Examensarbete i biomedicinsk vetenskap Malmö universitet
UTVECKLING AV METODER FÖR ATT ANALYSERA ”C5
NEPHRITIC FACTORS” (C5NEF)
FILIPPA BÄCKSTRÖM
UTVECKLING AV METODER FÖR ATT ANALYSERA ”C5
NEPHRITIC FACTORS” (C5NEF)
FILIPPA BÄCKSTRÖM
Bäckström, F. Utveckling av metoder för att analysera ”C5 Nephritic Factors”
(C5NeF). Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för Biomedicinsk vetenskap, 2021.
Normalt sett skyddar komplementsystemet kroppen mot infektioner och
patogener. Vid vissa typer av njursjukdomar, framför allt vid C3-glomerulopati, förekommer autoantikroppar som kallas ”nephritic factors” (NeF). Sådana
antikroppar stabiliserar enzymkomplex (konvertas) i komplementsystemet, vilket leder till destruktiv komplementaktivering via den alternativa vägen. Syftet med studien var att utveckla minst en metod för att analysera C5NeF på kliniska prover.
C5NeF In-House ELISA analyserade bindning av C5NeF till C5-konvertas.
Analys av C5-klyvning i löslig fas kvantifierade mängden C5a som bildats vid stabilisering av C5-konvertas. Cut-off för analyserna bestämdes genom analys av prover från 20 friska blodgivare. Tolv patientprover med möjlig förekomst av C5NeF analyserades. För att utesluta falskt positiv reaktion i C5NeF in-house ELISA analyserades även förekomst av antikroppar mot specifika enskilda komplementproteiner.
Åtta patientprover var positiva i C5NeF In-House ELISA, fem patientprover uppvisade positivt resultat för C3NeF, vilket inte var oväntat utifrån tidigare publikationer som visat att det är vanligt att patienter med C5NeF också ofta är positiva för C3NeF. Tre patientprover erhöll positivt resultat i endast C5NeF In- House ELISA och två av dessa var positiva i analys av C5-klyvning i löslig fas.
Studien resulterade i etablering av en metod för analys av C5NeF.
Nyckelord: C3-glomerulopati, C3 Nephritic factor, C5-konvertas, C5 Nephritic factor, ELISA, Komplementsystemet.
DEVELOPMENT OF METHODS FOR ANALYSIS OF ”C5
NEPHRITIC FACTORS” (C5NEF)
FILIPPA BÄCKSTRÖM
Bäckström, F. Development of methods for analysis of ”C5 Nephritic Factors”
(C5NeF). Degree project in Biomedical Science 15 Credit points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, 2021.
Normally the complement system protects the body from infections and pathogens. In certain types of kidney diseases, mainly C3-glomerulopathy,
autoantibodies called ”Nephritic Factors” (NeF) are found. NeFs stabilize enzyme complexes (convertases) in the complement system, an event which leads to destructive complement activation via the alternative pathway. The purpose of this study was to develop at least one method to analyse C5NeF on clinical samples.
C5NeF In-House ELISA analysed binding of C5NeF to C5 convertases. Analysis of C5-cleavage in the soluble phase measured the amount of C5a formed when C5-convertase was stabilized. Cut-off for the analyses was determined through analysis of 20 blood donor samples from healthy individuals. Twelve patient samples with possible C5NeF were analysed. To exclude false positive results in C5NeF In-House ELISA analysis of antibodies against specific single
complement factors was performed.
Eight patient samples were positive in C5NeF In-House ELISA, five patient samples showed positive result for C3NeF, a finding which was not unexpected as previous publications have shown that concomitant presence of C3NeF and C5NeF is common in C3-glomerulopathy. Where most patients are positive for both C3NeF and C5NeF. Three patient samples received positive result in only C5NeF In-House ELISA and two of these samples were positive in the analysis of C5-cleavage in soluble phase. In conclusion, in this study a method to examine C5NeF was developed.
Keywords: C3-glomerulopathy, C3 Nephritic factor, C5-convertase, C5 Nephritic Factor, ELISA, Complement system
FÖRORD
Jag vill ödmjukast tacka mina handledare Lillemor Skattum och Anci Verlemyr för rådgivning, vägledning och stöd, samt ert förtroende att låta mig utveckla analysmetod för C5NeF hos er. Jag vill även tacka övrig personal på Klinisk Immunologi i Lund för trevligt bemötande och inkluderande av mig som student.
Jag vill dessutom uttrycka min tacksamhet till Dr. Yuzhou Zhang vid Molecular Otolaryngology and Renal Research Laboratories, Iowa University, Iowa City, USA för generositet med två positiva prover.
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
BAKGRUND ... 5
Komplementsystemet ... 5
C3 Nephritic factors & C5 Nephritic factors ... 6
C3-glomerulopati ... 6
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ... 7
Syfte ... 7
MATERIAL OCH METOD ... 7
Etisk bedömning och urval av prover ... 7
Material ... 7
Metod ... 8
RESULTAT ... 10
In-House ELISA för C5NeF ... 10
C5-klyvning i löslig fas ... 12
C3NeF ELISA ... 12
Analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner ... 13
DISKUSSION ... 14
Metoddiskussion ... 14
Resultatdiskussion ... 16
SLUTSATS ... 17
REFERENSER ... 18
BAKGRUND
Komplementsystemet är ett komplext proteinsystem som är en del av immunförsvaret. Vid felaktig reglering eller brist på specifika
komplementproteiner kan olika typer av sjukdomar uppstå. C3-glomerulopati (C3G) är ett samlingsnamn för en grupp njursjukdomar med autoimmun och genetisk orsak. Vid sjukdomar inom C3G förekommer autoantikroppar, ”nephritic factors” (NeF), som stabiliserar konvertas i komplementsystemet [1].
Komplementsystemet
Komplementsystemet är ett komplext proteinsystem som karaktäriseras av kaskadreaktioner och kan aktiveras genom tre olika vägar: klassiska vägen, lektinvägen och alternativa vägen. Proteinerna i komplementsystemet kan vara lösliga eller membranbundna, de lösliga proteinerna samverkar främst i
kaskadreaktioner och membranbundna proteiner ansvarar för reglering av aktivering. Ett normalt fungerande komplementsystem är optimalt för kroppens försvar mot infektioner, genom att komplementproteinerna underlättar fagocytos, bidrar till aktivering och effektivisering av det förvärvade immunförsvaret, samt bidrar till bortrensning av apoptotiska celler och immunkomplex. Vid rubbningar i komplementsystemet kan funktionen av komplementproteinerna ökas eller
minskas, vilket kan innebära ett överaktivt komplementsystem eller ett icke- fungerande komplementsystem [2-4].
Den klassiska vägen består av proteinerna C1, C4 och C2, lektinvägen utgörs av mannosbindande lektin, mannosbindande lektin-associerade serinproteaser (MASP-molekyler), C4 och C2, alternativa vägen innehåller proteinerna C3, Faktor B, Faktor D och properdin. Proteinet C3 uppnår aktivering genom alla aktiveringsvägar och är dominerande i komplementsystemet.
Komplementsystemets avslutande fas kallas terminala sekvensen och består av C5, C6, C7, C8 och C9, som slutligen bildar det cytotoxiska membrankomplexet (MAC/C5b-9) [2-4].
Alternativa vägen och lektinvägen är del av det medfödda immunförsvaret och aktiveras direkt i kontakt med patogener. Den klassiska vägen är en
effektormekanism av det förvärvade immunförsvaret och aktiveras i samband med att antikroppar bundit till antigen. Lektinvägen aktiveras genom mannos och liknande kolhydrater som finns på ytan av vissa mikroorganismer [2-4].
Vid aktivering av alternativa vägen hydrolyseras C3 spontant till C3(H2O) och kan beroende på miljö och omgivning aktiveras eller inhiberas. Faktor H inhiberar C3(H2O). Vid aktivering interagerar C3(H2O) med Faktor B och bildar
komplexet C3(H2O)B, vilket möjliggör att Faktor D klyver Faktor B och
komplexet C3(H2O)Bb bildas, som klyver C3 till C3a och C3b. C3b kan därefter aktiveras av Faktor B och bilda komplexet C3bB, även detta komplex interagerar med Faktor D varvid Faktor B klyvs, vilket skapar komplexet C3bBb, som kallas C3-konvertas och kan klyva C3 till C3a och C3b. Förloppet möjliggör en
förstärkning av immunsvaret då bildning av C3b genererar ökad klyvning av C3 och därmed mer C3b. Properdin är ett reglerprotein för den alternativa vägen, som binder till C3-konvertas , förlänger halveringstiden för detta komplex och bidrar till ökad effektivitet av den alternativa vägen [2-5].
Klassiska vägen och lektinvägen genererar istället C4bC2a, ett annat komplex kallas trots allt också kallas C3-konvertas. Den terminala sekvensen inleds genom att C3b binder in till C3-konvertaset (C4bC2a för klassiska vägen och lektinvägen resp. C3bBb för alternativa vägen) och bildar C5-konvertas (C4bC2aC3b(n) för klassiska vägen och lektinvägen resp. C3bBbC3b(n) för alternativa vägen). Det nybildade komplexet kan klyva C5 i två fragment; C5a och C5b. C5b-fragmentet bildar därefter komplex med C6 och C7 och slutligen binds C8 och C9 in till komplexet och bildar C5b-9 (MAC). MAC ger upphov till lysering av celler genom att bilda porformade skador på cellmembranet, vilket förstör cellens osmotiska reglering. C5a och C3a aktiverar granulocyter, monocyter och mastceller och verkar kemotaktiskt för fagocyter.
C5a orsakar ytterligare skada på redan skadad vävnad genom att aktivera neutrofila granulocyter och dendritiska celler som ansamlas i den skadade vävnaden och frisläpper toxiner och proteaser [2-5].
C3 Nephritic factors & C5 Nephritic factors
C3 Nephritic Factors (C3NeF) är autoantikroppar av IgG-klass (troligen främst IgG1 och IgG3) mot den alternativa vägens C3-konvertas (C3bBb). Vid
inbindning av C3NeF till C3-konvertas stabiliseras konvertaset, vilket resulterar i ökad klyvning av C3 till C3a och C3b. Vanligtvis beror en sänkning av C3 hos patienter med C3G på förekomst av C3NeF i cirkulationen [2,4,6]. C3NeF stabiliserar inte enskilda komponenter av C3-konvertaset, utan stabiliserar hela komplexet. Halveringstiden för C3-konvertaset ökar i samband med
stabiliseringen från ett par sekunder till eventuellt några timmar. C3NeF och properdin binder till C3-konvertaset på liknande vis, däremot blockerar C3NeF regulatorproteinerna Faktor H och komplementreceptor 1 (CR1) [1, 4-5].
C5 Nephritic Factors (C5NeF) är autoantikroppar av IgG-klass som stabiliserar C5-konvertas. C5b-9 nivån i blodet ökar vid närvaro av C5NeF. C5NeF, liksom C3NeF är vanligt förekommande hos patienter med C3G [4-6].
C3-glomerulopati
C3-glomerulopati (C3G) är ett samlingsnamn för njursjukdomar som beror på dysfunktionalitet i alternativa vägen på grund av autoimmun- och genetisk orsak.
Vid tillståndet förekommer autoantikroppar, ”nephritic Factors” (NeF), som stabiliserar konvertas. Sjukdomstillståndet innefattar symptom såsom hematuri (blod i urin), proteinuri (protein i urin), leukocyter i urin, minskad urinproduktion och högt blodtryck. Det är vanligt att personer med sjukdomen utvecklar njursvikt och är i behov av dialys eller transplantation.
Sjukdomen diagnostiseras vanligen genom att undersöka morfologiska förändringar; proliferation av glomerulära celler och förtjockning av det
glomerulära basalmembranet i njurarna, troligen orsakade av felaktiga nivåer av C3b, C3a, C5a och C5b-9. Vid tillståndet förekommer dessutom minskade nivåer av immunglobuliner på grund av proteinförlust via urinen (nefros).
C3G delas huvudsakligen in i Dense deposit disease (DDD) och C3-
glomerulonefrit (C3GN). DDD och C3GN har olika utseende vid undersökning av njurbiopsi och kan utifrån karaktäristiska drag diagnostiseras, men symptom och sjukdomsbild är liknande för DDD och C3GN [1, 5].
I en studie av Marinozzi et al. 2017 [5] undersöktes 127 patienter med C3G. I undersökningen var 28,8 % av patienterna positiva för endast C3NeF, 10,2 % av
patienterna var positiva för endast C5NeF och 39 % var dubbelpositiva, vilket innebär att patienterna var positiva för både C3NeF och C5NeF. 88 % av patienterna diagnostiserade med C3GN var positiva för C5NeF eller
dubbelpositiva, till skillnad från patienterna som diagnostiserats med DDD där endast 37 % var positiva för C5NeF eller dubbelpositiva [5].
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
ELISA är en metod som kan användas för att analysera mängden av en specifik antikropp. Detta görs genom att antigen fästs till ytan av en mikrotiterplatta, därefter blockeras plattan ofta med t.ex. bovint serum albumin (BSA) för att undvika ospecifik inbindning av andra molekyler än den specifika som analyseras.
Prov tillsätts sedan och vid närvaro av antikroppar sker inbindning till det specifika antigenet. För att kunna visualisera reaktionen används en
enzymkonjugerad sekundär antikropp mot provets antikropp och ett substrat som reagerar med enzymet, vilket bildar en färg. Slutligen mäts absorbansen, dvs.
reaktionens ljusgenomsläpplighet i en ELISA-spektrofotometer [2].
Syfte
Syftet med arbetet var att utveckla minst en fungerande metod för att analysera C5NeF vid Klinisk immunologi och transfusionsmedicin (Region Skåne, Lund).
MATERIAL OCH METOD
Material och metod för In-House-ELISA C5NeF och analys av C5-klyvning i löslig fas, samt undersökning av C3NeF-ELISA och analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner.
Etisk bedömning och urval av prover
Studien gjordes vid Klinisk immunologi och transfusionsmedicin, Lund och var ett utvecklingsarbete för komplementlaboratoriet. Alla prover avidentifierades, samtliga provgivare informerades om att provet sparades och kunde komma att användas för kvalitetsarbeten och metodutveckling och ansvarig chef beviljade att analysmetod för C5NeF utvecklades.
Urval av patientprover gjordes genom att handledare valde ut sparade
patientprover som tidigare skickats till laboratoriet för komplementanalys och haft låga nivåer av C3 och/eller C5 samt i de flesta fall undersökts för C3NeF. Prover från friska vuxna blodgivare fanns tillgängliga vid laboratoriet.
Material
Material för preparering av prover, C5NeF In-House ELISA, analys av C5-
klyvning i löslig fas och analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner.
Prover
I undersökningen analyserades avidentifierade serumprover från 12 patienter enligt urval, avidentifierade serumprover från 20 blodgivare (10 kvinnor och 10 män), två avidentifierade serumprover med påvisad C5NeF (gåva från Molecular Otolaryngolgy and Renal Research Laboratories, Iowa City, USA) ett
avidentifierat serumprov från frisk individ (normalserum) och ett avidentifierat serumprov från en annan frisk individ (negativ kontroll).
Buffertar
Preparering av IgG-fraktioner gjordes genom användning av Bindningsbuffert (20mM Natriumfosfat, pH 7.0) från Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA, Elueringsbuffert (0,1M glycine-HCl, pH 2.7), Neutraliseringsbuffert (1M Tris- HCl, pH 9.0) och phosphate buffered saline (PBS) framställda på
substratavdelningen på klinisk mikrobiologi, Lund, Sverige.
Buffertar som användes i C5NeF In-House ELISA var provspädningsbuffert (VBS-MgEGTA pH 7.2, dvs. veronal-buffrad saltlösning, NaCl, ethylene glycol tetraacetic acid, sterilt vatten och NaOH från substratavdelningen och MgCl2från Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland), tvättbuffert (provspädningsbuffert + 0,15%
Tween-20 från Sigma-Aldrich), fosfatbuffrad saltlösning pH 7,4 med 2 % bovint serum-albumin (vikt/volym, PBS-BSA) och 1 M dietanolaminbuffert, pH 9,8 från substratavdelningen.
I analys av C5-klyvning i löslig fas användes Mg-EGTA-buffert pH 7.4 (NaCl, EGTA, MgCl2) från substratavdelningen.
Reagens och övrigt
För preparering av IgG-fraktioner användes Protein G HP SpinTrap / Ab Spin Trap (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, USA) och Spectra/Por® 1 Dialysis Membrane (SpectrumLabs, San Francisco, USA). I C5NeF In-House ELISA användes ELISA-platta Maxisorp Nunc (Thermo Fisher Scientific).
Komplementproteinerna C3b A114, Faktor B A135, Faktor D A136, C3 A113 och A113c, och Properdin A139 från Complement technology Inc, Tyler, USA.
Konjugat (anti-humant IgG (Fc-specifikt)-alkaliskt fosfatas) A3312 och Substrat (p-nitrofenylfosfat) (5mg/tablett) från Sigma-Aldrich.
Analys av C5a efter C5-klyvning i löslig fas utfördes med C5a plus enzyme- immunoassay (Quidel, San Diego, USA) innehållande brunnar coatade med monoklonal antikropp från mus specifik för humant C5a, hög och låg kontroll samt standard 0ng/ml-1ng/ml innehållande humanserum, provspädningslösning (PBS, 0,05% Tween-20, 2,5% proteinstabilisatorer och 0,035% Proclin 300), tvättlösningskoncentrat (PBS, 1,0% Tween-20 och 0,035% Proclin 300), Konjugat (pepparrotsperoxidaskonjugerad monoklonal mus-antikropp mot C5a), Substrat (3,3’5,5’-tetrametylbensidin) och stopplösning (4% saltsyra). Absorbansmätningar utfördes med ELISA-spektrofotometer (Labsystem multiskan MS / plus 314, Thermo Fisher Scientific).
Metod
Metod för C5NeF In-House ELISA baserades på protokoll från Zhao et al. 2019 [1] och Skattum 2019 [7].
Metod för Analys av C5-klyvning i löslig fas baserades på protokoll från Zhao et al. 2019 [1] och enligt instruktioner från tillverkare av C5a plus ELISA [8].
Förberedelse av prover
Prover analyserades som serum och IgG-fraktioner. Serumprover inaktiverades genom inkubation i 56°C på värmeblock under 30 minuter på skak. IgG-
fraktioner preparerades enligt instruktioner från GE Healthcare Life Sciences [9].
Varje prov dialyserades sedan för byte av buffert från elueringsbuffert till PBS.
Dialysering gjordes enligt instruktion för Spectra/Por® 1 Dialysis Membrane [10]. Efter dialysering förvarades prover i -80°C i eppendorfrör.
In-house ELISA för C5NeF originalprotokoll
Alla prover tillsattes i en brunn innehållande konvertas (konvertasbrunn), en brunn innehållande C3b (C3b-brunn) och en brunn innehållande PBS
(bakgrundsbrunn).
Maxisorp-platta coatades med 100 µl/brunn C3b (konvertasbrunnar och C3b- brunnar, 1,4 µg C3b per brunn) spädd i steril PBS, 100 µl/brunn PBS tillsattes till bakgrundsbrunnar (kontroll-brunnar). Plattan inkuberades 1 timme i
rumstemperatur på skak. Plattans innehåll avlägsnades och därefter blockerades plattan med PBS-BSA och inkuberades 1 timme i rumstemperatur på skak. Plattan tvättades 3 gånger i tvättbuffert. Prover späddes 1/25 i spädningsbuffert.
Konvertasmix blandades ihop (0,18 µg/brunn Faktor D, 8 µg/brunn Faktor B, 5 µg/brunn C3, 0,5 µg/brunn Properdin och provspädningsbuffert) och 50 µl tillsattes till plattan i bestämda brunnar. Till bakgrundsbrunnar tillsattes enbart provspädningsbuffert. Därefter tillsattes 50 µl spätt prov till varje brunn. Plattan inkuberades i 37°C i 30 minuter. Därefter tvättades plattan 3 gånger i tvättbuffert.
IgG-Konjugat A3312 späddes 1/150 i tvättbuffert och 100 µl tillsattes till varje brunn och inkuberades 1 timme på skak i rumstemperatur. Plattan tvättades därefter 3 gånger i tvättbuffert. Slutligen blandades phosphatase substrat genom att phosphatase substrat tillsattes till dietanolaminbuffert, 100 µl tillsattes till varje brunn. Absorbanser avlästes med ELISA-spektrofotometer var trettionde minut vid 405 nm.
Optimering av C5NeF In-House ELISA
Olika steg i metoden varierades för att identifiera optimalt tillvägagångssätt.
C3b Coating
C3b-coating analyserades med tre olika inkubationstider; 1 timme, 1,5 timme och 2 timmar undersöktes.
Blockering PBS-BSA
Blockering av plattan med PBS innehållande 1 % BSA samt PBS innehållande 2
% BSA prövades.
Inkubationstid prov och konvertasmix
Olika inkubationstider för prov och konvertasmix i 37°C undersöktes.
Inkubationstider som analyserades var 20 minuter, 30 minuter och 60 minuter.
Spädningsbuffert
Spädningsbuffert innehållande olika koncentration av magnesiumklorid undersöktes, koncentrationerna MgCl2 som undersöktes var 6mM, 10mM och 14mM. Dessutom undersöktes spädningsbuffert utan BSA samt innehållande 1 % BSA.
Konvertasblandning
Olika mängd av proteiner för att bilda konvertas undersöktes. De mängder C3 som undersöktes var 10µg/brunn och 5µg/brunn. Properdin-mängder som undersöktes var 1µg/brunn samt 0,5µg/brunn.
IgG-fraktioner och serum
Alla prover analyserades som IgG-fraktioner samt som inaktiverade serumprover.
Koncentrationen IgG var densamma i både serum och IgG-fraktioner vid undersökning.
Analys av C5-klyvning i löslig fas
Inledningsvis späddes normalserum 1/10 i Mg-EGTA-buffert. IgG-fraktion från respektive prov (ca 2-3 µl) blandades med 25 µl normalserum i Mg-EGTA.
Blandningen inkuberades i 37°C i 45 minuter. Därefter späddes alla prover på is till 1:200 med provspädningslösning och analyserades enligt tillverkares
instruktioner (C5a plus ELISA, QUIDEL) [8]. Absorbansen mättes vid 450nm på ELISA-spektrofotometer.
C3NeF-ELISA & Analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner Alla prover som blivit positiva i C5NeF In-House ELISA analyserades på C3NeF ELISA enligt Skattum 2019 [7].
Alla prover som blivit positiva i C5NeF In-House ELISA analyserades i ELISA med optimalt utprövat protokoll (optimalt protokoll återfinnes under resultat, In- House ELISA för C5NeF, Optimering) för att identifiera antikroppar mot enskilda komplementproteiner. Patientprov tillsattes till en brunn coatad med 1 µg C3, en brunn coatad med 1 µg C3b, en brunn coatad med 1 µg Faktor B, en brunn coatad med 1 µg Properdin och en brunn coatad med PBS. Eftersom enskilda
komplementproteiner analyserades skedde ingen tillsatts av konvertasmix, då detta skulle bidra till bildning av konvertaskomplex. Absorbanser avlästes med ELISA-spektrofotometer var trettionde minut vid 405 nm.
RESULTAT
Resultat för optimering av C5NeF In-House ELISA, analys av C5-klyvning i löslig fas, C3NeF-ELISA och analys av antikroppar mot komplementprotein.
In-House ELISA för C5NeF
Optimering av metoden och slutresultat av serumprover och IgG-fraktioner.
Optimering
Slutgiltig optimal metod för C5NeF In-House ELISA innebar 1 timme coating, blockering med 2 % BSA-PBS, provspädningsbuffert innehållande 1 % BSA och 10mM MgCl2, konvertasmix med 0,18 µg/brunn Faktor D, 8 µg/brunn Faktor B, 5 µg/brunn C3, 0,5 µg/brunn Properdin och provspädningsbuffert, samt
provinkubation i 37°C under 30 minuter.
In-House ELISA C5NeF Serum
Slutgiltig metod för serum gjordes inte med optimal mängd BSA i blockering och i provspädningsbuffert. Resultat beräknades genom att absorbansen i C3b-
brunnen subtraherades från absorbansen i konvertas-brunnen. Prover från 20 blodgivare (10 kvinnor och 10 män) användes för etablering av cut-off, där medelvärdet av den uträknade absorbansen är gränsen för normalt värde [1].
Blodgivarprovernas absorbans fördelade sig enligt tabell 1. Medelabsorbans för
blodgivare i undersökningen var 0,270 i konvertas-brunnen, 0,261 i C3b-brunnen och 0,282 i PBS-brunnen.
Tabell 1. C5NeF In-House ELISA: Blodgivare Serumprov. Absorbanser (405 nm) efter 2 timmars inkubation av substrat.
Medelvärdet för blodgivare var 0,0089 vid uträknad absorbans, där konvertas- brunnens absorbans subtraherades med C3b-brunnens absorbans. Patienter med högre absorbans än cut-off värdet räknades som positiva i testet (Figur 1). Patient 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 och 13 är positiva i analysen, när absorbansen för C3b-brunnen subtraheras från absorbansen för konvertas-brunnen.
Figur 1. C5NeF In-House ELISA: Patienter Serumprov absorbans för konvertas-brunn subtraherat med absorbans för C3b-brunn. Absorbanser efter 2 timmars inkubation. MV=
medelvärde.
In-House ELISA C5NeF IgG-fraktioner
IgG-fraktioner analyserades med optimal metod. Resultat beräknades genom att absorbansen i C3b-brunnen subtraherades från absorbansen i konvertas-brunnen.
Prover från 20 blodgivare (10 kvinnor och 10 män) användes för att etablera cut- off-nivå, där medelvärdet för den uträknade absorbansen är gränsen för normalt värde [1]. Blodgivarprovernas absorbanser fördelade sig enligt tabell 2.
Medelabsorbansen för IgG-fraktioner av blodgivarprover var 0,199 för konvertas- brunn, 0,189 i C3b-brunnen och 0,145 i PBS-brunnen.
Tabell 2. C5NeF In-House ELISA: Blodgivare IgG-fraktioner. Absorbanser (405 nm) efter 2 timmars inkubation.
Medelvärde för blodgivare var 0,01 vid uträknad absorbans, där konvertas- brunnens absorbans subtraherades med C3b-brunnens absorbans. Patienter med högre absorbans än cut-off värdet räknades som positiva i testet (Figur 2). Patient 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13 och 15 är positiva i analysen när absorbansen för C3b- brunnen subtraheras från absorbansen för konvertas-brunnen.
Konvertas C3b PBS
Medelvärde blodgivare 0,270 0,261 0,282
Standardavvikelse blodgivare 0,122 0,148 0,224
Konvertas C3b PBS
Medelvärde Blodgivare 0,199 0,189 0,145
Standardavvikelse Blodgivare 0,035 0,030 0,013
Figur 2. C5NeF In-House ELISA: Patienter IgG-fraktioner absorbans för konvertas- brunn subtraherat med absorbans för C3b-brunn. Absorbanser efter 2 timmars inkubation.
MV=Medelvärde.
C5-klyvning i löslig fas
Analys av C5-klyvning i löslig fas utfördes på IgG-fraktioner av respektive prov.
20 blodgivarprover (10 kvinnor och 10 män) analyserades för att etablera en cut- off-nivå. Alla värden över cut-off-nivån räknas som positiva. 95:e percentilen av värden från blodgivarprover utgjorde cut-off-nivå, dvs 95% av blodgivarproverna är lägre än cut-off-nivån [11-12]. Cut-off för analysen vid 450nm var 1,566 (figur 3). Patient 5 och 15 är positiva i analysen.
Figur 3. Klyvning av C5 i löslig fas: kvantifiering av C5a efter inkubation.
C3NeF ELISA
För att undersöka eventuell samtidig förekomst av C3NeF och C5NeF,
analyserades serumprover från patienter som blivit positiva i C5NeF In-House ELISA. Patient 3, 5, 7, 8, 9, 10, 13 och 15 analyserades med C3NeF-ELISA (tabell 3).
Tabell 3. C3NeF ELISA resultat.
Analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner Alla patientprover som erhöll positivt resultat i C5NeF In-House ELISA analyserades för att identifiera eventuell förekomst av antikroppar mot
komplementproteinerna C3b, C3, Faktor B eller Properdin. Prover analyserades som serum och IgG-fraktioner. Alla absorbanser subtraherades med absorbansen från bakgrundsbrunn innehållande PBS. Cut-off-nivå bestämdes till absorbans 0,15 [12], se figur 4 och figur 5. Endast patient 8 uppvisade positivt resultat i analysen (med både serum och IgG-fraktion), vilket innebär att patient 8 har antikroppar mot C3 och C3b.
Figur 4. Analys av antikroppar i serumprov från patienter positiva i C5NeF In-House ELISA. Absorbanser efter 2 timmars inkubation.
C3NeF ELISA
Patientprov Resultat 3 Positiv 5 Negativ 7 Positiv 8 Positiv 9 Positiv 10 Positiv 13 Negativ 15 Negativ
Figur 5. Analys av antikroppar i IgG-fraktioner från patienter positiva i C5NeF In-House ELISA. Absorbanser efter 2 timmars inkubation.
DISKUSSION
Utvärdering av resultat och metod för analys av C5NeF.
Metoddiskussion
Undersökning av C5NeF gjordes genom att analysera C5NeF In-House ELISA och klyvning av C5 i löslig fas med hjälp av C5a plus ELISA. För att utesluta att positivt resultat berodde på förekomst av andra autoantikroppar än C5NeF analyserades antikroppar mot enskilda komplementproteiner som användes i C5NeF In-House ELISA.
C5NeF In-House ELISA
Inaktivering av prover gjordes för att inaktivera komplementproteiner i serumet, för att endast analysera immunoglobuliner (IgG) och minimera inverkan av patientens egna komplementnivåer på effektiviteten hos konvertasbildningen i analysen.
Undersökningen innebar inkubation av konvertasmix och prov i 37°C för att identifiera C5NeF som stabiliserar C5-konvertas. Olika inkubationstider undersöktes; 20, 30, 35 och 60 minuter, för att undersöka vilken inkubationstid som gav optimal absorbans. 60 minuters inkubation gav högre absorbans i bakgrundsbrunnarna C3b och PBS än önskat. Inkubationstiderna 20, 30 och 35 minuter gav liknande resultat. Eftersom 30 minuter inkubation användes i tidigare publikationer enligt Skattum 2019 [7] och Marinozzi et al. 2017 [5], användes detta i analysen. Coating med C3b och PBS undersöktes vid tiderna 1 timme, 1,5 timme och 2 timmar. Absorbansnivåerna visade ingen större skillnad, därför valdes 1 timme som den optimala coating-tiden, för att korta ner analystiden för metoden. De olika mängderna C3 och Properdin som prövades i konvertasmixen visade ingen större skillnad i absorbans. Därför användes 5µg C3 och 0,5µg properdin per brunn för att spara på reagens. Detta undersöktes för att analysera om ökad mängd komplementproteiner som ingår i konvertaskomplexet ger ökad bildning av konvertas. Magnesiumkoncentration i provspädningsbufferten undersöktes för att uppnå optimal absorbans. 14mM MgCl2 i
provspädningsbufferten var inte optimalt för bildning av konvertas, eftersom konvertas-brunnen, C3b-brunnen och PBS-brunnen erhöll likvärdiga resultat.
10mM MgCl2 i provspädningsbufferten var till fördel för bildning av konvertas och gav störst skillnad mellan konvertas-brunnen och bakgrundsbrunnarna med C3b och PBS. 6mM MgCl2 i provspädningsbufferten gav inte lika stor skillnad i absorbans mellan konvertas-brunnen och bakgrundsbrunnarna som analysen med 10mM MgCl2 [6,13]. Undersökning med 2 % BSA-PBS som blockering och 1 % BSA i provspädningsbufferten gav lägre bakgrundsabsorbanser jämfört med 1 % BSA-PBS som blockering och provspädningsbuffert utan BSA. Koncetrationen BSA undersöktes eftersom prover möjligtvis kunde innehålla antikroppar mot BSA som användes i blockeringen, för att kunna tvätta bort dessa, så tillsattes 1 % BSA i provspädningsbufferten [14]. Undersökningen utfördes främst på prover som uppvisat höga absorbanser i bakgrundsbrunnarna C3b och PBS vid analys av serumprover. Optimalt hade varit att undersöka alla prover med 2 % BSA-PBS som blockering och 1 % BSA i provspädningsbufferten för att kunna göra en likvärdig jämförelse, samt undersöka alla prover i duplikat för ett säkrare resultat men på grund av brist på reagens och tid gjordes inte detta.
I analysen användes MgCl2 istället för nickel i provspädningsbufferten, vilket användes i protokoll från Zhao et al. 2019 [1]. Detta kan ha påverkat resultatet.
Anledningen till att MgCl2 användes i bufferten var att efterlikna kroppens omgivning, MgCl2 fanns tillgängligt och nickel är allergiframkallande och inte gynnsamt för personal att utsättas för regelbundet vid analys. Däremot är nickel fördelaktigt för att hålla ihop konvertaset, vilket innebär att mindre mängd C3, Properdin och Faktor B kan användas i analysen [15].
IgG-fraktioner analyserades enligt det optimala protokollet; coating 1 timme, 30 minuter provinkubation med konvertasmix i 37°C, blockering med 2 % BSA- PBS, provspädningsbuffert innehållande 1 % BSA och 10mM MgCl2, samt
konvertasmix innehållande 5 µg C3 och 0,5 µg properdin per brunn. Eftersom alla serumproverna inte analyserades med det optimala protokollet är en jämförelse av resultatet inte likvärdigt. Prover såsom patient 5, patient 15 och en del blodgivare erhöll höga bakgrundsabsorbanser i C3b-brunn och PBS-brunn vid analys av serum, dvs när 1 % BSA-PBS och provspädningsbuffert utan BSA användes.
Resultat av analysen är beroende av välblandade lösningar, korrekt pipettering, reagens som fungerar optimalt och korrekta temperaturer; på material, reagens, inkubationer och omgivning, eftersom i tidigare publikationer benämns exakta temperaturer på inkubation och små volymer komplementproteiner används i analysen [7].
Klyvning av C5 i löslig fas
Metod för klyvning av C5 i löslig fas undersöktes inte vidare, metoden utfördes enligt tidigare studie [1] och enligt instruktion från tillverkare för C5a plus ELISA. Kvantifieringen av C5a fungerade eftersom plattkontroller och
standardkurva för analysen, som medföljde C5a plus, låg inom godkända gränser.
Metoden har inte lika hög sensitivitet som C5NeF In-House ELISA, eftersom betydligt färre prov blev positiva. Vid framtida studier av denna analysmetod skulle t.ex. tillsats av extra properdin vid seruminkubation kunna prövas för att öka C5-konvertasbildningen och undersöka om C5NeF är beroende av properdin.
C3NeF-ELISA & Analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner Undersökning av C3NeF-ELISA och analys av antikroppar mot enskilda
komplementproteiner utfördes för att garantera att positivt resultat i C5NeF In- House ELISA berodde på C5NeF. Vid förekomst av C3NeF eller antikroppar mot C3b, C3, Faktor B eller Properdin kan det inte garanteras att ett positivt resultat beror på C5NeF. Cut-off värde (0,15) för analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner bestämdes arbiträrt utifrån vad som är en vanlig nivå av bakgrundsabsorbans i de flesta ELISA-metoder [12]. För att ha ett korrekt cut-off värde bör minst 20 blodgivarprover analyseras, på grund av brist på tid och reagens gjordes inte detta.
Resultatdiskussion
De olika metoderna C5NeF In-House ELISA och klyvning av C5 i löslig fas undersöker olika saker. C5NeF In-House ELISA påvisar direkt C5NeF från provet. När konjugatet tillsätts binder detta till C5NeF som är antikroppar av IgG- typ. Klyvning av C5 i löslig fas undersöker C5a, vilket är en produkt av C5 klyvning. Vid närvaro av C5NeF stabiliseras C5-konvertas vilket ger ökad klyvning av C5 till C5a och C5b.
Det mest korrekta resultatet erhölls när C3b-brunnens absorbans subtraherades från konvertas-brunnens absorbans, eftersom antikroppar i provet binder till C3b i brunnen och det inte var C3b-antikroppar som skulle undersökas. Eftersom C5NeF In-House ELISA analys av serum inte gjordes med optimalt protokoll baseras den slutgiltiga bedömningen av vilka prover som räknas som positiva på analys av IgG-fraktioner.
Analys av antikroppar mot enskilda komplementproteiner visade att patient 8 har antikroppar mot C3 och C3b, vilket innebär att patienten inte kan garanteras vara positiv för C5NeF i undersökningen. Analys av C3NeF ELISA visar att patient 3, 7, 8, 9 och 10 är C3NeF positiva. Detta innebär att patient 5, 13 och 15 erhåller positivt resultat i endast C5NeF In-House ELISA. Analys av C5-klyvning i löslig fas visar också att patient 5 och 15 är positiva, vilket indikerar att patient 5 och 15 har C5NeF. Det är inte omöjligt att patienter som var positiva i C3NeF även har C5NeF, eftersom det är vanligt hos patienter med C3G att ha både C3NeF och C5NeF. Att tre prover var positiva med C5NeF In-House ELISA men negativa för C3NeF talar för att metoden är specifik för C5NeF.
Två positiva prover var en gåva från ett laboratorium i Iowa City, USA, där positiv 1 visade sig vara negativ både med C5NeF In-House ELISA och med analys av C5-klyvning i löslig fas. Detta kan bero på att olika patienters antikroppar kan binda till olika delar av C5-konvertaset, dvs. binda till olika epitoper. Eftersom C5-konvertas och C5NeF är komplext och strukturen av dessa inte är fastställda, är det helt rimligt att en patient med C5NeF blir positiv i C5NeF In-House ELISA men negativ i analys av C5-klyvning i löslig fas. Det finns ytterligare minst en metod för att analysera C5NeF. Zhao et al. 2019 [1]
undersökte C5NeF med tre olika typer av metoder; en analys av C5-klyvning i löslig fas, en analys som C5NeF In-House ELISA baserades på och en
hemolystest. Principen för hemolystestet är att IgG-fraktioner preinkuberas med normalserum och därefter tillsätts erytrocyter från kanin, där hemolys blockeras av C5NeF. Eftersom C5-konvertas har flera olika epitoper kan det vara
nödvändigt att undersöka patientsera med flera metoder för att identifiera C5NeF.
Förutom dessa metoder kan en förhöjd nivå av C5b-9 vara en indikation på förekomst av C5NeF [5].
SLUTSATS
Syftet med undersökningen har uppnåtts då fungerande metod för att undersöka C5NeF utvecklats.
REFERENSER
1. Zhao F, Afonso S, Lindner S, Hartmann A, Löschmann I, Nilsson B, Ekdahl KN, Weber LT, Habbig S, Schalk G, Kirschfink M, Zipfel PF, Skerka C, (2019) C3-glomerulopathy autoantibodies mediate distinct effects on complement C3- and C5-convertases. Frontiers in Immunology, 10:1030
2. Truedsson L, (2012) Komplementanalyser. I:Truedsson L, (Red) Klinisk Immunologi. Lund, Studentlitteratur.
3. Rawal N, Pangburn M.K, (2000) Structure/function of C5 convertases of complement. Elsevier Science C.V. 2001, 415-422.
4. Smith R J.H, Appel G B, Blom A, Cook H T, D’Agati V, Fakhouri F, Fremeaux-Bacchi V, Józsi M, Kavanagh D, Lambris J D, Noris M, Pickering M C, Remuzzi G, Rodriguez de Córdoba S, Sethi S, Van der Vlag J, Zipfel P F, Nester C M. (2019) C3 glomerulopathy —
understanding a rare complement-driven renal disease. Nature reviews nephrology 2019 Mar; 15(3): 129–143.
5. Marinozzi MC, Chauvet S, Le Quintrec M, Mignotet M, Petitprez F, Legendre C, Cailliez M, Deschenes G, Fischbach M, Karras A, Nobili F, Pietrement C, Dragon-Durey MA, Fakhouri F, Roumenina LT, Fremeaux- Bacchi V. C5 nephritic factors drive the biological phenotype of C3 glomerulopathies. Kidney Int. 2017 Nov;92(5):1232-1241.
6. Corvillo F, Okrój M, Nozal P, Melgosa M, Sánchez-Corral P, López- Trascasa M, (2019) Nephritic factors: an overview of classification, diagnostic tools and clinical associations. Frontiers in Immunology, 10:886.
7. Skattum L. (2019) Analysis of C3 Nephritic Factors by ELISA. Methods Mol Biol. 2019;1901:177-182.
8. Quidel (2021) MicroVue C5a EIA – Package Insert.
>https://www.quidel.com/< PDF (2021-02-10)
9. GE Healthcare Life Sciences (2006) Protein G HP SpinTrap / Ab Spin Trap – Product booklet. >https://www.cytivalifesciences.com< PDF (2021-02-05)
10. Spectrum Labs (2021) Spectra/Por Standard Grade Regenerated Cellulose Dialysis Membrane (Spectra/Por 1-5, 6 & 7).
>https://www.repligen.com< PDF (2021-02-05)
11. Bring J, Taube A, Wikman P. (2016) Introduktion till medicinsk statistik.
Lund, Studentlitteratur.
12. Skattum L, Muntlig källa.
13. Fine D P. (1977) Comparison of Ethyleneglycoltetraacetic Acid and Its Magnesium Salt as Reagents for studying Alternative Complement Pathway Function. Infection and Immunity 1977 vol. 16 (1): s.124-128 14. Ahirwar R, Bariar S, Balakrishnan A, Nahar P. (2015) BSA blocking in
enzyme-linked immunosorbent assays is a non-mandatory step: A perspective study on mechanism of BSA blocking in common ELISA protocols. RSC Advances, 2015, 5(121):100077-100083
15. Fishelson Z, Müller-Eberhard H J. (1982) C3 convertase of human complement: enhanced formation and stability of the enzyme generated with nickel instead of magnesium. The Journal of Immunology 1982;
129:2603-2607
