Occurrence of Verotoxin-encoding phages in mussels grown downstream the sewage treatment plant in Lysekil

Examensarbete 15hp vt 2009

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet

Occurrence of Verotoxin-encoding phages in mussels grown downstream the sewage treatment plant in Lysekil

Rebecka Dahlfors

Handledare: Jakob R Ottoson, PhD, Forskarassistent

Institutionen för biomedicin och veterinär folkhälsovetenskap

2 Abstract

The purpose of this study was to investigate the occurrence of Verotoxin-encoding bacteriophages in mussels, cultured downstream the sewage treatment plant in Lysekil.

Mussels were collected in three growing areas from April 2008 to March 2009. Real-time PCR was performed for detection of vtx1 and vtx2 genes and enrichment of bacteriophages on non Verotoxin- producing Escherichia coli O157: H7 was carried out. All samples in real-time PCR analysis were negative; no presence of Verotoxin-encoding phages was shown. No plaque was formed on blood agar base plates, indicating that no bacteriophages had been taken up by E. coli bacteria

The levels of Verotoxin-encoding phages and E.coli outside the sewage treatment plant in Lysekil were not high enough to be able to form VTEC in mussels, indicating that the faecal contamination was low.

This does not exclude the presence of other more common pathogens such as norovirus and campylobacter.

Keywords: VTEC, EHEC, HUS, Escherichia coli O157:H7, Verotoxin

1. Introduktion

Under senare år har sjukdomar orsakade av enterohemorragiska Escherichia coli (EHEC) fått ökad uppmärksamhet i Sverige då antal rapporterade fall ökat. Under 2005 var ökningen särskilt stor, dels på grund av ett stort utbrott på västkusten och dels på grund av ovanligt många utlandssmittade [1]. EHEC är smittskyddslagens benämning på sjukdom orsakad av

Verotoxinproducerande Escherichia coli

(VTEC). Namnet VTEC kommer från bakteriens cytotoxicitet för s.k. veroceller [2]. Verotoxin (Vtx) är ett gift som är identiskt med det gift som produceras av dysenteribakterien Shigella

dysenteriae [3], Shigatoxin, varför begreppet Shigatoxinproducerande Escherichia coli (STEC) också används [4]. Fler fall av andra bakterier än VTEC, som orsakar mag-tarm sjukdom hos människa rapporteras årligen men det besvärliga med VTEC är att smittdosen är så låg och att konsekvenserna blir så allvarliga.

Mindre än 100 bakterier kan räcka för att en person ska insjukna [2] och kan i värsta fall orsaka blodiga diarréer, hemolytisk uremiskt syndrom (HUS) och neurologiska

komplikationer. Inkubationstiden är 2-12 dagar innan diarréer uppträder. De första 1-3 dagarna efter insjuknandet är diarréerna vattniga.

Diarréerna övergår till att vara blodiga och magkramper uppkommer. Detta tillstånd varar i 2-10 dagar [5]. I de flesta fall avtar diarréerna men i 5-10% av fallen utvecklas HUS och trombocytopeni purpura (TTP) där små barn och äldre löper störst risk att drabbas [2]. HUS innebär njursvikt, trombocytopeni och

mikroangiopatisk hemolytisk anemi [2]. TTP är en variant av HUS och är vanligare hos vuxna och kan ge feber, neurologiska symptom [6] och leder i värsta till fall döden. Det finns inga medicinska behandlingar för att förhindra att enterohemorragisk colit utvecklas till HUS. Det råder tvivel vad gäller antibiotika mot VTEC då Vtx-kodande fager stimuleras av vissa

antibiotikum vilket kan leda till ökad produktion av Vtx [6-10]. Den behandling som ges är att ersätta salt- och vätskeförluster.

Den viktigaste reservoaren för VTEC är

isolerats från andra djurslag såsom svin, hästar, värphöns, duvor, måsar gäss m fl.

Den vanligaste smittkällan till VTEC är livsmedel såsom otillräckligt tillagat nötkött och opastöriserad mjölk. Men även opastöriserad juice, fermenterad korv, yoghurt, skaldjur och grönsaker har orsakat sjukdom . Förorenat dricksvatten och badvatten samt kontakt med djur som till exempel då barn gästar

besöksbondgårdar, hör också till smittkällorna för VTEC. Även person till personsmitta sker [1, 2, 12].

Det första VTEC-utbrottet som beskrevs var i USA 1982. Orsaken var hamburgare som inte var tillräckligt tillagade. Sjukdomstillståndet HUS beskrevs redan 1955 men då utan att vara förknippat med specifik orsak [5]. Det var först 1978 som man beskrev Shigella dysenteriae typ 1 och dess toxin som orsak till HUS.

Rädisgroddar under en skollunch i Japan 1996 orsakade det största utbrottet hitintills. Då visade fler än 12 000 patienter upp symptom varav 121 fick HUS [7, 13]. I Sverige, på västkusten hade man ett stort utbrott 2005, då 135 fall

rapporterades. Orsaken var sallat som bevattnats med förorenat vatten [1]. I USA, 2006,

smittades183 personer av färsk spenat. Den gången fick 29 personer HUS och en patient dog [1].

Flera olika serotyper av VTEC orsakar EHEC hos människa men den vanligaste av dem är O157: H7 [1]. O står för de somatiska antigen som sitter i bakteriens cellvägg. Siffran efter talar om vilket specifikt antigen av denna typ det är. H står för flagell-antigen som sitter på

bakteriens rörelseorgan dvs. flagellerna [2].

VTEC har flera viktiga virulensfaktorer,

egenskaper som påverkar bakteriens möjligheter att orsaka sjukdom. Dessa virulensfaktorer är kodade på rörliga element hos bakterien så som patogenicitetsöar, plasmider och bakteriofager [2, 6, 14].

Den viktigaste virulensfaktorn är förmågan att

producera Vtx [15]. Två huvudtyper av toxinet

finns, Vtx1 och Vtx2. Bakterien kan producera

en eller båda typerna. Genen för toxinet bärs av

temperata bakteriofager, vilket är bakterievirus

som kan inkorporeras i bakteriens genom. Vtx

4 av HUS. Giftet kan inducera syntes av cytokiner och apoptos vilket ger skador på endotelceller i tarmen och kan leda till hemorragisk colit [2].

Vtx-kodande fager är virus som infekterar framför allt E.coli-bakterier. De bär på

information för att styra sin egen reproduktion hos värden. Fagerna finns över hela världen i hav, jord, avlopp, mat och dricksvatten. Vtx- kodande fager är dubbelsträngade DNA-fager [16]. Bakteriofagerna överlever utan värd länge (från månader till år). De är mer resistenta mot kemikalier än bakterier. Eftersom fagerna överlever längre i miljön än sina värdbakterier [17] utgör de en reservoar för Vtx och kan vid rätt förutsättningar infektera nya bakterier som därigenom ökar sin virulens. För att det ska kunna ske krävs troligen höga halter av såväl fager som värdbakterier, ~10

/ml [18, 19].

Ökad tillförsel av växtnäringsämnen, främst kväve och fosfor har orsakat övergödning av våra vatten. En ny alternativ miljöåtgärd för att få bukt med övergödningen är att odla musslor som filtrerar vatten och tar upp

växtnäringsämnen. En 5–6 cm lång mussla kan som bäst filtrera fem liter vatten per timme och kan filtrera partiklar från c:a 0,001 mm-0,5 mm storlek, i princip alla partiklar större än bakterier.

När musslorna skördas avlägsnar man stora mängder kväve och fosfor ur vattnet. Vid skörd av ett ton blåmusslor avlägsnas ungefär 8 kg kväve och 0,5 kg fosfor. På en yta motsvarande en fotbollsplan (0,4 hektar) kan ungefär 120 ton musslor skördas efter ca 1 år. Merparten av de skördade musslorna säljs för human konsumtion, resten används som foder och gödning inom lantbruket. Odlingen av musslor är både effektivare och billigare än traditionell teknik.

Reningsverket i Lysekil släpper ut 39 ton kväve varje år i Saltöfjorden. I stället för att bygga ut kvävereningen har Lysekils kommun avtalat med ett företag för att det ska skörda 3 900 ton odlade musslor varje år.

Musselodlingarna ligger som närmast någon kilometer från utsläppspunkten, som är belägen på 20 m djup. Det föreligger dock en viss risk att musslorna, utöver näringsämnen även

koncentrerar mikroorganismer såsom bakteriofager som kan spridas vidare och

infektera nya E. coli-stammar och bilda VTEC.

Syftet med studien var att undersöka

förekomsten av Vtx-kodande bakteriofager, som kan överföra toxinproducerande egenskaper mellan olika E.coli stammar, i musslor odlade nedströms avloppsreningsverket i Lysekil.

Metoder som användes var realtids-PCR för detektion av vtx1- och vtx2-gener samt anrikning av fager på icke Vtx-producerande E.coli O157:

H7.

2. Material och metod

2.1. Preparation av musselprov för analys av Vtx-kodande bakteriofager

Musselprov, hämtade en gång i månaden från 3 olika odlingar (A, B och C) runt reningsverk i Lysekil (tabell 1) under perioden april 2008 till och med mars 2009, preparerades av

livsmedelsverket för virusanalys enligt följande:

Temperaturen av musslorna mättes vid ankomst med IR-termometer. Hepatopankreas (ett organ som fungerar som både bukspottkörtel och lever) togs ur musslorna, dissekerades och vägdes. Av hepatopankreas togs 500 mg och blandades med 500 µl PBS med proteinase K (100µg/ml). Av supernatanten användes 200 µl för att extraheras för nukleinsyra. DNA extraherades med

QIAamp

MinElute

Virus Spin Kit, (Qiagen, Hilden, Germany) enligt tillverkarens

instruktioner. Nukleinsyrorna eluerades i 50 µl, vilket motsvarade DNA från 100 mg

hepatopankreas. I PCR-analysen användes 2 µl DNA-mall vilket innebär att 4 mg

hepatopankreas analyserades i varje PCR.

2.2. Realtids-PCR för detektion av vtx1 och vtx2 För detektion av genen för Vtx utfördes en realtids-PCR där principen för analysen var att bestämma mängden nukleinsyra i proven med hjälp av en fluorescensinmärkt probe som gav en ljussignal proportionellt mot mängd amplikon som bildats.

Till detektion av vtx-gener användes primers

och prober beskrivet av Perelle et al. [20] som

köptes från Thermo Scientific Biopolymers

Webshop (Waltham, MA, USA). Primers och

prober finns listade i tabell 2. Proberna var

inmärkta med fluorescerande reporter, FAM samt quencher, BHQ1.

Detektion av vtx1-, vtx2- gener utfördes med en 25 µl reaktionsvolym av 12,8µl vatten, DNas och RNas fritt, 2,5 µl

GeneAmp 10x PCR Buffer II (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,3), 3 µl MgCl

25 mM, 2 µl GeneAmp® dNTP blandning 10 mM (dATP, dCTP, dGTP och dTTP 2,5 mM av vardera, Art. No N808-0260) från Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), 1µl primer f 10 µM, 1 µl primer r 10 µM, 0,5 µl probe FAM 10 µM, 0,2 µl AmpliTaq Gold™ DNA

Polymerase (5 units/µl, Art. No N808-0241) från Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)

samt 2 µl mall. Följande stammar ingick i varje PCR-analys som positiv och negativ kontroll:

CCUG 42744 (E.coli O157 vtx1

vtx2

eaeA

EHEC-hlyA

fliC

) och CCUG 42901 (E. coli O157 vtx1

, vtx2

, eaeA

, EHEC-hlyA

, och fliC

), CCUG-Culture Collection, University of

Gothenburg (Göteborg, Sverige).

Amplifieringen utfördes med 7500 FAST realtime PCR system från Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) som beskrivet av Perelle et al. [20] men med små förändringar enligt följande program: Initial denaturering vid 95°C i 6 min följt av 40 cykler denaturering vid 95°C i 15 s och primer annealing och elongering vid 60°C i 60 s.

Tabell 1. Odlingsplatser för musslor, runt reningsverket i Lysekil.

Odlingsplats

A Kristineberg, Gullmarsfjorden Före reningsverk

B N. Grundsund, Saltö fjord c:a 1 km nedströms reningsverket C Slävik, Åbyfjorden c:a 1 mil nedströms reningsverket

Tabell 2. Degenererade primers och TaqMan-prober använda för amplifiering av vtx1-, vtx2-gener i 5’ nukleas- PCR analys

Målgen Forward primer-, reverse primer- och probesekvenser (5’ – 3’)

Plats i sekvensen

Amplikon storlek (bp)

GenBanks- nummer

vtx1 TTTGTYACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG

CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACRTC FAM-

CTGGATGATCTCAGTGGGCGTTCTTATGTAA- BHQ1

878–906 983–1008 941–971

131 M16625

vtx2 TTTGTYACTGTSACAGCWGAAGCYTTACG

CCCCAGTTCARWGTRAGRTCMACRTC FAM-

TCGTCAGGCACTGTCTGAAACTGCTCC-BHQ1

785–813 887–912 838–864

128 X07865

a I sekvensen är Y (C, T), S är (C, G), W är (A, T), R är (A, G), M är (A, C).

6 2.3. Anrikning av fager på E.coli O157: H7

För anrikning av fager användes helt musselkött från musslor skördade aug, okt, dec 2008 samt jan och feb 2009 från odlingarna A, B och C.

Musselköttet späddes 1:10 i 0,1 % peptonvatten och homogeniserades i en Stomacher på

Livsmedelsverket. Anrikningen gjordes enligt protokoll beskrivet av Muniesa och Jofre [21].

Kortfattat, 5 ml av det homogeniserade musselköttet sterilfiltrerades med sprutfilter, porstorlek 0,20 µm, ner i provrör för att filtrera bort bakterier. E.coli O157: H7, Vtx

, CCUG 44857 odlades i nutrientbuljong- NB (SVA produktion, Uppsala, Sverige) på skak i 37°C i c:a 2,5 tim. Därefter fylldes fag-rören med buljongen, upp till 40 ml och sattes på skak i 37°C över natt för att propagera fager. Rören centrifugerades Vid 3220 g i 10 min.

Supernatanten filtrerades med sprutfilter,

porstorlek 0,20 µm varefter 1 ml blandades med 2 ml softagar (70 % Blodagarbas-BAB, 30 % NB) och 1 ml värdstam (E. coli O157: H7, CCUG 44857 i logfas). Mixen hälldes på blodagarbasplattor och inkuberades i 37°C över natt. Plattorna lästes av för plackbildning (klara zoner) i bakteriemattan.

3. Resultat

3.1. Realtids-PCR för detektion av vtx1 och vtx2 Fluorescensförändringen, ∆Rn avsattes på y- axeln i logaritmisk skala mot antal PCR-cykler på x-axeln. Signalen från de positiva

kontrollerna visade att analysen gått bra. Alla prover i realtids-PCR- analysen var negativa, dvs ingen förekomst av verotoxinkoande fager kunde påvisas (se Fig1a-c).

3.2. Anrikning av fager på E.coli O157: H7 Vid odling av E.coli O157: H7 på blodagar på vilka bakteriofager anrikats, bildades inga plack på plattorna vilket tydde på att inga bakteriofager tagits upp av E.coli-bakterien och därmed

gjordes ingen vidare analys för detektion av bakteriofager med realtids-PCR.

Figur 1a Amplifieringsdiagram för prover tagna april 2008 till och med okt 2008

Figur 1b Amplifieringsdiagram för prover tagna nov 2008

till och med mars 2009

Figur 1c Amplifieringsdiagram för prover tagna nov 2008 till och med mars 2009

Figur 1a-c Figurerna visar amplifieringsdiagram för nukleinsyrasekvensen i proven. Den positiva signalen visar att analysen gått bra. Alla prover var negativa.

4. Diskussion

Målet för studien var att undersöka förekomsten av Vtx-kodande fager i musslor odlade utanför avloppsreningsverket i Lysekil. Metoden som användes var realtids-PCR. Det är en kvantitativ metod som har den fördelen att det går att följa ökningen av mängden DNA under

amplifieringen. Det är en snabb metod som har både hög specificitet och sensitivitet.

Alla prover i realtids-PCR-analysen var negativa, vilket innebar att ingen förekomst av Vtx-kodande fager kunde påvisas. Man hade möjligtvis kunnat höja detektionsnivån genom att minska vattenmängden i mastermixen och på så sätt höja koncentrationerna av eventuella Vtx- kodande fager i reaktionsvolymen. I analysen studerades 4 mg hepatopankreas och skulle man ha hittat virus i dessa 4 mg skulle det ha

inneburit att halten måste ha varit minst 250 viruspartiklar per gram hepatopankreas. Skulle man istället ha kommit upp i mängder om 20 mg skulle det ha räckt att det fanns 50 partiklar per gram för att man skulle ha kunnat detektera dem.

Men sannolikheten för upptäckt av fager skulle förmodligen ändå ha varit tämligen låg. Ett

försök att anrika fager på E.coli O157: H7 gjordes för att på så sätt få upp halterna av eventuella fager. Men inga bakteriofager togs upp av E.coli bakterien. Ett rimligt antagande till de negativa proverna är att det inte fanns tillräckligt höga halter av Vtx-kodande fager och E.coli utanför reningsverket i Lysekil för att Vtx- producerande E.coli ska kunna bildas. Detta indikerar att den fekala föroreningen vid musselodlingarna utanför reningsverket är av mindre omfattning. Enligt EU-direktiv 91/492/EEG; Anon 1991 är gränsvärdet för skaldjur som ska säljas för human konsumtion 230 E. coli per 100 g. Värdena i musselodlingen utanför reningsverket låg under detta gränsvärde och de allra flesta värden uppgick bara till 20 E.

coli per 100 gram musselkött (information från Livsmedelsverket).

Flera studier har gjorts i Europa där man tittar på mikroorganismer i skaldjur. I en studie gjord i Frankrike undersökte man förekomsten av VTEC och E.coli O157:H7 i skaldjur från

franska kustområden. Även i denna studie ansågs risken för människa att infekteras av VTEC vara begränsad. Däremot var halterna E.coli högre än i Sverige [22]. I en annan studie undersöktes förekomsten av human viruskontaminering i skaldjur från olika odlingsområden i Grekland, Spanien, Sverige och Storbritannien. Man analyserade även för E. coli. En hög frekvens av humana virus så som Enterovirus, Norovirus, Hepatit A (ej i Sverige) och Adenovirus

återfanns hos skaldjur, godkända att säljas som livsmedel, dvs. som hade en lägre halt E. coli än 230 per 100 g kött [23]. E. coli är den indikator som i Europa används som indikator för fekal förorening men behov finns av bra indikatorer för viruskontaminering. Ytterligare en studie pekar på nödvändigheten av specifika indikatorer för olika områden på grund av geografiska och säsongsmässiga skillnader [24].

Sammanfattningsvis kan sägas att det tycks som om musslorna odlade utanför Lysekils reningsverk kan användas för såväl hönsfoder och gödsling som för human konsumtion när det gäller förekomst av verotoxinkodande fager.

Dock skall understrykas vikten av bra tillagning

av musslorna då detta eliminerar risken att

infekteras av andra vanligt förkommande

patogener så som norovirus och campylobacter.

8 Det goda resultatet av analysen kan vara

startskottet för fler musselodlingar som alternativ till traditionell teknik för rening av vatten från kväve och fosfor.

Acknowledgement

Jag vill tacka min handledare Jakob Ottoson som med sin generositet och sina goda råd hjälpt mig under mitt examensarbete. Jag vill också tacka Anna Aspán som varit mig behjälplig vid den laborativa delen av mitt arbete. Ett stort tack riktar jag till alla på Institutionen för biomedicin och veterinär folkhälsovetenskap, avdelningen för bakteriologi och livsmedelssäkerhet, Sveriges lantbruksuniversitet för deras vänlighet och varmt visat intresse för mig och mitt arbete och ett särskilt tack vill jag rikta till Märit Pringle och Anna Rosander, som delade med sig av sin tid och då och då gav mig små utmaningar genom vilka mitt själförtroende växte.

Referenser

[1] Söderström A, Osterberg P, Lindqvist A, Jönsson B, Lindberg A, Blide Ulander S, Welinder-Olsson C, Löfdahl S, Kaijser B, De Jong B, Kühlmann-Berenzon S, Boqvist S, Eriksson E, Szanto E, Andersson S, Allestam G, Hedenström I. A large

Escherichia coli O157 outbreak in Sweden associated with locally produced lettuce 2008. Foodborne Pathogens and Disease.

2008;5(3):339-49.

[2] Gyles CL. Shiga toxin-producing

Escherichia coli: an overview. Journal of Animal Science. 2007;85(E Suppl.):E45- 62.

[3] Mead PS, GriffinPM. Escherichia coli O157: H7. Lancet. 1998;352:1207-12.

[4] O'brien AD, Holmes RK. Shiga and shiga- like toxins, Escherichia coli.

Microbiological Reviews. 1987;51(2):206- 20.

[5] Tarr PI, Gordon CA, Chandler WL. Shiga- toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uremic syndrome. Lancet.

2005;365:1073-86.

[6] Paton JC, Paton AW. Pathogenesis and diagnosis of shiga toxin-producing Escherichia coli infections. Clinical

Microbiology Reviews. 1998;11(3):450–

479.

[7] Matsushiro A, Sato K, Miyamoto H, Yamamura T, Honda T. Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli, O157:H7 with Norfloxacin. Journal of Bacteriology.

1999;181(7):2257-60.

[8] Schmidt H. Shiga-toxin-converting

bacteriophages. Research in Microbiology.

2001;152(8):687-95.

[9] Wong CS, Jelacic S, Habeeb RL, Watkins SL, Tarr PI. The risk of the hemolytic- uremic syndrome after antibiotic treatment of Escherichia coli O157:H7 infections.

The New England Journal of Medicine.

2000;342(26):1930-6.

[10] Zhang X, McDaniel AD, Wolf LE, Keusch GT, Waldor MK, Acheson DW. Quinolone antibiotics induce shiga toxin–encoding bacteriophages, toxin production, and death in mice. The Journal of Infectious

Diseases. 2000;181(2):664-70.

[11] Beutin L, Geier D, Steinrück H,

Zimmermann S, Scheutz F. Prevalence and some properties of verotoxin (shiga-like toxin)-producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals. Journal of Clinical Microbiology.

1993;31(9):2483-8.

[12] Verweyen HM, Karch H, and Brandis M, Zimmerhackl LB. Enterohemorrhagic Escherichia coli infections: following transmission routes. Pediatric Nephrology.

2000;14(1):73-83.

[13] Fukushima H, Hashizume T, Morita Y, Tanaka J, Azuma K, Mizumoto Y, Kaneno M, Matsuura M, Konma K, Kitani T.

Clinical experiences in Sakai City Hospital during the massive outbreak of

enterohemorrhagic Escherichia coli O157 infections in Sakai City, 1996. Pediatrics International. 1999;41(2):213-7.

[14] Law D. Virulence factors of Escherichia coli O157 and other Shiga toxin-producing E. coli. Journal of Applied Microbiology.

2000;88(5):729-45.

[15] Konowalchuk J, Speirs JI, Stavric S. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli.

Infection and Immunity. 1977;18(3):775-9.

[16] Sekse C, Muniesa M, Wasteson Y.

Conserved stx2 phages from Escherichia coli O103:H25 isolated from patients suffering from haemolytic uremic syndrome. Foodborne Pathogens and Disease. 2008;5(6):801-10.

[17] Muniesa M, Lucena F, Jofre J.

Comparative survival of free shiga toxin 2- encoding phages and Escherichia coli strains outside the gut. Applied and Environmental Microbiology.

1999;65(12):5615-18.

[18] Muniesa M, Jofre J. Factors influencing the replication of somatic coliphages in the water environment. Antonie Van Leeuwenhoek. 2004;86(1):65-76.

[19] Imamovic L, Jofre J, Schmidt H, Serra- Moreno R, Muniesa M. Phage-mediated shiga toxin 2 gene transfer in food and water. Applied and Environmental Microbiology. 2009;75(6):1764-8.

[20] Perelle S, Dilasser F, Grout J, Fach P.

Detection by 5'-nuclease PCR of Shiga- toxin producing Escherichia coli O26, O55, O91, O103, O111, O113, O145 and O157:H7, associated with the world's most frequent clinical cases. Molecular and Cellular Probes. 2004; 18(3):185-92.

[21] Muniesa M, Jofre J. Abundance in sewage of bacteriophages that infect Escherichia coli O157:H7 and that carry the shiga toxin 2 gene. Applied and Environmental

Microbiology. 1998;64(7):2443-8

[22] Gourmelon M, Montet MP, Lozach S, Le Mennec C, Pommepuy M, Beutin L, Vernozy-Rozand C. First isolation of shiga toxin 1d producing Escherichia coli variant strains in shellfish from coastal areas in France. Journal of Applied Microbiology, 2006;100(1):85-97.

[23] Formiga-Cruz M, Tofiño-Quesada G, Bofill-Mas S, Lees DN, Henshilwood K, Allard AK, Conden-Hansson AC, Hernroth BE, Vantarakis A, Tsibouxi A,

Papapetropoulou M, Furones MD, Girones R. Distribution of human virus

contamination in shellfish from different growing areas in Greece, Spain, Sweden, and the United Kingdom. Applied and

Environmental Microbiology.

2002;68(12):5990-8.

[24] Hernroth BE, Conden-Hansson AC,

Rehnstam-Holm AS, Girones R, Allard

AK. Environmental factors influencing

human viral pathogens and their potential

indicator organisms in the blue mussel,

Mytilus edulis: the first Scandinavian

report. Applied and Environmental

Microbiology. 2002;68(9):4523-33.