabrikaten anonymiserades och benämndes med siffror 1–10.
Tabell 1. Information som framgår på respektive provs förpackning.
Prov Ingredienser Rekommenderad
tillagning
Förvaring Ursprung
1 Förvällda
majskorn Kokas Djupfryst vara, förvaras vid -18 °C eller lägre Bör ej frysas igen efter upptining
Spanien, Frankrike, Ungern
2 Förvällda majskorn
Kokas I frysutrymme (-18 °C eller kallare) Bör ej frysas igen efter upptining
Frankrike, Kroatien, Serbien
3. Förvällda majskorn
Kokas I frysutrymme (-18 °C eller kallare) Bör ej frysas igen efter upptining
Odlad i Ungern.
4 Majskorn Kokas Tina inte
majskornen innan tillagning.
I frysutrymme (-18 °C eller kallare). Bör ej frysas igen efter upptining
Odlade i Spanien Packad i Spanien
5 Majskorn Kokas I frysutrymme (-18 °C eller kallare). Bör ej frysas igen efter upptining
Odlad i Ungern/ Österrike Producerad i Ungern 6 Förvällda
majskorn Kokas Förvara i -18 °C eller kallare Odlad och packad i polen 7 Majskorn från
majskolvar
Kokas Vid -18 °C eller kallare Ungern
8 Blancherad söt majs
Kokas
Bör ej tinas före tillagning
I frysutrymme (-18°C eller kallare) eller i kylskåp 1 dygn
12 9 Förvällda majskorn Kokas För bästa resultat tillagas majsen djupfrysta.
Djupfryst - 18 °C eller kallare. Bör ej
frysas om efter upptining Ungern
10 Majs Kokas
Produkten måste värmas upp före användning
Förvara i kylskåp + 6 °C i 1 dygn Frysfack - 6 °C i 4 dygn
Frysfack - 12 °C i 3 veckor Frysfack -18 °C till bäst före datum
Tillverkad i Belgien
Genomförande
I detta avsnitt presenteras genomförandet av laborationerna i kronologisk ordning. Här redogörs för hanteringen av prover, genomförandet av detektering, kvantifiering och konfirmering. Analyserna av proverna utfördes i två omgångar, prov 1–5 undersöktes den första veckan av laborationsperioden och prov 6–10 undersöktes den andra veckan.
Hantering av prover
De olika majsfabrikaten inhandlades och förvarades därefter frysta vid temperaturen -18 °C fram till dagen då analyserna inleddes. Under transport till det livsmedelsmikrobiologiska laboratoriet vid Restaurang- och hotellhögskolan Grythyttan behöll majskornen en temperatur lägre än -2 °C. Detta för att eliminera risken att eventuell upptining skulle påverka resultaten. Efter provtagning förvarades förpackningarna med majs i laboratoriets frys som höll
temperaturen -20 °C. För att undvika korskontaminering proverna emellan vidtogs stor noggrannhet vid laborationerna. Under samtliga moment användes sterila redskap för att undvika korskontamination.
Detektering
Genomförandet av detekteringen av L. monocytogenes i den frysta majsen innebar att provet först anrikades för att eventuella L. monocytogenes-bakterier skulle tillväxa och därmed öka i antal. Därefter odlades provet på fast substrat för att möjliggöra identifiering av eventuella L.
13
monocytogenes. Genom anrikning av bakterien blev L. monocytogenes lättare att upptäcka.
Anrikningen utfördes i två steg, en primär anrikning och en sekundär anrikning. Nedan
presenteras tillvägagångssättet för anrikning och odling i ett flödesschema som ger en översikt för processen (Figur 1). För att anrika L. monocytogenes användes buljong som stimulerade tillväxten av L. monocytogenes samt hämmade tillväxten av andra, konkurrerande bakterier. I den primära anrikningen användes Half-Fraser-buljong och i den sekundära anrikningen användes Whole-Fraser-buljong. Dessa buljonger innehöll antibiotika som hämmade
tillväxten av andra bakterier vilket gjorde att L. monocytogenes kunde tillväxa med minskad konkurrens.
Figur 1. Flödesschema för processerna för primär respektive sekundär anrikning.
Den primära anrikningen gjordes genom att blanda majs med Half-Fraser-buljong.
Inledningsvis vägdes 25 g majs upp i en stomacher-påse, med en noggrannhet på ± 0,25 g. I stomacher-påsen adderades därefter 225 ml Half-Fraser buljong. Half-Fraser förvärmdes i inkubator vid 37 °C i 30 minuter innan den tillsattes i provet eftersom rekommenderad temperatur för buljongen är 30–37 °C vid användning (NMKL, 2007, s. 10). Innehållet (majs
14
och Half-Fraser-buljongen) homogeniserades därefter i en stomacher i 120 sekunder (30 sekunder i fyra upprepningar). Påsen med det homogeniserade innehållet, suspensionen, inkuberades vid 30 °C i 24h.
Den sekundära anrikningen gjordes genom att göra en andra anrikning utifrån den primära anrikningen. Det överfördes 0,1 ml från den primära anrikningskulturen till ett provrör innehållande 10 ml av Whole-Fraser-buljong. Detta gjordes med pipett och peleusboll. Provrören innehållande Whole-Fraser-buljong förvärmdes i vattenbad i ca 30 minuter innan den primära anrikningskulturen tillsattes. Detta gjordes för att bakterierna inte skulle stressas av en för kall temperatur. Den sekundära anrikningen inkuberades vid 37°C i 48 h. Proverna blandades med en vortex-apparat både före och efter inkubering för att innehållet skulle bli jämnt fördelat provrören.
Suspensionerna från den primära och den sekundära anrikningen sattes på blodagar-platta samt ALOA-platta. Detta gjordes för att kunna isolera och identifiera kolonier av L.
monocytogenes. Genom pipettering överfördes 0,1 ml av respektive suspension till
ALOA-platta och blodagar-ALOA-platta. Suspensionen spreds ut över ytan på ALOA-plattan med en rackla.
Plattorna inkuberades upp och ner i plastpåse vid 37 °C i 24 h, varpå en preliminär avläsning av plattorna utfördes. Detta för att undersöka eventuell förekomst av L. monocytogenes. I de fall där typiska kolonier ej kunde observeras efter 24 h inkuberades respektive agarplatta under ytterligare 24 h inför en andra, slutlig avläsning. Avläsningen behandlas under dataanalys.
Kvantifiering
En kvantifiering utfördes för att uppskatta halten av L. monocytogenes i majsen.
Kvantifieringen innefattade spädning av livsmedlet samt bakterieodling utifrån spädningarna. Spädningarna gjordes för att det på plattorna skulle bli möjligt att räkna enskilda kolonier. Antalet spädningar som gjordes berodde på den mängd bakterier som majsen förväntades innehålla (Danielsson-Tham, u.å. b). Då L. monocytogenes förväntades förekomma i låga doser gjordes tre spädningar som möjliggjorde detektering av halter från 10 cfu/g till 10 000
15
cfu/g livsmedel (Tabell 2). Kvantifieringen för prov 1–5 utfördes på de fabrikat som utifrån den primära anrikningen i Half-Fraser-buljong visat på förekomst av L. monocytogenes. För prov 6–10 utfördes kvantifieringen parallellt med anrikningen för tidsbesparing.
Inför spädningen förvärmdes spädningsvätskan (fysiologisk koksaltlösning) i vattenbad för att bakterien inte skulle bli stressad av en för kall temperatur. För att späda provet placerades 10 g prov fryst majs (med en noggrannhet på ± 0,25 g) och 90 ml spädningsvätska i en
stomacher-påse. Detta gjordes med sterila skedar. Därefter homogeniserades provet i 120 sekunder i en stomacher (30 sekunder med fyra upprepningar). Denna suspension utgjorde spädning 1. Proverna späddes därefter i 10-potenser enligt en spädningsserie där 1 ml
provsuspension överfördes till 9 ml spädningsvätska. Med pipett och peleusboll överfördes 1 ml från spädning 1 till ett provrör med 9 ml spädningsvätska. Detta utgjorde spädning 2. På samma sätt överfördes 1 ml från spädning 2 till spädning 3 (Figur 2). Spädning 1 sparades och förvarades i kylskåp ifall något fel skulle inträffa och ett omprov skulle bli nödvändigt.
Figur 2. Spädningsserie för mikrobiologisk undersökning.
Nästa steg i kvantifieringen innebar odling av spädningarna för att få isolerade kolonier och på så vis kunna räkna antalet kolonier. Detektionsgränsen avgjordes utifrån vilken spädning samt vilken mängd av spädningen som sattes på plattorna (Tabell 2). Med detektionsgräns menas vilken mängd bakterier som kan upptäckas. Från varje spädning spreds 0,1 ml på en blodagar-platta och 0,1 ml på en ALOA-platta med en rackla. Det sattes även 1 ml från spädning 1, vilket sänkte detektionsgränsen till 10 cfu/g livsmedel. Då 1 ml är för stor mängd att ytsprida på en platta fördelades 0,5 ml på två plattor. Proverna racklades ut på blod-platta
16
och ALOA-platta varpå de inkuberades vid 37 °C i 24 h. Preliminär avläsning utfördes och därefter inkuberades proverna i ytterligare 24 h.
Tabell 2. Detektionsgränser utifrån mängd spädning som odlas på agarplatta.
Mängd prov Spädning 1 Spädning 2 Spädning 3
0,1 ml 100 cfu/g 1000 cfu/g 10 000 cfu/g
1 ml 10 cfu/g
Konfirmering
För att bekräfta misstänkta kolonier av L. monocytogenes renströks kolonierna på blodagar-platta för att få en renkultur. I renkultur kan koloniernas egenskaper lättare studeras. En steril ögla användes för att lyfta kolonierna från blod- och ALOA-plattorna och för att sprida dem på nya blodagar- eller ALOA-platta. Då bakterierna ströks med denna metod späddes bakterierna och det blev möjligt att få separata kolonier. Renstrykningarna utfördes i
kvadranter eller enligt tre-stryksmetoden (Figur 3) beroende på bakterietillväxten på plattorna. I de fall där enskilda kolonier tillväxt kunde renstryk i kvadranter utföras. I de fall där
plattorna var överväxta med blandkultur var det nödvändigt att först utföra ett trestryk för att isolera enskilda kolonier. Dessa renströks sedan för att få en renkultur. Vid renstryk i
kvadranter valdes fyra intressanta, misstänkta kolonier ut och spreds i respektive kvadrant. För plattor med blandkultur utfördes tre-stryk på ALOA-platta för att uppnå renkultur. Detta då ALOA är ett selektivt tillväxtmedium för Listeria och därmed hämmar tillväxten av andra bakterier. Plattorna inkuberades därefter vid 37 °C i 24 h. Processen för renstrykning
upprepades till dess att renkultur av L. monocytogenes uppnåddes vilket varierade mellan en och fyra gånger per misstänkt bakterie.
17
Figur 3. Visuell bild över trestryk och renstryk i kvadrant. Siffrorna 1–3 representerar i vilken ordning som respektive stryk utfördes.
Dataanalys
Nedan kommer de mikrobiologiska analyser som utförts att presenteras utifrån de metoderna som använts i studien. Inledande presenteras hur resultaten från den kvalitativa metoden har analyserats följt av analysen från den kvantitativa metoden.
Kvalitativ analys
Den kvalitativa analysen utfördes utifrån detekteringen av L. monocytogenes. Under processen fanns indikationer som tydde på förekomst av L. monocytogenes som bedömdes och analyserades. Det som analyserades var eskulinhydrolys i anrikningsbuljongerna samt kolonierna som tillväxt på odlingsmedierna. Eskulinhydrolys är en reaktion som kan tyda på förekomst av L. monocytogenes, vilken kan ses under anrikningen i de selektiva
anrikningsbuljongerna Half-Fraser och Whole-Fraser (Fraser & Sperber, 1988, s. 762). Fraser innehåller glykosiden eskulin samt järnammoniumcitrat, vilka är delaktiga i reaktionen (ibid.). Eskulin genomgår en enzymatisk spjälkning av L. monocytogenes som bildar enzymet eskulinas (Fraser & Sperber, 1988, s. 762; Danielsson-Tham, 2004, s. 24). Genom
spjälkningen bildas ämnet eskuletin som reagerar med järnjoner från järnammoniumcitrat (ibid.). Detta ger en svart fällning i substratet (ibid.). Svartfärgning av buljong indikerar förekomsten av Listeria, men även ofärgad buljong kan innehålla Listeria (Cauchon et al., 2017, s. 41). Vid odling på ALOA-plattor är typiska kolonier av L. monocytogenes blåa till blå-gröna och omges av en grumlig zon. Vid odling på blodagar-plattor bildar L.
18
monocytogenes en klar hemolys runt kolonierna (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 125).
Prover där kolonier med typiska egenskaper bildats bedömdes som L. monocytogenes-positiva (NMKL, 2007, s. 12).
Kvantitativ analys
Utifrån bakterieodlingarna från kvantifieringen räknades typiska kolonier. På de plattor där färre än totalt 100 kolonier växt räknades alla kolonier typiska för L. monocytogens. Halterna beräknades därefter genom att multiplicera antalet L. monocytogenes-positiva kolonier med spädningsfaktorn för den spädning som spreds på plattan (Tabell 3). Halten angavs i enheten
colony-forming unit per gram livsmedel (cfu/g) (NMKL, 2007, s. 12, 14). Om inga typiska
kolonier isolerades i kvantifieringen angavs det i resultatet att halten för den eftersökta bakterien var under detektionsgränsen.
Tabell 3. Spädningsfaktor för respektive spädning utifrån den mängd spädning som spridits på plattorna, samt antalet bakterier som en enskild koloni motsvarar.
Spädning 1 1 ml prov Spädning 1 0,1 ml Spädning 2 0,1 ml Spädning 3 0,1 ml Spädnings-faktor 101 102 103 104 En koloni motsvarar: 10 L. monocytogenes
per gram prov 100 L. monocytogenes
per gram prov
1000
L. monocytogenes
per gram prov
10 000
L. monocytogenes
per gram prov
Litteratursökning
En litteratursökning genomfördes för att skapa en teoretisk bakgrund som är relevant för studiens forskningsområde. Litteratursökningen har även gjorts för att ta reda på vilken metodik som använts för liknande mikrobiologiska undersökningar. Ingen avgränsning för publiceringsår gjordes vid litteratursökning för tidigare utbrott av L. monocytogenes då historiken för dessa utbrott fortfarande är relevant för studiens syfte.
19
De vetenskapliga artiklar som inkluderades i denna studie hämtades via litteratursökning från databaserna Web of Science och Google Scholar, samt via dessa artiklars referenser. Alla artiklar som använts var vetenskapligt granskade och publicerade i vetenskapliga tidsskrifter. En sökmatris användes för att strukturera processen för litteraturssökningen och dokumentera de sökord som användes. De sökord som användes var: “Listeria Monocytogenes”, Corn,
“Sweet corn”, Contamination, Listeriosis, Biofilm. Information har även hämtats från
nationella och internationella myndigheter. Dataportalen DiVA användes för att hitta
studentuppsatser om mikrobiologiska undersökningar. Referenser från dessa studentuppsatser som ansetts vara relevanta för föreliggande studie har inkluderats. Dessutom användes
sökmotorn Google för att hitta allmän information som var relevant för studien. Slutligen har tidigare kurslitteratur från kursen Måltidskunskap och Värdskap, Livsmedelshygien
(MÅ018G) använts. Relevant litteratur har även tillhandahållits från handledare och kursansvarig för kursen Måltidskunskap och Värdskap, Livsmedelshygien (MÅ018G).
Etiska beaktanden
För att studien skall hålla hög kvalitet och på ett ansvarsfullt sätt kunna bidra med kunskap till samhället, behöver etiska riktlinjer och överväganden tas i beaktande (Vetenskapsrådet, 2017, s. 2). Dessa riktlinjer rör grundläggande etiska frågor som syftar till frivillighet, integritet, konfidentialitet och anonymitet för de personer som är inblandade i studien (Vetenskapsrådet, 2017 s. 40; Bryman, 2016. s. 170). Inom svensk forskning bör därför fyra forskningsetiska principer följas. Dessa principer innefattar informations-, samtyckes-, konfidentialitets- och nyttjandekravet (Bryman, 2016, s. 170, s. 183). Det finns även en lag om etikprövning av forskning (SFS 2003:460), den så kallade etikprövningslagen, som avser människor. Lagen innebär bland annat att forskningen enbart får godkännas om den kan utföras med respekt för människovärdet (Vetenskapsrådet, s. 30–31). Forskare och författare har därmed ett ansvar att skydda de människor som, indirekt eller direkt, är inblandade i studien och dess
forskningsresultat (Vetenskapsrådet, 2017, s. 25).
I denna laborativa studie har varken djur eller människor varit direkt inblandade. Däremot kan studien påverka människor indirekt då 10 olika varumärken på marknaden har undersökts och
20
därmed kan kopplas tillbaka tillverkare. De varumärken som använts i studien har därför anonymiserats och omnämndes prov 1–10.
Resultat
I detta avsnitt redovisas resultaten från den mikrobiologiska undersökningen som genomförts i denna studie. Inledningsvis presenteras resultaten från den kvalitativa analysen följd av resultaten från den kvantitativa. Samtliga resultat presenteras i en tabell med ursprungsländer för respektive fabrikat.
Den kvalitativa analysen visar att fyra av tio prover innehöll L. monocytogenes. I prov tre, fyra, fem och nio påvisades L. monocytogenes i anrikningen genom svärtning i Half-Fraser-buljong samt blågröna kolonier med opak zon vid odling på ALOA-platta. I prov ett, två, sex, sju, åtta och tio påvisades ingen förekomst av L. monocytogenes i anrikningen.
Kvantifieringen av prov tre och nio visade på halter under detektionsgränsen 10 cfu/g livsmedel och prov fyra och fem under detektionsgränsen 100 cfu/g livsmedel. Vid
kvantifieringen av prov sex, sju, åtta och tio uppmättes inga halter över detektionsgränsen 10 cfu/g livsmedel (Tabell 4).
21
Tabell 4. Resultat från mikrobiologisk undersökning för L. monocytogenes i fryst majs från tio olika fabrikat. Prov L. monocytogenes påvisad Halt (CFU/g livsmedel) Mängd prov - Spädning (nr) Land*
1 Nej ej kvantifierat ej kvantifierat Spanien,
Frankrike, Ungern 2 Nej ej kvantifierat ej kvantifierat Frankrike,
Kroatien, Serbien 3 Ja <10 1 ml - S (1) Ungern 4 Ja <100 0,1 ml - S (1) Spanien 5 Ja <100 0,1 ml - S (1) Ungern, Österrike 6 Nej <10 1 ml - S (1) Polen 7 Nej <10 1 ml - S (1) Ungern 8 Nej <10 1 ml - S (1) Ungern 9 Ja <10 1 ml - S (1) Ungern 10 Nej <10 1 ml - S (1) Belgien
*Land avser det land som anges på förpackningen. Kan avse produktionsland, odlingsland eller förpackningsland. Detta specificeras ej på alla förpackningar.
Diskussion
I nedanstående avsnitt kommer resultaten diskuteras utifrån den teoretiska bakgrund som föreligger i denna studie. Inledningsvis lyfts förekomsten av L. monocytogenes i den frysta majs som undersökts, samt hur mängden förhåller sig till de gränsvärden som finns idag. Därefter diskuteras hur fryst majs bör hanteras och de risker som kan uppstå vid felaktig hantering. Vidare diskuteras möjliga kontaminationskällor och ursprung för de fabrikat som visats vara kontaminerade med L. monocytogenes. Slutligen kommer val av metod och material och eventuella felkällor att diskuteras.
22
Resultatdiskussion
Syftet med studien var att undersöka förekomsten av L. monocytogenes i frysta majskorn från tio fabrikat på marknaden och vid förekomst fastställa i vilka mängder. Resultatet visade att det fanns L. monocytogenes i fyra av tio olika fabrikat som undersökts. Halterna som
uppmättes i de prover som innehöll L. monocytogenes var lägre än 10 cfu/g livsmedel för prov tre och nio, respektive under 100 cfu/g livsmedel för prov fyra och fem. Detta är
anmärkningsvärt då det ger en indikation på att L. monocytogenes alltså förekommer i fryst majs i viss utsträckning. Utifrån antalet prover går det dock inte att dra några generella slutsatser över hur det ser ut på marknaden. För att kunna dra några generella slutsatser för hur utbredd förekomsten av L. monocytogenes i fryst majs är, bör mer omfattande studier utföras med fler stickprover från fabrikaten.
Gränsvärden för L. monocytogenes
Det finns gränsvärden för hur mycket L. monocytogenes olika livsmedel får innehålla (EG 2073/2005). Vad beträffar fryst majs är det intressant att diskutera gränsvärdena för ätfärdiga livsmedel eftersom det ännu inte är klarlagt huruvida fryst majs ses som ett ätfärdigt
livsmedel eller ej. Det är tvetydigt vad som definieras som ett ätfärdigt livsmedel och det förekommer dessutom kulturella skillnader mellan olika länder i vad som anses vara ett ätfärdigt livsmedel (Luber et al., 2011, s. 1539). Ätfärdiga livsmedel kan avse alltifrån råa till tillredda livsmedel som konsumeras utan bakteriedödande behandling såsom exempelvis kokning (ibid.). EU-kommissionens förordning EG 2073/2005 (s. 3) definierar ätfärdiga livsmedel som livsmedel som producenten eller tillverkaren anser ska ätas utan vidare tillagning.
Med tanke på att fryst blancherad majs är möjligt att konsumera utan vidare tillagning bör fryst majs anses som ett ätfärdigt livsmedel (Livsmedelsverket, 2018; EU-kommissionen, 2018). På majsförpackningarna som inkluderats i denna studie står enbart rekommendationer för tillagning som alltså kan förbises av konsumenter. Skulle fryst blancherad majs definieras som ett ätfärdigt livsmedel skulle det inbegripas under gränsvärdet som ligger på 100 cfu/g
23
livsmedel. Detta skulle innebära att proverna i denna studie kan anses som godkända då halterna som uppmättes i den undersökta majsen var lägre är 10 cfu/g livsmedel i prov tre och nio och under 100 cfu/g livsmedel i prov fyra och fem. EFSA (2020, s. 4) menar att
upptäckbara halter av L. monocytogenes, även under 10 cfu/g, kan utgöra en hälsorisk när konsumenter använder livsmedlet utan att tillaga den. Med konsumenters användning av livsmedlet i åtanke samt det faktum att ett utbrott uppstått på grund av fryst majs, bör definitionen av fryst majs vad beträffar om det är ett ätfärdigt livsmedel eller ej ses över. En tydlig och gemensam definition av vad som är ett ätfärdigt livsmedel behövs för att förtydliga för konsumenter vilka livsmedel som är säkra för direkt konsumtion och vilka livsmedel som bör tillagas innan förtäring (Luber et al., 2011, s. 1539).
Vidare finns det även fastställda gränsvärden för livsmedel som gynnar tillväxten av L.
monocytogenes. Livsmedel som gynnar tillväxten av L. monocytogenes får ej innehålla
upptäckbara halter av bakterien (EG 2073/2005, s. 10; EFSA, 2020, s. 4). Vidare innefattas inte fryst majs inom dessa gränsvärden som det ser ut idag. En diskussion kring huruvida majs eventuellt bör ses som ett livsmedel som gynnar tillväxten av L. monocytogenes bör föras. Tidigare studier har visat att majs är ett bra tillväxtmedium för L. monocytogenes (Aureli et al., 2000, s. 1239; Kataoka et al., 2017, s 452). Vidare anser EU-kommissionen att låga halter i blancherade frysta grönsaker kan medföra en hälsorisk och således inte bör innehålla L.
monocytogenes. Med tanke på att tidigare forskning visat på att majs gynnar tillväxten av L. monocytogenes bör det diskuteras huruvida fryst majs bör definieras som ett livsmedel som
gynnar tillväxten av L. monocytogenes och därmed ej får innehålla upptäckbara halter. Detta skulle innebära att resultaten i föreliggande studie, där förekomst av bakterien i fryst majs upptäckts skulle ses som otillfredsställande.
Hantering av fryst majs
Som ovan nämnt finns instruktioner och rekommendationer för tillagning och hantering på förpackningarna. Bland annat står det att livsmedlet bör kokas före konsumtion. Det är dock enbart en av förpackningarna som ger uttryckliga instruktioner om att livsmedlet måste upphettas före konsumtion. Utifrån resultaten i denna studie som indikerar kontamination av
24
konsumtion. Det står även information på förpackningen om hur majskornen bör förvaras. Majsen skall förvaras i frysutrymme under -18 °C och bör inte frysas om efter upptining. Luber et al. (2011) menar att konsumenter lätt kan förbise instruktionerna för tillagning i de fall då det är oklart om livsmedlet kan ätas direkt eller ej. Det kan vara så att konsumenten inte läser informationen på förpackningen då fryst majs som ovan nämnt kan ätas utan vidare tillagning. På förpackningarna med fryst majs framgår det ingen anledning till varför
rekommendationerna bör följas. Kanske bör det framgå en tydlig anledning till varför livsmedlet bör tillagas för att konsumenter ska ta rekommendationerna på högsta allvar och därmed följa instruktionerna. Kokning såväl som infrysning av majsen är viktig ur ett
livsmedelshygieniskt perspektiv med avseende på livsmedelssäkerheten (Perera et al., 2015, s. 46; Kataoka et al., 2017, s. 447). Kokning är till exempel en åtgärd som eliminerar eventuell kontamination av L. monocytogenes (Rhodes, 2009, s. 358). Vidare kan rekommendationerna om att livsmedlet bör hållas fryst motiveras genom att det är en effektiv metod för att hämma tillväxten av L. monocytogenes (Perera et al., 2015, s. 46; Kataoka, Wang, Elliot, Whiting & Hayman, 2017, s. 447). För att säkerställa livsmedelssäkerheten är det även viktigt att den tinade majsen ej ska frysas in på nytt eftersom en tillväxt av L. monocytogenes kan ha uppstått under upptiningsfasen (Perera et al., 2015, s. 46).
Ett användningsområde där fryst majs skulle kunna utgöra en risk när livsmedlet ej hanteras korrekt är i storkök inom äldrevården. Äldre personer är en av riskgrupperna som kan drabbas av en listeriainfektion (EFSA, 2013, s. 86; Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 124; EFSA, 2018a, s. 83). Ett exempel på felhantering av fryst majs där en tillväxt av L. monocytogenes skulle kunna uppstå, skulle kunna vara om maten står framme under en längre tid vid lunchservering eller återanvänds igen på kvällen. Det stora utbrottet av listerios som skedde 1997 i Italien berodde sannolikt på en korskontamination och en följande felhantering av livsmedlet i storkök (Aureli et al., 2000, s. 1239). Om maten innehåller fryst majs som ej tillagats och majsen dessutom redan innehåller en liten mängd L. monocytogenes kan bakterien, under gynnsamma förhållanden, föröka sig i snabb takt. L. monocytogenes kan därmed komma upp i en skadlig mängd för att ge sjukdom hos de som tillhör riskgrupperna, i detta fall äldre. Risken med felhantering av fryst majs i storkök är aktuellt i fler sammanhang, exempelvis inom vården.
25
Kontaminationsrisker i livsmedelskedjan
Kontaminationen av den undersökta, Listeria-innehållande majsen kan ha uppstått i olika steg i livsmedelskedjan. L. monocytogenes har bland annat visats kunna etablera sig i grödor under primärproduktionen (Livsmedelsverket, 2007, s. 25; EFSA & ECDC, 3013, s. 86; Chitarra et al., 2014, s. 142; Zhu et al., 2017, s. 6; Kljujev et al. 2018, s. 27). Kontamination kan även skett under förädlingen i livsmedelsanläggningen då L. monocytogenes kan vara etablerad i lokalerna (Livsmedelsverket, 2007, s. 25; Camargo, Woodward, Call & Nero, 2017, s. 623; Jordan et al., 2018, s. 106). Under förädlingen blancheras majs vid 96 ºC i 100 sekunder (EFSA, 2018b, s. 11). Denna upphettning är i teorin tillräcklig för att avdöda L.
monocytogenes. Dock menar EFSA att blancheringen ej kan förväntas avdöda samtliga
patogena bakterier (EFSA, 2018b, s. 11). Olika bakteriearter är olika känsliga för
värmebehandling. Vid blanchering kan de mest värmekänsliga bakterierna avdödas medan L.
monocytogenes kan blir kvar (Livsmedelsverket, 2020a). Detta leder till minskad
mikrobiologisk konkurrens för L. monocytogenes i livsmedlet och bakterien får därmed ökad möjlighet att föröka sig (Livsmedelsverket, 2020a). Teoretiskt sett kan alltså den frysta majsen i föreliggande studie innehålla L. monocytogenes som etablerats redan i
primärproduktionen. En kontamination kan även ha skett vid den fortsatta hanteringen av majsen då den exponeras för den omgivande miljön efter blancheringen, innan den förpackas. Flera potentiella spridningsvägar finns och är viktiga att kontrollera längs hela
livsmedelskedjan.
Av de fyra prover som visade på förekomst av L. monocytogenes i denna studie har två prover sitt ursprung i Ungern, ett i Ungern eller Österrike, och ett i Spanien. Ungern är ett land som tidigare kopplats till kontamination av L. monocytogenes i fryst majs. I utbrottet som skedde mellan år 2015 och 2018 spårades den kontaminerade majsen tillbaka till en
livsmedelsanläggning i Ungern som producerade och hanterade frysta blancherade grönsaker (EFSA & ECDC, 2018). Att Ungen visat sig vara ursprungsland för den föreliggande studiens undersökta kontaminerade majs, samt det faktum att landet har varit inblandat i tidigare utbrott, är anmärkningsvärt och Ungern tycks därför vara ett land av intresse. Det går dock inte att identifiera var i produktionen kontaminationen av majsen kan ha skett då det inte går att utläsa från den information som står på förpackningarna. På de Listeria-kontaminerade majsförpackningarna som kommer från Ungern står det Odlad i Ungern/Österrike,
26
Producerad i Ungern eller enbart Ungern. Man får enbart reda på ett steg i livsmedelskedjan
eftersom det inte framgår var majsen i fråga är producerad, förpackad, tillverkad eller odlad. Denna information upplevs vara otydlig på samtliga förpackningar. Det kan exempelvis vara så att innehållet i de olika fabrikaten i själva verket kommer från samma förpackningsfabrik i Ungern, eller är från samma odling. Spårbarheten är därmed begränsad. Att undersöka i vilket steg i livsmedelskedjan som majs från Ungern har blivit kontaminerad av L. monocytogenes är därmed intressant att undersöka i vidare studier. EU-kommissionen menar att hårda
kontroller bör ske längs hela kedjan för att lokalisera kontaminationskällor och minska risken för smittspridning (EU-kommissionen, 2018).
Metod- och materialdiskussion
Valet av laborativa metoder är anpassade utifrån studiens syfte och mål. Metod nr 136 som valdes till denna studie gav de resultat som behövdes för att besvara studiens syfte. Det förekommer olika metoder för att påvisa förekomst av L. monocytogenes. Ingen metod är dock 100 % tillförlitlig (Cauchon et al., 2007, s. 47). Metoden som använts i denna studie bedöms vara jämlik med övriga metoder som finns för att påvisa L. monocytogenes i
livsmedel när det gäller tillförlitlighet. Att använda beprövade metoder ökar reliabiliteten och validiteten. Vidare är det viktigt oavsett metod att vidta noggrannhet vid laborationstillfället. Proverna har därför hanterats med stor aktsamhet för att i möjligaste mån reducera risken för korskontamination under laborationerna. Laborationernas olika moment genomfördes av samma person vid alla tillfällen för att eftersträva en så lika teknik som möjligt och därmed ge ett jämlikt och trovärdigt resultat. Exempelvis utfördes rackling, pipettering och vägning av proverna av samma person för de olika momenten. Vidare höll de frysta majskornen en temperatur på under -2 °C under frakt från butik till laboratoriet. Detta eliminerar risken för en eventuell tillväxt av L. monocytogenes i förpackningen innan analys.
Avvikelserna som gjordes från metod nr 136 var valet av substrat. I metod nr 136 skall två selektiva odlingmedium för L. monocytogenes användas. I denna studie valdes dock enbart ett selektivt odlingsmedium. Som kompletterande odlingsmedium till ALOA valdes istället blodagar. Blodagar är ej selektivt för L. monocytogenes men kompletterar ALOA då misstänkta kolonier av L. monocytogenes kan bekräftas genom att de bildar hemolys på
27
blodagar-platta (Tham & Danielsson-Tham, 2014, s. 125). Analys och resultat för denna studie blir därmed jämförbara med metod 136 och bedöms som tillförlitliga. Valet av substrat var en kostnadsfråga och berodde på det material som fanns tillgängligt i laboratoriet vid Restaurang och hotellhögskolan, Grythyttan.
Anrikningsbuljongen blir inte alltid svärtad trots att det växer L. monocytogenes (Cauchon et al., 2017, s. 41). Om det förekommer låga halter av L. monocytogenes kan tillväxten hämmas av konkurrerande bakterier och blir således svåra att hitta (ibid.). Denna felkälla förekommer även i övriga metoder för att påvisa L. monocytogenes (Cauchon et al., 2007, s. 47). Ett prov där vätskan är helt klar efter anrikningen kan bedömas som ett prov utan tillväxt eller låg risk för förekomst av L. monocytogenes i provet (Wilhelm Tham, muntlig kommunikation). Proverna undersöktes i två omgångar under två efterföljande laborationsveckor. Proverna 1–5 undersöktes vecka ett och proverna 6–10, vecka två. Genomförandet justerades i viss mån den andra veckan. Prov ett och två (prover som undersöktes laborationsvecka ett) som ej visade svärtning i anrikningen genomgick ej vidare analys och kvantifiering utifrån ett beslut som togs i samråd med handledare Wilhelm Tham. Prov sex, sju, åtta och tio (prover som undersöktes laborationsvecka två) som inte visade på en svärtning i anrikningen kvantifierades ändå. Det som skiljde tillvägagångssättet åt vecka två var alltså att kvantifieringen gjordes, trots att det ej bildats en svärtning. Detta gjordes eftersom kvantifiering inleddes parallellt med anrikningen och därmed kunde bespara tid.
Slutsatser
Syftet med studien var att undersöka förekomsten av L. monocytogenes i fryst majs från tio olika fabrikat på marknaden och vid förekomst fastställa i vilka mängder. Resultaten visade att L. monocytogenes förekom i fyra av tio prover. Halterna som upptäcktes var under 10 cfu/g och under 100 cfu/g. Resultaten visar på att L. monocytogenes förekommer i fryst majs, men som det ser ut idag, i en godkänd mängd för att kunna fortsätta säljas på marknaden. Detta beror på att fryst majs ej ses som ett ätfärdigt livsmedel med specifika gränsvärden. Förekomst av L. monocytogenes kan utgöra en hälsorisk om livsmedlet felhanteras och
28
gränsvärdena för L. monocytogenes i fryst blancherad majs bör därför ses över. Den kontamination som påvisats, tillsammans med att majs i tidigare forskning visats gynna tillväxten av L. monocytogenes, talar för att fryst majs bör ses som ett potentiellt
risklivsmedel.
Praktisk användning och vidare forskning
Resultaten i denna studie har användningsområden för såväl den gastronomiska sektorn som den enskilda konsumenten. Inom den gastronomiska sektorn är studien användbar för restauranger och inom offentlig måltid då den kan bidra med ökad kunskap om livsmedelshygienens betydelse för måltiden. Fryst majs bör tillagas ordentligt före konsumtion för att säkerställa livsmedelssäkerheten. Resultaten kan även bidra med att bestämmelserna bör ses över huruvida fryst blancherad majs bör ses som ett ätfärdigt livsmedel eller ej och även för att fastställa gränsvärden för L. monocytogenes i fryst majs. För den enskilda konsumenten kan kunskapen från denna studie bidra med en ökad förståelse för vikten av att följa de angivna tillagningsrekommendationerna som står på
livsmedelsförpackningar.
För att få en mer generell bild av hur utbredd kontaminationen av L. monocytogenes i fryst majs är på marknaden bör mer omfattande studier utföras. Fler stickprov från de
kontaminerade fabrikaten bör analyseras och dessutom bör fler fabrikat av fryst majs undersökas. Utifrån resultaten där tre av fyra kontaminerade majsförpackningar har sitt ursprung från Ungern samt att tidigare utbrott kopplats till fryst majs från Ungern skulle det vara intressant att i vidare studier undersöka om det finns en gemensam kontaminationskälla samt hur tillverkningsprocessen för fryst majs ser ut i Ungern. Vidare skulle det vara av intresse att undersöka om majs har specifika egenskaper som gynnar tillväxten av L.
monocytogenes. Majskornens egenskaper såsom pH, vattenaktivitet eller näringsinnehåll kan
vara gynnsamma för L. monocytogenes och därmed ha stor inverkan på huruvida L.
29
Referenslista
2073/2005/EU. KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 2073/2005 av den 15 november 2005 om mikrobiologiska kriterier för livsmedel: Text av betydelse för EES. Bryssel:
Europeiska unionen.
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/SV/TXT/PDF/?uri=CELEX:02005R2073-20200308&from=EN
Aureli, P., Fiorucci, G. C., Caroli, D., Marchiaro, G., Novara, O., Leone, L. & Salmaso, S. (2000). An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria
monocytogenes. The New England Journal of Medicine, 342(17), 1236-1241.
doi:10.1056/NEJM200004273421702
Bryman, A. (2016). Samhällsvetenskapliga metoder. Malmö: Liber.
Camargo, A. C., Woodward, J. J., Call, D. R. & Nero, L. A. (2017). Listeria Monocytogenes in food-processing facilities, food contamination, and human listeriosis: The Brazilian Scenario”. Foodborne Pathogens and Disease, 14(11), 623–36. doi:10.1089/fpd.2016.227 Cauchon, K. E., Hitchins, A., D., & Smiley, R. D. (2017). Comparison of Listeria
monocytogenes recoveries from spiked mung bean sprouts by the enrichment methods of three regulatory agencies. Food Microbiology, 66, 40–47. doi:10.1016/j.fm.2017.03.021 Chitarra, W., Decastelli, L., Garibaldi, A. & Gullino, M. L. (2014). Potential Uptake of
Escherichia Coli O157:H7 and Listeria Monocytogenes from Growth Substrate into Leaves of
Salad Plants and Basil Grown in Soil Irrigated with Contaminated Water. International
Journal of Food Microbiology 189, 139–145. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.08.003.
Danielsson-Tham, M-L. (u.å. a) Livsmedeslhygien och FAMM. Kompendium i
livsmedelshygien HT-19. Hällefors: Restaurang- och hotellhögskolan Grythyttan.
Danielsson-Tham, M-L. (u.å. b) Mikrobiologisk undersökning av livsmedel.
Laborationskompendie HT-19. Hällefors: Restaurang- och hotellhögskolan Grythyttan.
Danielsson-Tham, M-L. (2004). Några vanliga biokemiska tester inom bakteriologin. Uppsala: Veterinärmedicinska fakulteten, Sveriges lantbruksuniversitet.
30
Donlan, R. M., & Costerton, J. W. (2002). Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, 15(2), 167–193.
doi:10.1128/CMR.15.2.167-193.2002
EFSA (European Food Safety Authority) & ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control). (2013). The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2011. EFSA Journal 2013, 11(4) :3129, 1-250. doi:10.2903/j.efsa.2013.3129.
EFSA (European Food Safety Authority) & ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control). (2018). Multi-country outbreak of Listeria monocytogenes serogroup IVb,
multi-locus sequence type 6, infections probably linked to frozen corn - first update. Parma:
European Food Safety Authority & Stockholm: European Centre for Disease Prevention and Control.
EFSA. (2018a). The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2017. EFSA Journal, 16 (12):5500.
doi:10.2903/j.efsa.2018.5500
EFSA. (2018b). Urgent scientific and technical assistance to provide recommendations for sampling and testing in the processing plants of frozen vegetables aiming at detecting Listeria
monocytogenes. EFSA Journal, EFSA Supporting publication 2018: EN-1445.
doi:10.2903/sp.efsa.2018.EN-1445
EFSA (2020). The public health risk posed by Listeria monocytogenes in frozen fruit and vegetables including herbs, blanched during processing. EFSA Journal, 18(4):6092, 1-102. doi:10.2903/j.efsa.2020.6092
Europeiska kommissionen (2018) Standing Committee on Plants, Animals, Food and
FeedSectionBiological Safety of the Food Chain 17 December 2018. Health and Food Safety
Directorate General. https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/adv-grp_plenary_20180427_sum.pdf
FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). Maize. (2020.) Hämtat den 2020-05-26 från
31
Folkhälsomyndigheten. (2020). Listeriainfektion. Hämtad den 2020-04-20 från https://www.folkhalsomyndigheten.se/folkhalsorapportering-statistik/statistik-a-o/sjukdomsstatistik/listeriainfektion/?t=county
Fraser, J. A. & Sperber, W. H. (1988). Rapid Detection of Listeria spp. in Food and
Environmental Samples by Esculin Hydrolysis. Journal of Food Protection, Vol. 51(10), 762-765. doi:10.4315/0362-028X-51.10.762
Gustafsson, I. B., Öström, Å., Johansson, J., & Mossberg, L. (2006). The Five Aspects Meal Model: a tool for developing meal services in restaurants. Journal of Foodservice, 17(2), 84– 93. doi:10.1111/j.1745-4506.2006.00023.x
Hunt, K., Blanc, M., Álvarez-Ordóñez, A., & Jordan, K. (2018). Challenge studies to determine the ability of foods to support the growth of Listeria monocytogenes. Pathogens 7(4), 80. doi:10.3390/pathogens7040080
Jordan, K., Hunt, K., Lourenco, A. & Pennone, V. (2018). Listeria Monocytogenes in the food processing environment. Current Clinical Microbiology Reports, 5(2), 106–119.
doi:10.1007/s40588-018-0090-1
Kataoka, A, Wang, H., Elliott, P. H., Whiting, R. C. & Hayman, M. M. (2017). Growth of
Listeria Monocytogenes in Thawed Frozen Foods. Journal of Food Protection 80(3): 447–
453. doi:10.4315/0362-028X.JFP-16-397R
Kljujev, I., Raicevic, V., Jovicic-Petrovic, J., Vujovic, B., Mirkovic, M. & Rothballer, M. (2018). Listeria Monocytogenes – Danger for Health Safety Vegetable Production. Microbial
Pathogenesis 120, 23–31. doi: https://doi.org/10.1016/j.micpath.2018.04.034
Livsmedelsverket (2020a) Listeria monocytogenes. Hämtat den 2020-03-23 från https://www.livsmedelsverket.se/livsmedel-och-innehall/bakterier-virus-parasiter-och-mogelsvampar1/bakterier/listeria-monocytogenes
Livsmedelsverket (2020b) Matförgiftning. Hämtat den 2020-05-12 från
https://www.livsmedelsverket.se/matvanor-halsa--miljo/sjukdomar-allergier-och-halsa/matforgiftning
