Histopatologisk diagnostik. Crohns sjukdom i munhålan

Histopatologisk diagnostik

Crohns sjukdom i munhålan

Linda Bokander

Klara Nilsson

Handledare: Anna Ljunggren

Examensarbete (15 hp)

Malmö högskola

Tandläkarprogrammet

Odontologiska fakulteten

2

Vi vill framföra ett stort tack

till vår handledare

Anna Ljunggren

och till hjälpsam personal på avdelningen för oral patologi

på Malmö Tandvårdshögskola,

Ulf Mattsson för lån av kliniska bilder

3

ABSTRACT

Bokander, L. Nilsson, K.

Histopatologisk diagnostik. Crohns sjukdom i munhålan.

Examensarbete 15 poäng.

Malmö högskola: Odontologiska fakulteten, 2011.

Crohns sjukdom (CS) är en svårdiagnosticerad tarmsjukdom som kan medföra risk för näringsbrist, smärtsamma åkommor och allmänt nedsatt livskvalité för patienten. CS kan visa extraintestinala manifestationer till exempel i munhålan som är lättillgänglig för biopsitagning vid behov samt visuell undersökning, som rutinmässigt utförs av tandvårdspersonal. Studien avser att besvara hur Crohns sjukdom yttras histopatologiskt i orala biopsier och dess eventuella betydelse för fastställning av diagnos. Syftet är att med hjälp av monoklonala antikroppar mot CD68 granska den histopatologiska inflammationsbilden av Crohns sjukdom i munhålan hos 17 patienter som anknutits till den patologanatomiska diagnosen epiteloidcellig granulomatos (ECG). Detta i försök att förtydliga den specifika inflammationsbilden och för att indikera orala manifestationers och biopsiers möj-liga användning för att underlätta diagnostiken av Crohns sjukdom.

Resultatet visade att den för CS representativa inflammationsbilden förekom-mer i munhålan, vilken förtydligades av den immunohistokemiska infärgnings-tekniken. Hur sjukdomen yttrar sig makroskopiskt och framförallt histopatologiskt samt betydelsen av och kunskapen om dessa symtom har belysts.

Diagnos av CS kan inte enbart ställas utifrån den orala inflammationsbilden. Däremot skulle tandläkares och oralpatologers kunskap om dess orala manifesta-tioner och histopatologiska sjukdomsbild kunna bistå läkare för fastställning av diagnos. Detta skulle därmed kunna medföra tidigare insatt behandling och möj-lighet till lindrat lidande för patienten.

Nyckelord: CD68, Crohns sjukdom, epiteloidcellig granulomatos, histopatologisk

4

Innehållsförteckning

Prevalens och incidens i Sverige. 7

Patologi 7 Autoimmunitet 7 NOD2/CARD15 7 Ärftlighet 8 Miljöbetingade faktorer 8 Orala manifestationer 8

Oral makroskopisk symtombild 8

Oral histopatologisk symtombild 9

Granulombildning. 10

Differentialdiagnoser för histopatologisk sjukdomsbild. 10

Diagnostik 10 Behandling 11 Systemisk behandling 11 Läkemedelsbehandling. 11 Diet. 11 Kirurgisk behandling. 11 Lokal behandling 11

Syfte och frågeställning 12

MATERIAL OCH METOD 12

Material 12

Patienter och positiv kontroll 12

Infärgningsmaterial 13 Metod 13 Antikroppar 13 Epitop/determinant 13 Immunohistokemi 14 RESULTAT 15 Makrofagansamlingar 16 Jätteceller. 16 Epiteloidcelliga granulom. 16 DISKUSSION 17 KONKLUSION 19 REFERENSER 20 Bilaga 1 23

5

FÖRKLARINGAR

Följande definitioner har använts:

Ansamling: en ansamling makrofager som visas i högre koncentration inom ett område i vävnaden (CD68 – brunt pigment) utan tydlig avgränsning mot omkring-liggande vävnad och utan specifik form.

Granulom: en samling makrofager (i högre koncentration än omkringliggande vävnad), där vissa hunnit modifieras till epiteloidceller, med en synbar avgräns-ning mot närliggande vävnad. Gärna i cirkulär form, med vall av lymfocyter och närvaro av jätteceller.

Jätteceller: en ansamling makrofager utan storleksordning med sammansmält cytoplasma. Cellkärnorna är anordnade perifert i hästskoliknande form (gällande Langhanska jätteceller) eller – ovanligt för denna inflammation – centralt arrange-rade (central jättecell).

Sjukdomar:

Catscratch disease: feber och lymfkörtelsjukdom pga infektion av Bartonella

henselae till följd av bit- eller rivsår av katt. [32]

Främmandekroppsreaktion: främmande kroppar bäddas in i vävnaden och or-sakar en ansamling av makrofager och granulomatös vävnadsinflammation [18]. Sarkoidos: en systemisk granulomatös sjukdom som drabbar flera organsystem, oftast lungorna [32].

Tuberkulos: bakteriell granulomatös infektionssjukdom som drabbar lungorna, främst orsakad av Mycobacterium tuberculosis [33].

Wegeners sjukdom: en systemisk autoimmun sjukdom med granulomatösa le-sioner i övre eller nedre luftvägarna, granulomatösa lele-sioner i njurarna och arteri-ell samt venös vaskulit. [1]

6

FÖRKORTNINGAR

CARD15: caspasaktiverings rekryterande domän 15 CD: clusters of differentiation

CS: crohns sjukdom

DAB: diaminobesidin (kromogen) ECG: epiteloidcellig granulomatos HTX: hematoxylin

HTX-eo: hematoxylineosin Ig: immunoglobuliner

ITS: inflammatorisk tarmsjukdom

engelskans IBD: inflammatory bowel disease MDP: muramyldipeptid

MRS: melkersson-rosenthal syndrom

NOD2: nukleotidbindande oligomeriserande domän 2 OFG: orofacial granulomatos

OCS: oral crohns sjukdom

PAD: patologanatomisk diagnostik PRR: pattern-recognition receptors SUS: södra universitetssjukhuset UK: ulcerös kolit

7

INTRODUKTION

Crohns sjukdom (CS) beskrevs för första gången år 1932 av Burrill Bernhard Crohn med kollegor [1] som en idiopatisk [2], kronisk och transmural inflamma-tion i magtarmkanalens olika segment [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]. Beroende på in-flammationens lokalisering klassificeras sjukdomen som: ileit, kolit eller ileoce-cal. CS har visats följa olika utvecklingsmönster såsom förträngning av tarmlu-men eller bildning av fistlar mellan magtarmkanalen och olika organ. Insjuknade personer kan drabbas av nedsatt näringsupptag (eftersom främst tunntarmen är involverad) [7] med efterföljande åkommor såsom gallsten, njursten, anemi och osteoporos på grund av stört upptag av kalcium, vitamin B12 och järn [9]. Andra vanliga symtom är bukkramper, diarréer, rektala blödningar, uppkastningar, ned-satt aptit, fatigue och viktnedgång. [2, 6, 7]

CS tillhör gruppen inflammatoriska tarmsjukdomar (ITS), vars prevalens i västvärlden har ökat under det senaste århundradets sista tredjedel [11]; CS och ulcerativ kolit (UK) utgör de vanligaste sjukdomarna i gruppen [12]. Orsaken till den ökande sjukdomsprevalensen är fortfarande okänd [13].

Prevalens och incidens i Sverige.

I Sverige har enbart två prevalensstudier gällande ITS utförts, i vilka man grans-kade Örebro (1991) och Stockholm (2006). Prevalensen av CS i Örebro och Stockholm visades vara 146 per 100 000 invånare (31 december 1987) respektive 213 per 100 000 invånare (1 januari 2002) [13].

På 60-talet och början av 70-talet kunde man se en ökning av incidensen i Sve-rige, med en avplaning under 80-talet med variationer inom landet. Exempelvis rapporterades en incidens på 4,6 och 4,9 nya fall per 100 000 invånare i Stock-holm respektive Norrland, samt 6,6 och 6,1 för Örebro respektive Uppsala. Inci-densen ökade sedan ytterligare under 1990-talet. [13]

På södra universitetssjukhuset (SUS) i Malmö har man fastställt diagnosen CS på 764 patienter (22-06-2010) [Bjelkenkrans K. personlig kommunikation].

Man förväntar sig en ökande CS diagnostik med ökad användning av förbättra-de unförbättra-dersökningsmetoförbättra-der, till exempel kapselendoskopi som unförbättra-derlättar diagnos av CS i tunntarmen [14].

Patologi

ITS anses ha multifaktoriella orsaker som inkluderar både nedärvda, miljöbeting-ade [7], immunologiska och inflammatoriska faktorer, men dess precisa etiologi är fortfarande oklar [15]. Den immunologiskt medierade tarmskadan som ses vid CS med återkommande kronisk inflammation och systemiska manifestationer har på senare tid tolkats som en autoimmun sjukdomsbild med ett genetiskt samband där miljöbetingade faktorer kan påverka sjukdomsförloppet men inte anses orsaka detta [7, 9].

Autoimmunitet

Antiinflammatorisk och immunosupprimerande behandling har förbättrat tillstån-det hos patienter med CS och UK, vilket kan tyda på att ITS är följden av en dys-reglering av immunförsvaret [9]. CS har ansetts vara en ”T-cellssjukdom” [9, 16] vilket stöds av den histologiska bilden från tarmens mucosa hos CS patienter som visar en överdriven aktivering av T-celler [17].

NOD2/CARD15. Intracellulära ”pattern-recognition receptors” (PRRs) är en grupp receptorer till vilken NOD2/CARD15 tillhör. PRR känner igen mikrobiella

8

beståndsdelar såsom muramyldipeptid (MDP) [11,16] och spelar en viktig roll för immunförsvaret [16]. MDP är en degraderingsprodukt av peptidoglykan från gramnegativa och grampositiva bakteriers cellvägg. Paneths celler som finns i tarmens epitel, visar ett speciellt högt uttryck av NOD2/CARD15 genen [11], lik-som tarmens makrofager [16].

Hos friska patienter inducerar mikrobiella ligander normalt en aktivering av NFκB (ett intracellulärt proteinkomplex som kontrollerar DNA transkriptionen) via NOD2/CARD15. Detta leder till aktivering av det medfödda immunförsvaret med utsöndring av α- och β-defensiner, vilket utgör det första försvaret i mucosa-barriären. Vidare utsöndras också proinflammatoriska cytokiner som TNF-α, IL-1β och IL-8. Reaktionen anses vara väsentlig för upprätthållande av tarmbarriä-rens funktion. Mutationer på NOD2/CARD15 genen har diskuterats orsaka en ökad T-cells koncentration som ett sekundärt svar på den insufficienta försvars-mekanismen. Enligt denna hypotes anses inte CS vara en typisk autoimmun sjuk-dom eftersom T-cellerna inte är riktade mot kroppsegna antigener, utan istället följer felaktiga signaler från det medfödda immunförsvaret [16].

Ärftlighet

ITS drabbade patienter har visats ha sjukdomshistoria i familjen [9], vilket visats vara vanligare för CS patienter än UK patienter. Tvillingstudier har kunnat påvisa ett genetiskt upphov till CS [7, 10, 11 ]. Ärftligheten har kopplats till bland annat kromosom 16 [10, 11], på vilken man genom kartläggning fann genen

NOD2/CARD15. Av de genetiskt mest betydande faktorerna till nedärvd CS har variation av NOD2/CARD15 genen visats vara den mest avgörande faktorn [11] och verkar vara specifik för CS patienter [12].

Miljöbetingade faktorer

Det har visats att de miljöbetingade faktorerna i sig inte framkallar sjukdom, vil-ket stöds av att sjukdomen sällan drabbar flera människor trots att de har levt ihop i samma miljö. Däremot har rökning visats ha en förvärrande effekt på Crohns sjukdomsförlopp [7, 10], uppkomst och främjande av recidiv [9].

Orala manifestationer

CS kan förutom de systemiska yttringarna även orsaka orala manifestationer, vil-ka inte alltid förekommer i samband med tarmsymtomen, utan vil-kan om de upp-kommer även föregå dessa med flera år [3, 7, 18]. De kan också uppstå parallellt med eller efter ett skov av CS i magtarmkanalen [3, 5]. Oral Crohns sjukdom (OCS) hos CS patienter har rapporterats förekomma i varierande grad, allt från 0,5 % - 80 % [7]. OCS har visats förekomma mer frekvent hos barn än vuxna [19, 20] och har rapporterats vara vanligare bland män än kvinnor av författare såsom Du-puy och Bradley et al. [3, 17, 20].

Oral makroskopisk symtombild

De vanligaste orala makroskopiska symtomen är e.g. svullna läppar (makrocheilit) och kinder, angulär cheilit, aftösa ulcerationer, kullerstensliknande uttryck i ging-ivan, djupa linjära ulcerationer (vanligast förekommande i omslagsvecket), slem-hinnegingivit [19], hyperplastiska slemhinneveck och slemhinneutskott (bild 1). Av dessa har hyperplastiska slemhinneveck visats vara patognomoniska för CS [21], liksom makrocheilit, kullerstensliknande uttryck, linjära ulcerationer och slemhinneutskott. [7]

De aftösa ulcerationerna nämns ofta i samband med CS. Afte har tidigare kopplats till ett tidigt sjukdomsstadium [22] men kan som markör vara

missvisan-9

de på grund av dess höga prevalens hos patienter med UK och hos befolkningen i helhet [19].

Oral histopatologisk symtombild

Den orala histopatologiska inflammationsbilden kännetecknar sig som infiltrat av lymfocyter samt epiteloidcelliga makrofager med eller utan jätteceller av Lang-hanstyp och förekomst av granulom (bild 2), som ibland omringas av lymfocyter i en tätare ansamling [18, Warfvinge G. personlig kommunikation]. Multinukleära jätteceller har nämnts vara talande för CS [23]. Inflammationsbilder med före-komst av neutrofiler, eosinofiler samt plasmaceller har också beskrivits [1].

Bild 1. (A) Svullen läpp. (B) Kullerstensliknande uttryck. (C) Linjär vestibulär ulceration. (D) Slem-hinnegingivit. (E) Hyperplastiska slemhinneveck. (F) Aftösa ulcerationer.

10

Epiteloidcelliga granulom anses vara en histopatologisk markör för CS [8,17], men avsaknad av dessa kan inte användas som sjukdomsexkluderande faktor [7], detta eftersom de inte alltid förekommer hos patienter drabbade av CS [8, 9].

Granulombildning. Det är främst makrofager och lymfocyter som är involverade i granulombildning, som är ett skyddande svar på e.g. infektioner och närvaro av kroppsfrämmande material. Efter att en mängd för makrofagerna icke nedbrytbara ämnen har ansamlats förlorar makrofagerna sin motilitet och börjar ansamlas. Därefter påbörjas modifiering till epiteloida celler, vilka kommer att utgöra gra-nulomen [10].

De epiteloida granulomen som ses vid CS är såkallade ”non caseating granu-loma” [4, 17], alltså inte ostiga granulom, och förknippas därmed inte med väv-nadsnekros. Sammansmältning av makrofagers cytoplasma kan också leda till bildning av jätteceller, vilka ses som stora multinuklerära celler [10] (bild 2A). Granulomen ses i ECG som också yttras i andra sjukdomars histopatologiska bild. Differentialdiagnoser för histopatologisk sjukdomsbild. Andra granulomatösa sjukdomar med liknande orala histopatologiska symtombilder innefattar Melkers-son-Rosenthal syndrom (MRS) och Meischer chelitis (chelitis granulomatosa). Dessa är de huvudsakliga differentialdiagnoserna vid frånvaro av magtarmsym-tom [17, 24] tillika sarkoidos [24]. Patienten får då den ospecifika diagnosen oro-facial granulomatos (OFG) [18,19], som även innefattar CS, MRS och sarkoidos. [17, 18, 21]. Granulomatösa inflammationer kan för övrigt också förekomma vid svampinfektioner, catscratch disease, tuberkulos, främmandekroppsreaktion samt vid Wegeners sjukdom [1] (se förklaringar sid 3), varför diagnos inte kan ställas enbart utifrån den histopatologiska sjukdomsbilden.

Diagnostik

Crohns sjukdom har i stor utsträckning samma symtom som andra inflammatoris-ka tarmsjukdomar (ITS), e.g. ulcerös kolit (UK). CS uppträder i skov och inflammatoris-kan visa flera olika symtom, vilket gör att sjukdomen är svårdiagnosticerad [7]. Detta med-för att flera år kan med-förlöpa innan diagnos fastställs [9].

Biopsier från tarmvävnaden tas i diagnostiskt syfte i vilka man efterlyser den specifika inflammationsbilden. Ibland kan åtkomsten för biopsitagning i tunntar-men vara problematisk på grund av förträngning av lutunntar-men, då man istället kan försöka ställa diagnos på colon [Bjelkenkrans K. personlig kommunikation]. Av störst vikt för definitiv diagnos är endoskopi och en eventuell röntgenundersök-ning som kan påvisa sårbildröntgenundersök-ning, ärrbildröntgenundersök-ning och inflammation i tarmvävnaden

Bild 2 (A) Langhanska jätteceller med perifert anordnade cellkärnor i anslutning till ett epiteloidcelligt granulom (se pilar). (B) Två epiteloidcelliga granulom (se pilar) samt infiltrat av lymfocyter i bindvä-ven.

11

[2]. Vid frånvaro av lumenförträngning och misstanke om tunntarmsinvolverad CS kan kapselendoskopi vara lämpligt. Röntgen tas framförallt vid förträngning av tarmlumen [7].

Om patientens orala biopsi påvisar en symtombild överensstämmande med CS men saknar symtom från magtarmkanalen sätter oralpatologerna, som tidigare nämnts, diagnosen idiopatisk OFG tills ytterligare symtom förenliga med Crohns sjukdom visar sig [18, 19].

Behandling

Behandlingen av inflammatoriska tarmsjukdomar syftar till att höja patientens livskvalitet och lindra besvär genom att stilla inflammationsprocessen, supprimera immunförsvaret, korrigera eventuell näringsbrist och förebygga komplikationer [4,7]. Eftersom ITS är kronisk erhåller patienterna vanligtvis livslång behandling [15].

De orala symtomen är ibland asymtomatiska och kan ibland självläka [19]. Genom tidigt insatt behandling är det möjligt att undvika ihållande smärta, svull-nad och estetiskt otillfredsställande symtom [19].

Systemisk behandling

Den systemiska behandlingen av Crohns sjukdom består av olika läkemedelsal-ternativ, kostrekommendationer och i sista hand kirurgisk behandling.

Läkemedelsbehandling. Systemisk behandling av CS innefattar immunosuppres-siva, antiinflammatoriska läkemedel eventuellt i kombination med steroider [4, 7, 17]. CS patienter kan också finna lindring av symtomen med hjälp av antidiuretis-ka, laxerande och smärtstillande läkemedel [7].

Antikroppar mot TNF-α (tumörnekrotiserande faktor-alfa) är ytterligare en immunosuppressiv behandlingsmetod, som dessvärre innebär ökad risk för malig-niteter [19], syftar till att hämma effekten av den kraftigt proinflammatoriska cy-tokinen TNF-α. Behandlingen har visats ge goda resultat gällande kontroll av överaktiva inflammationer hos patienter med inflammatoriska tarmsjukdomar [7, 10]. Den positiva behandlingseffekten ses framförallt hos patienter med CS. Dessvärre har effekten visats minska efter mindre än ett års tid [9].

Diet. Regression av sjukdom hos patienter med CS har visats kunna uppnås ge-nom kontroll av det orala födointaget eller gege-nom att ge födoersättning intrave-nöst, vilket skulle kunna förklaras av den då minskade och förändrade samman-sättningen av tarmfloran [9]. Symtomen associerade med CS har visats minska genom ett kvantitativt begränsat födointag och den därav reducerade tarmaktivite-ten [7].

Kirurgisk behandling. Kirurgi är indicerat om sjukdomen ej är mottaglig för medicinsk behandling och i de fall komplikationer såsom abscessbildning [7] ob-struktion av tarmlumen, blödning och perforation (exempelvis filstelbildning till hud eller andra organ) har utvecklats [4]. Kirurgisk borttagning av drabbade tarm-segment botar till skillnad från UK inte CS, eftersom recidiv av CS kan uppkom-ma i tidigare friska tarmsegment [9].

Lokal behandling

Lokal behandling kan bestå av injektion av steroider i de orala lesionerna alterna-tivt topisk behandling med exempelvis steroidpasta [7, 17, 19, 21, 25]. Av vikt är också att förbättra den orala hygienen [21].

12 Syfte och frågeställning

Syftet med studien är att med hjälp av monoklonal infärgning granska den his-topatologiska bilden av Crohns sjukdom i munhålan hos 17 patienter som med patologanatomisk diagnostik (PAD) knutits till diagnosen epiteloidcellig granu-lomatos (ECG). Detta med hopp om att förtydliga den specifika inflammations-bilden, med hänsyn till av makrofager bildade granulom, och för att eventuellt indikera att orala manifestationer och biopsier skulle kunna underlätta diagnosti-ken av Crohns sjukdom.

De orala kliniska symtomen skulle kunna observera tandläkaren på eventuellt misstanke om Crohns sjukdom och remittera patienten till en gastroenterolog, vilket vidare kan leda till tidigare diagnos och behandling.

Studiens frågeställning har inriktats på hur sjukdomen yttrar sig histopatolo-giskt i orala biopsier samt dess eventuella betydelse som bidrag till diagnosen Crohns sjukdom.

MATERIAL OCH METOD

I studien har orala vävnadssnitt färgats in med polymerbaserad immunohistoke-misk teknik. Metodvalet baseras på den specifika infärgningen som erbjuds av monoklonala infärgningsmetoder, dess minimala bakgrundsinfärgning samt visua-liseringssystemets amplifierande infärgning (se metod).

Material

Patienter och positiv kontroll

Den immunohistokemiska laborativa studien som utgör basen i arbetet har inklu-derat orala biopsier tillhörandes 17 patienter med PAD -diagnosen epiteloidcellig granulomatos. Det vill säga samtliga vävnadssnitt som var tillgängliga med denna diagnos förvarade i biobanken på avdelningen för oral patologi på Malmö Tand-vårdshögskola. Från patienturvalet erhölls 23 biopsier (12 av patienterna hade ett vävnadsprov, fyra patienter hade två och en patient hade tre vävnadsprov).

De formalinfixerade vävnadsbiopsierna var inbäddade i paraffin och snittades till en tjocklek av tre mikrometer. Från varje vävnadsbiopsi snittades tre exemplar för möjlighet till utprovning av optimal antikroppskoncentration och pilotstudie för infärgning.

Slutligen inkluderades endast 23 vävnadssnitt immunohistokemiskt infärgade med antikroppskoncentrationen 1:1000.

Det exkluderade materialet bestod av 31 reservsnitt som förblev utan infärg-ning, åtta snitt som färgades in med antikroppskoncentration 1:2000, fem snitt som inte blev acceptabelt infärgade med antikroppskoncentration 1:1000 och två snitt som ingick i en pilotstudie med avvikande antigen återskaffande metod (pro-teinkinas A i kombination med mikrovågor).

Patienternas remisser samlades in samt tillhörande tidigare hematoxylineosin (HTX-eo) infärgade vävnadssnitt från respektive biopsi, vilka användes som refe-rens vid mikroskopering.

Som positiv kontroll vid den immunohistokemiska infärgningen användes väv-nadssnitt från lymfatisk vävnad i form av tonsiller, för att kunna säkerställa kor-rekt prestanda för använda reagenser.

13

Infärgningsmaterial

Värmeinducerad epitopåtervinning i TEG-buffertlösning erhölls med hjälp av mikrovågor (MicroMED T/T Mega).

Till den primära antikroppsinfärgningen användes Monoklonal Mouse Anti-Human CD68, klon KP1 från DakoCytomation (Glostrup, DK). Endogent perox-idas blockerades med Dako REAL™ Peroxperox-idase-Blocking Solution kod S2023.

För visualisering användes ett kit från Dako REAL™ EnVision™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse. Detektionsreagensen (ENV) utgörs av en dextranryggrad varpå ett stort antal peroxidasmolekyler (upp till 100 HRP) och sekundära antikroppar (upp till 20 antikroppsmolekyler) har kopplats. Substratsy-stemet består av kromogenet diaminobensidinlösning (DAB) som ger brun färg och substratbuffert (väteperoxid) för spädning. [26]

Som motfärgning användes hematoxylininfärgning för att visualisera cellkär-norna, vilka då färgades blå. Xylen och etanol för dehydrering. Montering med xylenbaserat monteringsmedel för ljusmikroskopi (Mountex - HistoLab). Nikon Elipse 80i (ljusmikroskop) för mikroskopering och visualisering. Metod

Antikroppar

Antikroppar tillhör gruppen immunoglobuliner (Ig). Dessa proteiner som finns i blodet utsöndras av plasmaceller aktiverade av antigener [27].

Ig består av två olika par identiska kedjor varav två är lätta och två är tunga (figur 1). Kedjorna binds ihop och stabiliseras av kovalenta disulfidbryggor. De tunga kedjorna bestämmer molekylklass genom att uppvisa olika strukturella anti-gena egenskaper. De lätta kedjorna kan antingen vara av lambdatyp eller kappa-typ. Fördelningen av dessa typer skiljer sig mellan olika djurarter och inom de fem Ig-klasserna (IgG, IgA, IgM, IgD och IgE). [28].

Ig har till uppgift att igenkänna, neutralisera smittsamheten av- och märka in-vaderande mikrober för eliminering via olika effektormekanismer [29]. De verkar e.g. genom opsonisering, vilket medför ökad möjlighet till fagocytos och aktive-ring av komplementsystemet via den klassiska vägen [27].

Epitop/determinant

De molekyler som förekommer i kroppen är i sin helhet ofta för stora för Ig att binda till, varför de enbart igenkänner ett litet fragment på molekylen som be-nämns epitop eller determinant. Makromolekyler såsom polysackarider, proteiner

Figur 1 (A) Disulfidbindningar, (B) Lätt kedja, konstant region, (C) Lätt kedja, variabel region, (D) Tung kedja, variabel region, (E) Tung kedja, konstant region, (F) Antigen-inbindningsställe.

14

och nukleinsyror kan inneha flera epitoper, varav alla kan utgöra inbindningsställe för Ig [29].

CD68. Clusters of differentiation (CD) molekyler uttrycks på olika celler i im-munförsvaret och har i denna studie använts som antigen till de primära antikrop-parna. Receptorfamiljen ”scavenger receptor” till vilken CD68 tillhör är också en undergrupp till PRR, som beskrivits tidigare. Scavenger receptorerna utgör en stor grupp molekyler med olika strukturer och funktioner. Gemensamt innehar de funktionen att mediera upptaget av oxiderade lipoproteiner vid endocytos men innefattas också mediera fagocytos av olika mikrober [29].

DakoCytomations immunohistokemiska teknik med monoklonala antikroppar mot CD68 märker makrofager och andra celler med mononukleär fagocythär-komst. Cytoplasmiska granuler visar ett starkt uttryck av receptorn CD68, som också uttrycks svagt på ytan till makrofager, monocyter, neutrofiler, basofiler och NK-celler [30].

Immunohistokemi

I denna studie har immunohistokemisk teknik i form av EnVisionTM+ med mo-noklonala antikroppar använts. Denna infärgningsteknik utgör inte rutin vid dia-gnostik av ECG. Framställning av dessa sker genom en injektion av det önskade antigenet i ett djur, vanligtvis möss på grund av ekonomiska aspekter [28]. Detta orsakar en specifik immunoreaktion då lymfocyter igenkänner den specifika epi-topen, börjar profiliera och bilda kloner. Därefter utvinns B lymfocyter från dju-rets mjälte [31] eller lymfknutor och sammansmälts med myelomceller, vilka då kallas hybridom [28]. Hybridom besitter B-cellens antikroppsbildande kapacitet och tumörcellens odödlighet. Dessa kan vidare klonas och ge antikroppsproduk-tion i stort sett obegränsade kvantiteter [28, 31]. EnVision TM+som har använts i denna studie är en indirekt immunohistokemisk metod som bygger på användan-det av monoklonala primära antikroppar vilka binder till och märker önskad epi-top, i detta fall receptor CD68. Till de primära antikropparna fäster de sekundära antikanin eller antimus antikropparna, vilka är sammankopplade med en dextran-polymer på vilken horseradish peroxidas (HRP) är fästa (figur 2). HRP är ett en-zym som klyver ett kromogensubstrat (pigment) efter applicering varpå makrofa-ger färgas. För en utförlig metodförklaring hänvisas till bilaga 1.

Figur 2. Tvåstegs polymermetod – EnVision TM+ [28]. Figuren visar antigenet till vilken den primära antikroppen fäster, och vidare hur dextranpolymeren med flertalet enzymer och sekundä-ra antikroppar fäster till den primäsekundä-ra antikroppen.

15

Bild 3 (A) Hematoxylineosin infärgning (HTX-eo). (B) Immu-nohistokemisk infärgning med monoklonala antikroppar mot CD68; (x) makrofagansamling (y) epiteloidcelligt granulom (z) jättecell.

De infärgade vävnadssnitten har granskats under ljusmikroskop av två observa-törer. Faktorer såsom infärgningsteknikens genomslag, användbarhet och den epi-teloidcelliga inflammationsbilden (med främsta hänseende till förekomst av mak-rofagansamlingar, epiteloidcelliga granulom och jätteceller) har noterats och vida-re jämförts.

RESULTAT

Resultatet av den immunohistokemiska infärgningstekniken med monoklonala antikroppar mot CD68 visade en specifik infärgning och tydliggjorde den typiska inflammationsbilden med e.g. makrofagansamlingar, jätteceller och epiteloidcelli-ga granulom (bild 3) i jämförelse med motsvarande rutininfärepiteloidcelli-gade snitt (HTX-eo).

16

Makrofagansamlingar. I de immunohistokemiskt infärgade snitten visades mak-rofagansamlingarna tydligt i form av högre kromogen-koncentration i förhållande till omkringliggande vävnad (vilket åskådliggörs i bild 3B och 4A).

I detta hänseende är de CD68 infärgade snitten fördelaktiga i jämförelse med de HTX-eo infärgade snitten, i vilka makrofagansamlingar är svårare att urskilja. (I 20 av 23 snitt förekom ansamlingar.)

Jätteceller. CD68 infärgningen ansågs åskådliggöra jätteceller likvärdigt med HTX-eo infärgningen (bild 2 A, 3 och 5) i de snitt där jätteceller förekom. (I 13 av 23 snitt förekom jätteceller.)

Epiteloidcelliga granulom. Granulomen är synliga med HTX-eo infärgning (bild 2) och visades i studien markeras tydligt med CD68 infärgning (bild 4 B), vilken också bedömdes underlätta registrering av mindre granulom.

I 14 av 23 snitt sågs tydliga epiteloidcelliga granulom. I 12 av 23 snitt kunde man med hjälp CD68 infärgningen urskilja koncentrationer av makrofager i ett stadie som skulle kunna vara påbörjan till granulombildning. Makrofagerna före-kom i en mer organiserad form än i ansamlingarna och celler med större cyto-plasma kunde ses (bild 4 A).

Bild 4 (A) Makrofagansamlingar i bindväv, infärgade med anti CD68 (se pil). (B) Granulom i bindväv infärgade med anti CD68 (se pilar).

17

Epiteloidcellig granulomatos. CS specifika inflammationsbild yttrar sig som epiteloidcellig granulomatos. Denna har i studiens orala biopsier uppvisats med en representativ bild av lymfocytinfiltrat, makrofager (också förkommande i

ansamlingar), multinukleära jätteceller ofta i anslutning till eller i de epiteloid-celliga granulomen.

I 7 av snitten tog infärgningen ojämnt över vävnaden. Detta visades framförallt som svag infärgnig eller avsaknad av infärgning i periferin. I 17 av snitten kunde svagt ljusbruna artefakter urskiljas. 15 av snitten uppvisade dessa i epitelet.

DISKUSSION

Den immunohistologiska infärgningen som användes i denna studie utgör inte rutin vid diagnostik av ECG. Användandet av monoklonala antikroppar är en dyr men tillförlitlig infärgningsteknik.

I de snitt som erhöll en acceptabel infärgning underlättade infärgningstekniken lokalisering av granulom, jätteceller samt makrofagansamlingar (bild 4 och 5). Detta kan tänkas vara till stor hjälp i snitt vars histopatologiska inflammationsbild är svårtydd i en rutininfärgning (HTX-eo) samt underlätta diagnosticering; exem-pelvis då misstanke om OCS föreligger med orala makroskopiska symtom. Detta genom att tydligare åskådliggöra ansamlingar av makrofager, mindre granulom och påbörjan till granulom. Därmed skulle oralpatologen kunna ställa diagnosen ECG och utesluta andra sjukdomstillstånd.

Både multinukleära jätteceller och epiteloidcelliga granulom kan tydligt urskil-jas i båda infärgningarna (bild 2 och 5). Däremot visades CD68 infärgningen ge en tydligare bild av makrofagansamlingar än HTX-eo infärgningen, vari ansam-lingarna kan vara svåra att urskilja. Därtill försäkras observatören om att gra-nulomen består av modifierade makrofager.

Infärgningstekniken utfördes manuellt på laboratorium, vilket innebär risk för metodavvikelser till följd av den mänskliga faktorn. Resultatet av infärgningen visades vara ojämn trots noga utförande. Avsaknaden av infärgning, framförallt förekommande i vävnadssnittens periferi, kan tänkas bero på att snittet hunnit torka under förbehandlingsprocessen och därmed inte kunnat vätas av infärg-ningsvätskorna. Detta är ett av fabrikören DakoCytomation känt problem (även vid maskinell infärgning) och metoder för att komma underfund med problemet är under utredning. De svagt ljusbruna artefakter, som framförallt förekom i epitelet, förklaras av molekylstorleken på dextranpolymeren (se dextranbackbone, figur 1) och dess hydrofoba natur. Storleken och hydrofobiciteten gör att molekylen tende-rar att bli ”klibbig”. Problemet skulle kunna åtgärdas genom att lägga till flera

Bild 5 (A) Granulom med tre jätteceller (se pilar) infärgade med anti CD68. (B) Granulom med cen-tral jättecell infärgade med anti CD68.

18

sköljningar efter appliceringen av den sekundära antikroppen (bilaga 1 steg 12), tillsätta Tween (detergent) för att minska glasets ytspänning eller öka tiden för sköljning efter detta steg [mailkorrespondens Kiiveri P. Malmö tandvårdshögsko-las kontaktperson på DakoCytomation]. Den felaktiga infärgningen saknar emel-lertid relevans för studiens resultat, eftersom artefakterna kan urskiljas från den specifika infärgningen av CD68. Detta genom utbredningen, den avvikande sva-gare nyansen och den vanliga placeringen i epitelet var de epiteloidcelliga gra-nulomen inte förekommer.

Infärgning med monoklonala antikroppar är en tillförlitlig metod som genom EnVisionTM+ systemets indirekta infärgningsteknik möjliggör selektiv infärgning av CD68. EnVisionsTM+ systemets dextran polymerer möjliggör högre färgkon-centration på markerade områden, eftersom fler enzym kan verka på dessa. Ytter-ligare en positiv egenskap utgörs av det faktum att systemet använder sig av se-kundära antikroppar (mot kanin- eller musantikroppar) [28], vilket medför att ett stort urvals spektra av primära antikroppar från olika fabrikörer är att tillgå. Alltså är inte användaren lika begränsad av fabrikörernas utbud av primära antikroppar, som vid användning av den direkta polymerbaserade immunohistokemiska in-färgningstekniken.

I studien jämfördes, som tidigare nämnts, de immunohistokemiskt infärgade vävnadssnitten med tidigare hematoxylininfärgade vävnadssnitt (bilder ovan) för att kunna bedöma resultatet av CD68 infärgningen. Strukturerna i snitten är inte helt jämförbara då snittens djup i biopsin varierade. Detta antas bero på att av-verkning av biopsin vid varje snittningstillfälle, i syfte att åstadkomma en jämn snittyta, har medfört att de HTX-eo infärgade snitten och snitten använda i denna studie togs från olika djup i vävnaden. Detta innebär alltså att samma inflamma-tionsbild inte alltid är entydig i snitt kommande från samma patient.

Om patognomoniska fynd ses vid den orala undersökningen är biopsi indicerad [7]. Den granulomatösa inflammationsbilden har beskrivits vara den samma i munnen som i resten av magtarmkanalen [4,5,15].

Makrofagansamlingar har noterats i snitt från den CS inflammerade tarmväv-naden, vilket då har associerats med ett tidigt sjukdomsstadium [22]. Ansamlingar av makrofager har även visats i de flesta CD68 infärgade orala snitten i denna studie. Ansamlingarna skulle med tanke på granulombildningen kunna observera oralpatologerna på en påbörjad utveckling av ECG och misstanke om CS. Detta kan vidare leda till tidigare ställd CS diagnos av gastroenterologerna [19], genom att patienten erhåller tidigare remiss vid förekomst av gastrointestinala symtom. Vidare skulle ett samarbete mellan tandläkare och gastroenterolog kunna upprät-tas [1] för att erbjuda patienten en fullgod heltäckande behandling [5, 19]. Även med tanke på att identifieringen av de orala symtomen kan tänkas vara svår för vårdpersonal utan specifik kunskap om munhålan, e.g. allmänläkare [19].

De orala symtomens betydelse för CS diagnostiken styrks e.g. av rapporter som visar att patienter med en oral granulomatös inflammationsbild, men utan tarm-symtom, diagnosticerats med CS genom ileokolonoskopi och röntgendiagnostik till följd av att orala symtom upptäckts [19]. I enlighet med detta kan upptäckten av OCS tyckas vara av extra betydelse för dem vars orala symtom föregår de gast-rointestinala symtomen, vilket visats kunna förekomma i flera studier [1, 3, 7,18] varför symtomens betydelse för tidig diagnos [1] bör uppmärksammas.

Fördelarna med inklusion av OCS i CS diagnostiken utgörs utöver det som redan nämnts av att munhålan är lättåtkomlig för biopsitagning [19, 25], visuell undersökning [19], till skillnad från tarmen, samt de vanligtvis rutinmässiga tand-läkarbesöken. Dock inkluderar CS diagnostiken varken orala manifestationer eller biopsier i Sverige idag.

19

Denna studie uppmärksammar OCS och dess relation till CS i övrigt samt ger en indikation på att samarbetet mellan gastroenterologer och tandläkare skulle kunna vara av betydelse för diagnostiken. Detta framförallt då det har framkom-mit att läkare inte alltid känner till att tandläkare skulle kunna erbjuda hjälp i dia-gnostiken av Crohns sjukdom [5].

Fortsatt metodutveckling för att övervinna de brister som dextranpolymeren ger upphov till samt den ännu oförklarade avsaknaden av infärgning som visats i vissa vävnadssnitt skulle vara önskvärt. Nästa steg skulle kunna vara studier med fokus på fördelarna av ett upprättat samarbete mellan tandläkare och gastroentero-loger för att underlätta diagnosticering och möjliggöra tidigare diagnos. Ytterliga-re intYtterliga-ressanta frågeställningar berör eventuell koppling mellan föYtterliga-rekomst av OCS och samtidigt skov av CS, eller ett möjligt samband mellan OCS och lokalisering av CS-skov i tarmkanalen.

KONKLUSION

I Sverige lider ca 0,2 % av befolkningen av Crohns sjukdom, som är en ännu inte etiologiskt klarlagd multifaktoriell sjukdom med autoimmuna, ärftliga och miljö-betingade påverkande faktorer. Sjukdomen kan orsaka orala makroskopiska mani-festationer ofta associerade med CS och orala biopsier kan uppvisa en histopato-logisk bild av epiteloidcellig granulomatos med lymfocytinfiltration, makrofagan-samlingar, jätteceller och epiteloidcelliga granulom, vilka har ansetts typiska för CS.

Diagnos av CS fastställs genom endoskopi, röntgenundersökning eller biopsi från tarmvävnad vari man eftersöker den specifika inflammationsbilden. Trots att diagnos inte enbart kan fastställas från orala biopsier, skulle dessa kunna bidra till tidigare diagnos. Studien visar att den representativa inflammationsbilden även kan ses i munhålan, vilket indikerar att vävnadsrepresentation från biopsier med orala manifestationer kan signalera misstanke om Crohns sjukdom. Inflamma-tionsbilden har i studien förtydligats med hjälp av immunohistokemisk makrofa-ginfärgning. Då munhålan med sin lättillgänglighet möjliggör okomplicerad visu-ell undersökning och biopsitagning samt då besök hos tandläkare utförs rutinmäs-sig, kan detta bistå med klinisk information samt histopatologiska kännetecken för att leda diagnosticeringen framåt och minska patienternas lidande genom tidigare insatt behandling, varför ett samband mellan tandläkare och läkare förespråkats.

20

REFERENSER

1. Ojha J., Cohen D. M., Islam N. M., Stewart C. M., Katz J., Bhattacharyya I. Gingival involvement in Crohn disease. J.Am.Dent.Assoc. 2007

Dec;138(12):1574-81; quiz 1614-5.

2. Danielsson Åke. Invärtesmedicin. 8 red. Lund: Hedner Pavo Lars; 2004. 3. Dupuy Alain, Cosnes Jacques, Revuz Jean, Delchier Jean-Charles, Gendre

Jean P., Cosnes Anne. Oral Crohn Disease: Clinical Characteristics and Long-term Follow-up of 9 Cases. Arch.Dermatol. 1999 April 1;135(4):439-442. 4. Ganesh R., Suresh N., Ezhilarasi S., Rajajee S., Sathiyasekaran M. Crohn's

disease presenting as palatal ulcer. Indian J.Pediatr. 2006 Mar;73(3):229-231. 5. Katz J., Shenkman A., Stavropoulos F., Melzer E. Oral signs and symptoms in relation to disease activity and site of involvement in patients with inflamma-tory bowel disease. Oral Dis. 2003 Jan;9(1):34-40.

6. Lourenco S. V., Hussein T. P., Bologna S. B., Sipahi A. M., Nico M. M. Oral manifestations of inflammatory bowel disease: a review based on the observa-tion of six cases. J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol. 2010 Feb;24(2):204-207. 7. Fatahzadeh M. Inflammatory bowel disease. Oral Surg.Oral Med.Oral

Pa-thol.Oral Radiol.Endod. 2009 Nov;108(5):e1-10.

8. Freeman H. J. Granuloma-positive Crohn's disease. Can.J.Gastroenterol. 2007 Sep;21(9):583-587.

9. Shoenfeld Yehuda, Rose Noel R. Infection and autoimmunity. Amsterdam: Elsevier; 2004.

10. Rubin Raphael, Strayer S., David. Rubin's Pathology: clinicopathologic foun-dations of medicine. 5 red. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2008.

11. Van Limbergen J., Wilson D. C., Satsangi J. The genetics of Crohn's disease. Annu.Rev.Genomics Hum.Genet. 2009;10:89-116.

12. Masters S. L., Simon A., Aksentijevich I., Kastner D. L. Horror autoinflam-maticus: the molecular pathophysiology of autoinflammatory disease (*). An-nu.Rev.Immunol. 2009;27:621-668.

13. Lapidus A. IBD ökar starkt - ännu oklart varför. 2009;106(45):2980-2982. 14. Lapidus A. Crohn's disease in Stockholm County during 1990-2001: an

epi-demiological update. World J.Gastroenterol. 2006 Jan 7;12(1):75-81. 15. Glaudemans A. W., Maccioni F., Mansi L., Dierckx R. A., Signore A.

Imag-ing of cell traffickImag-ing in Crohn's disease. J.Cell.Physiol. 2010 Jun;223(3):562-571.

21

16. Vavricka S. R., Rogler G. New insights into the pathogenesis of Crohn's dis-ease: are they relevant for therapeutic options? Swiss Med.Wkly. 2009 Sep 19;139(37-38):527-534.

17. Bradley P. J., Ferlito A., Devaney K. O., Rinaldo A. Crohn's disease manifest-ing in the head and neck. Acta Otolaryngol. 2004 Apr;1243):237-241.

18. Odell E. W., Morgan P. R. BIOPSY PATHOLOGY OF THE ORAL TIS-SUES. 1 red. London: Chapman & Hall; 1998.

19. Rowland M., Fleming P., Bourke B. Looking in the mouth for Crohn's disease. Inflamm.Bowel Dis. 2010 Feb;16(2):332-337.

20. Knuuttila M., Tervonen T., Pernu H. Allmänsjukdomar som predisponerande faktorer vid parodontala förändringar. 2004(Tandläkartidningen årg 96 nr 2):36-44.

21. Lindhe Jan, Lang P., Niklaus, Karring Thorkild. Clinical Periodontology and Implant Dentistry. 5 red. Oxford: Blackwell Munksgaard; 2008.

22. Sankey E. A., Dhillon A. P., Anthony A., Wakefield A. J., Sim R., More L., et al. Early mucosal changes in Crohn's disease. Gut 1993 Mar;34(3):375-381. 23. Gargiulo A. V., Ladone J. A., Toto P. D., Logiudice J. Crohn's disease: early

detection by gingival biopsy. Periodontal Case Rep. 1989;11(1):20-22. 24. William T., Marsch W. C., Schmidt F., Kreft B. Early oral presentation of

Crohn's disease. J.Dtsch.Dermatol.Ges. 2007 Aug;5(8):678-679.

25. Daley T. D., Armstrong J. E. Oral manifestations of gastrointestinal diseases. Can.J.Gastroenterol. 2007 Apr;21(4):241-244.

26. DAKOCytomation. Metodförklaring: Dako REAL™ EnVision™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse K5007. 201205 (Third edition). 27. Widmaier Eric P., Raff Hershel, Strang Kevin T., Vander Arthur J. Vander's

Human Physiology :the mechanisms of body function. 11 red. Boston: McGraw-Hill Education; 2008.

28. Atwood Karen, Bisgaard Kirsten, Bloom J. K., etc. Education Guide: Immu-nohistochemical Staining Methods. 4 red. California: DAKO; 2006.

29. Abbas Abul K., Lichtman Andrew H., Pillai Shiv. Cellular and molecular im-munology. 6 red. Philadelphia: Saunders/Elsevier; 2007.

30. DAKOCytomation. Produktblad: Monoclonal Mouse Anti-Human CD68. 2003 20-01-03.

31. Carson Freida L. Histotechnology :a self-instructional text. 2 red. Chicago: ASCP Press; 1997.

22

32. Collin P. H. Medicineengelsk-svensk-engelsk. Stockholm: Norstedt; 1992. 33. Regezi Joseph A., Sciubba James J., Jordan Richard C. K. Oral pathology:

clinical pathologic correlations. 5 red. Philadelphia, Pa.; Edinburgh: Elsevier Saunders; 2008.

Bilaga 1

Immunohistokemi CD68 - metodbeskrivning

1. Förberedelser:

Paraffinblocken innehållandes vävnadsbiopsierna snittas till 3 µm. Vätskorna (se nedan) rumstempereras.

2. Avparaffinering av snitt:

a. 2 x 10 min i xylenbad (under tiden förbereds 750 ml TEG buffert för

sena-re användning, se antigensena-retrieval)

b. 2 x 5 min i absolut alkohol (99% alkohol) c. 2 x 3 min i 96% alkohol

d. 5 min i destillerat vatten

3. Antigen retrieval:

Sätt glasen i TEG buffertlösning i en buffertbehållare, placera i mikro-vågsugn. Program val: antigen retrieval (98C-S3m 40s- 700 ml) i 25 min

4. Svalna

Ta ut bägaren från mikrovågsugnen och låt svalna i 20 min. Antikroppslösning - spädning

Undertiden utförs spädning av antikroppslösningen 1:1000 med antibody-diluent enligt följande:

1 ml (1:500) CD68 antikroppslösning + 1 ml spädningsvätska (antibody diluent DAKO) = 2 ml 1:1000 CD68 antikroppslösning.

5. Inkubering – TRIS

Inkubera glasen i destillerat vatten i 5 min. Överför glasen till TRIS i 5 min.

- Förbered under tiden fuktkammare

6. Paraffinring - BSA/TRIS – fuktkammare

Torka glasen runt vävnaden, rita en ring kring vävnaden mha paraffinpen-na. Se till så att paraffinet lägger sig utanför snittets infärgningsyta i ett jämntjockt lager utan avbrott.

Tillsätt BSA/TRIS – 100µl per vävnadssnitt . Inkubera 5 min i fuktkam-mare.

7. Inkubering - TRIS

Skölj bort BSA/TRIS med TRIS-lösning, inkubera 2 x 3 min i separata TRIS kyvetter.

8. Antikropp – CD68

Torka av glasen och lägg dem därefter i fuktkammare.

Tillsätt 100 µl primär-antikropps-lösning med CD68 monoklonal mouse antihuman spädning 1:1000 (med antibodydiluent) per snitt.

Låt stå i 25 min. 9. Inkubera i TRIS

Bilaga 1

10. HPBK – Väteperoxidas blocking solution

Torka av glasen. Lägg i fuktkammare. Tillsätt 150µl HPBK per vävnads-snitt. Låt stå 5 min.

11. Inkubera i TRIS

Skölj glasen med TRIS-lösning och inkubera därefter 2 x 3 minuter i TRIS-lösning.

12. ENVISION – sekundär antikropp märkt med HRP

Torka av glasen. Lägg i fuktkammare.

Tillsätt 4 droppar lösning med sekundärantikropp (ENV) och inkubera i 20 min.

Förbered spädning av DAB (kromogen) lösning (1:50) ca 7 minuter innan gången inkuberingstid för ENV.

Ex för 16 glas:

48µl DAB (diaminbenzidin) + 2400 µl substratbuffert (väteperoxidas).

13. Inkubera - TRIS

Skölj av glasen och inkubera 2 x 3 min i TRIS-lösning.

14. Tillför DAB lösning

Torka glasen runt snittet, lägg dem i fuktkammare och tillsätt 100 µl kro-mogen per vävnadssnitt (DAB + substratbuffert). Inkubera i 15 min.

15. Inkubera - TRIS

Skölj med destillerat vatten, inkubera i TRIS-lösning i 5 min.

16. Hematoxylin

Torka av glasen och lägg dem i fuktkammare. Tillsätt 150 µl hematoxylin per vävnadssnitt. Låt stå i 2 minuter.

17. Dehydrering & Montering

Skölj glasen med destillerat vatten. Inkubera i destillerat vatten i 3 min. a. Dehydrera i alkohol 96 % i 3 min

b. Dehydrera i absolut alkohol 99 % i 2 min.

Montering med xylenbaserat monteringsmedel för ljusmikroskopi (Mountex – HistoLab).