Framställning av positiva kontroller för immuncytokemi med vätskebaserad cytologi

(1)

Examensarbete

Framställning av positiva kontroller för

immuncytokemi med vätskebaserad cytologi

Jessica Sverkersson

(2)

vätskebaserad cytologi

Jessica Sverkersson

Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen

Handledare:

Henrik Engström, avdelningschef, fil. doktor Klinisk patologi, Landstinget i Kalmar Län Länssjukhuset, 392 44 Kalmar

Examinator:

Maria Mattsson, Universitetslektor, Institutionen för kemi och biomedicin Linnéuniversitetet, 392 34 Kalmar

Examensarbetet ingår i programmet Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng

Sammanfattning

Immuncytokemi (ICC) har blivit en framgångsrik metod inom cancerdiagnostiken. ICC bygger på antikropps- och antigenreaktion då infärgning med specifika antikroppar kan lokalisera strukturer hos celler. Hos klinisk patologi i Kalmar utförs ICC med den traditionella prepareringsmetoden där materialet formalinfixeras, bäddas i paraffin och snittas enligt cell block teknik (CBT). Vid ICC med vätskebaserad cytologi (LBC, liquid-based cytology) kan infärgning utföras på en mindre mängd material samt ge ett resultat 1-2 dagar innan resultat fås med CBT. ICC med LBC saknar kontroller vilket medför att resultatet blir mindre tillförlitligt. Syftet med examensarbetet var att ta fram positivt kontrollmaterial för ICC av LBC-preparerat material. Kontrollmaterial

selekterades från tidigare diagnostiserade och immunfärgade patientprover i form av exsudat och tonsillmaterial. En panel av 6 monoklonala antikroppar bestående av anti-CD20, anti-CD3, anti-CK5, anti-CK7, anti-Ki-67 och anti-WT1 användes.

Kontrollmaterialet preparerades enligt ThinPrep™-metoden och sattes till objektglas med Cytospin™. När kontrollmaterialets positivitet bekräftats testades det i rutinarbete ihop med 10 patientprover. Patientproverna preparerades med ThinPrep™-metod och placerades på objektglasen med hjälp av en ThinPrep™5000 processor. Samtliga resultat jämfördes med infärgning gjord med CBT och majoriteten av resultaten var likvärdiga. Ur resultatet drogs slutsatsen att metoden verkar lovande men

prepareringssteg och färgprotokoll behöver optimeras samt att större studier med fler patientprover behövs för att kunna beräkna tillförlitlig statistik.

Nyckelord

(3)

(4)

Förkortningar

CBT Cell block technique (Cell block teknik)

CC1 Cell Conditioner 1 CC2 Cell Conditioner 2 CD3 Cluster of differentiation 3 CD20 Cluster of differentiation 20 CK5 Cytokeratin 5 CK7 Cytokeratin 7

DAB 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochlorid

HRP Horseradish peroxidase

ICC Immunocytochemistry (Immuncytokemi)

IHC Immunohistochemistry (Immunhistokemi)

LBC Liquid-based cytology (Vätskebaserad cytologi)

LCS Liquid Coverslip

(5)

INTRODUKTION _____________________________________________________ 1 Vätskebaserad cytologi ______________________________________________ 1 ThinPrep™ _______________________________________________________ 1 Cytospin™ _______________________________________________________ 2 Immuncytokemi ICC ________________________________________________ 2 Benchmark ULTRA _________________________________________________ 4 Antikroppar _______________________________________________________ 4 Antikroppar för diagnostik ___________________________________________ 5 Cluster of Differentiation 20 _________________________________________ 5 Cluster of Differentiation 3 __________________________________________ 5 Cytokeratin 5 _____________________________________________________ 5 Cytokeratin 7 _____________________________________________________ 6 Proliferationsmarkören Ki-67 ________________________________________ 6 Wilms Tumor 1 ____________________________________________________ 6 Syfte ______________________________________________________________ 6 MATERIAL OCH METOD _____________________________________________ 7 Framställning av kontrollmaterial _____________________________________ 7

Selektion av patientprover för kontrollmaterial ___________________________ 7 Preparering av kontrollmaterial med ThinPrep™-metod ___________________ 7 Applicering av kontrollmaterial på objektglas med Cytospin™ 4 _____________ 7 Immunfärgning i BenchMark ULTRA __________________________________ 8 Grundsteg för immunfärgning ________________________________________ 8 Dehydrering och montering __________________________________________ 9

(6)

(7)

INTRODUKTION Vätskebaserad cytologi

Vätskebaserad cytologi (LBC, liquid-based cytology) är en standardiserad teknik för preparering av cytologiska prover inför undersökning. Tekniken används för många olika provtyper där den vanligaste är cervixprover som screenas för cellförändringar. Utöver preparering av cervixprover används vätskebaserad cytologi för prov från kroppsvätskor så som exsudat (1). Vid skador på kapillärernas väggar kan resultatet bli ansamling av vätskor i kroppens hålrum vilket kallas exsudat. Dess utseende kan variera i färg men är alltid grumligt. Vanligen så innehåller exsudatet en varierad population av signifikanta celler som kan studeras vid cytologiska undersökningar för att ta reda på orsaken. Uppkomst av exsudat kan ha många olika orsaker, exempelvis inflammatoriska tillstånd eller tumörer (2).

ThinPrep™

En vanlig metod för LBC är ThinPrep™ (Hologic Inc, Malborough, USA) (1).

ThinPrep™ är en metod för att av cytologiskt vätskebaserat cellprov skapa ett tunt skikt av celler på ett objektglas (3).

Preparering

För ThinPrep™-metoden används metanolbaserad CytoLyt™-lösning som tvätt genom att lysera röda blodkroppar, sönderdela slem och reducera

proteinfällningar samtidigt som cellmorfologin bevaras. Som fixeringsmedel används

metanolbaserad PreservCyt™ som verkar

bakteriedödande och minskar smittorisk (3, 4). När celler har tvättats med CytoLyt™-lösningen överförs de till en särskild behållare som innehåller

PrecervCyt™-lösningen. Denna behållare kan sedan sättas i ett ThinPrep™ prepareringsinstrument (3). ThinPrep™ 5000 processor är ett

prepareringsinstrument skapat av Hologic Inc. Instrumentet arbetar under vakuum och lufttryck. Med hjälp av ett filter med små porer kan cellerna placeras i ett skikt, eller monolayer. Processen bygger på tre steg (Figur 1) där första steget är dispersion, då skapas strömmar i PrecervCyt™-behållaren med provet till följd av rotation av flaskan. Dessa strömmar är tillräckligt starka för att avskilja oönskat material samt sönderdela slem, men

Figur 1. Processens tre steg. 1. Dispersion 2. Cellinsamling 3. Cellöverföring. Bild modifierad från

(8)

tillräckligt svaga för att inte påverka cellernas utseende. Efter dispersion sker

cellinsamlingen då ett vakuum skapas i plastfiltret vilket gör att cellerna fastnar på filtrets utåtvända sida med porer. Detta sker parallellt med mätning av flödeshastigheten som relateras till hur många celler som sitter på filtret. Sista steget är cellöverföringen då filtrets utsida med celler trycks försiktigt mot ett ThinPrep™-glas. Överföringen underlättas av ett lätt övertryck och detta ger en jämn fördelning av cellerna över en cirkulär yta (3).

Filtren som används har ett filtermembran som är platt, jämnt och poröst där porerna kan variera i storlek beroende av vilken processapplikation som används. Vanligen används ett filter med mindre porer och cirkulär appliceringsyta för urinprover och två andra filter med större porer och cirkulär appliceringsyta för gynekologiska prover samt

icke-gynekologiska prover så som exsudat. Av icke-icke-gynekologiska prover kan instrumentet skapa upp till 10 objektglas från en behållare med prov om tillräcklig mängd prov finns i behållaren (4).

Cytospin™

Cytospin™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) är en centrifug för cytologiska prover och är en vanlig prepareringsmetod inom LBC. Provet laddas till en hållare med ett filter som via en metallhållare fästs mot ett objektglas (Figur 2). Cellerna förs sedan via centrifugering över till en definierad

cirkulär yta på objektglaset samtidigt som överflödig vätska absorberas av filtret (5).

Cytospin™ är en effektiv prepareringsmetod när den cellulära mängden är låg

vilket är vanligt vid bland annat finnålspunktioner och likvor (6).

Immuncytokemi ICC

Immuncytokemi (ICC) är en metod som kan nyttjas för att detektera olika strukturer hos celler i cytologiska prover. Dessa strukturer kan utgöras av exempelvis proteiner eller andra makromolekyler. Metoden är vanlig inom biomedicinsk forskning och har lagt grunden för många stora upptäckter. Inom den kliniska verksamheten har metoden en stor nackdel vilket är att den saknar kontroller. Resultaten vid ICC kan vara svårtolkade och utan kontroller kan metoden inte användas i rutinarbete (7).

(9)

ICC och immunhistokemi (IHC) utförs idag på formalinfixerat, paraffininbäddat och snittat material, kallat cell block teknik (CBT). För IHC finns kontroller och metoden används rutinmässigt (8). IHC har blivit en mycket framgångsrik metod inom cancerdiagnostik och har visat sig ge viktig information om prognos, behandling och återfall (9).

ICC och IHC bygger på reaktion mellan antikropp och antigen som kan detekteras och visualiseras via flourescens eller kromogent ämne (9). Vid fluorescerande detektion märks antikropparna in med fluorescerande ämnen som sedan kan visualiseras i

fluorescensmikroskop och på så vis lokalisera antikropps-antigen-bindningen. Kromogena metoder bygger på enzymkonjugat där antikropparna är konjugerade till enzym som i reaktion med substrat och kromogent ämne ger en färgprodukt. Färgprodukten kan sedan visualiseras i ett ljusmikroskop (2). Den vanligaste metoden är indirekt ICC där en okonjugerad primär antikropp som är specifik för antigenet och en sekundär konjugerad antikropp som är art-specifik, används (figur 3). I den direkta ICC används endast den konjugerade primära antikroppen (7). Horseradish peroxidase (HRP) används mest

frekvent vilken via reaktion med substratet väteperoxid och ett kromogent ämne, vanligast 3-3´diaminobensidin-tetrahydroklorid (DAB) kromogenen, ger en färgprodukt som kan detekteras (2).

(10)

Att detektera olika strukturer hos celler är exempelvis mycket viktigt när tumörers ursprung ska bestämmas, eller när en metastaserande primärtumör ska lokaliseras. Vanligen utförs ICC analyser på paraffininbäddat material och därför kan detta vara en utmaning inom den kliniska cytologin då till exempel material från finnålspunktion eller i LBC-preparerat material kan innehålla liten mängd celler och därmed vara svåra att centrera i en paraffinkloss. För lite eller för utspritt material i klossen gör att resultatet inte blir tillförlitligt (4). Utförs ICC på LBC-preparerat material går processen 1-2 dagar snabbare än vid den traditionella metoden där materialet bäddas i paraffin (8). Utöver det så är den traditionella metoden en utmärkt prepareringsmetod inför immunfärgning (4).

Benchmark ULTRA

Färgningsinstrumentet BenchMark ULTRA tillhör företaget Ventana Medical Systems som är medlem i Roche Diagnostics Scandinavia AB. BenchMark ULTRA används för färgning av histologiska och cytologiska prover. För att materialet ska fästa bättre till objektglasen utförs färgningen på positivt laddade objektglas i form av specifik

immunhistokemi eller in situ-hybridisering. Instrumentet har plats för objektglas och 35 reagenser och kan färga upp till 90 glas inom 8 timmar. Färgningen som sker är individuell så preparaten blir oberoende av varandra och varje objektglas har sin egen värmeplatta vilket medför att även miljön blir individuell. Bulkflaskor med reagens sitter i instrumentet med en reservoar som räcker till färgning av 30 glas (10).

EZ-prep är en lösning som används för att avlägsna det sista paraffinet efter bakning av preparatet. Liquid Coverslip (LCS) är ett reagens av olja som täcker preparatet och förhindrar avdunstning samt gör det möjligt med långvarig inkubation. Med luftvortex blandas reagenser mellan preparat och LCS vilket gör att hela preparatet kommer i kontakt med reagenserna. Reaktionsbuffert används i form av en Tris-baserad lösning som

underlättar reaktioner mellan antikropp och antigen. Cell Conditioning 1 och 2 (CC1, CC2) används vid värmemedierad retriveal för att öka immunreaktiviteten. Proteaser av 3 styrkor kan användas för enzymatisk antigenretrieval där proteas 1 har koncentrationen 0,5 U/mL, proteas 2 har 0,1 U/mL och proteas 3 har 0,02 U/mL. En vanlig detektionsmetod som används är DAB-detektionskit där HRP-enzym, väteperoxid och kromogenen DAB ger en brun fällning (10).

Antikroppar

(11)

infärgning med antikroppar kan antigenretrieval vara nödvändigt för att göra epitoperna mer tillgängliga då fixering av celler kan göra att immunreaktiviteten minskar och behöver återställas. Beroende av epitopens känslighet finns olika tekniker som kan tillämpas däribland proteolytiska enzymer, värme och mikrovågor. Även en så enkel teknik som att tvätta i vatten kan göra stor skillnad för epitopernas tillgänglighet för antikropparna (2).

Antikroppar för diagnostik

Cluster of Differentiation 20

Confirm anti-CD20 (klonnamn L26) är en monoklonal musantikropp av IgG-typ som är riktad mot det humana antigenet cluster of differentiation 20 (CD20) som finns hos lymfocyter (12). Anti-CD20 används som en primär antikropp för att identifiera B-lymfocyter. Pro-B-lymfocyter och plasmaceller uttrycker inte antigenet CD20 men det finns bland annat hos mogna B-cellsneoplasmer och vid Hodgkin lymfom (13, 14). Anti-CD20 ger en membraninfärgning och positiv infärgning sker i normala vävnader så som mjälte, tonsill och lymfkörtel samt i neoplastiska vävnader så som B-cellslymfom och Hodgkin lymfom (15).

Cluster of Differentiation 3

Confirm anti-CD3 (klonnamn 2GV6) är en monoklonal kaninantikropp av IgG-typ. Den används som primär antikropp vid infärgning av antigenet cluster of differentiation 3 (CD3). Syftet med infärgningen är att kvalitativt identifiera T-lymfocyter. Anti-CD3 är riktat mot epsilonkedjan i det humana CD3 antigenet som uttrycks i T-lymfocyter, naturliga mördarceller (NK), och T-, och NK-cellneoplasmer (16). Infärgningen sker huvudsakligen i membranet och ger därför en membranfärgning vid positiv infärgning (17). Positiv infärgning med anti-CD3 ska ske i normala vävnader så som mjälte, tonsill, tymus, benmärg och lymfkörtel samt i neoplastiska vävnader så som T-cellslymfom (18).

Cytokeratin 5

(12)

Cytokeratin 7

Confirm anti-Cytokeratin 7 (klonnamn SP52) är en monoklonal kaninantikropp riktad mot C-terminala regionen hos det humana proteinet Cytokeratin 7 (CK7). Proteinet CK7 finns bland annat hos duktala och glandulära epitel samt övergångsepitel hos många

vävnadstyper och kan därför användas vid identifiering av normala och neoplastiska celler i äggstocks-, lung- och bröstepitel. Vanligen uttrycks CK7 inte hos epitel i mag- och tarmkanalen men vid kolorektala adenokarcinom kan positiv infärgning förekomma. Anti-CK7 används som primär antikropp och ger cytoplasmisk infärgning (23). Positiv

infärgning sker i normala vävnader så som bukspottkörtel, lever och bröst samt i

neoplastiska vävnader så som adenokarcinom i bukspottkörtel, äggledare och lunga (24).

Proliferationsmarkören Ki-67

Confirm anti-Ki-67 (30-9) är en monoklonal kaninantikropp som används som primär antikropp för detektion av antigenet Ki-67 (25-27). Antikroppen är riktad mot den C-terminala delen av antigenet och ger en nukleär infärgning. Ki-67 antigenet förekommer i G1-, S-, G2- och M-fasen under cellcykeln men inte under G0 fasen som är den inaktiva fasen, alltså uttrycks Ki-67 hos proliferativa celler och kan därför användas för att bedöma mängden proliferativa celler i normal och neoplastisk vävnad (25-29). Positiv infärgning sker i normala vävnader så som tonsill och lymfkörtel (30).

Wilms Tumor 1

Anti-WT1 (6F-H2) är en monoklonal musantikropp som används som primär antikropp för detektion av Wilms tumor 1 (WT1) och ger en nukleär infärgning. WT1 är en

zinkfingertranskriptionsfaktor som normalt kan förekomma i mesodermala vävnader men även i tumörceller i Wilms tumör även kallat nefroblastom. Positiv infärgning sker i normala vävnader så som testikel, bröst, livmoder och äggledare samt i patologiska vävnader så som serös ovarialcancer och mesoteliom (31-33).

Syfte

(13)

MATERIAL OCH METOD Framställning av kontrollmaterial

Selektion av patientprover för kontrollmaterial

De patientprover som valdes ut för kontrollmaterial hade tidigare färgats med de

monoklonala antikropparna som användes i denna studie, anti-CD20, anti-CD3, anti-CK5, anti-CK7, anti-Ki-67 och anti-WT1. Dessa infärgningar visade positivitet för antikropparna och hade gjorts med CBT på klinisk patologi i Kalmar vilket följer den traditionella

metoden vid IHC ihop med positiva kontroller (34). Patientproverna bestod av material taget från tonsill samt exsudatprover i form av pleuravätska (Tabell I).

Tabell I. Patientprover för utvärdering som positiva kontroller. Beskrivning av provtyp, patient och diagnos.

Provtyp Patient Diagnos

Exsudat A – Pleuravätska Man född 1931 Lungcancer Exsudat B – Pleuravätska Man född 1937 Lungcancer

Tonsill Kvinna född 2009 Tonsillhypertrofi

Preparering av kontrollmaterial med ThinPrep™-metod

Till samtliga exsudatprover (Tabell I) hade några droppar Heparin LEO (5000 IE/mL, Vianex S.A. Aten, Grekland) kort efter provtagningen tillsatts för motverkan av

koagelbildning. Exsudatproverna preparerades enligt ThinPrep™-metoden genom att 50 mL exsudatprov överfördes till 50 mL rör (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) och

centrifugerades vid 2123 rpm i 10 minuter (Hettich zentrifugen rotanta 460). Vätskan dekanterades och pelleten suspenderades i 30 mL ThinPrep™ CytoLyt-lösning (Hologic Inc, Malborough, USA) på vortex (lab dancer, IKA, Oxford, England) och inkuberades i rumstemperatur under 15 minuter innan det centrifugerades under samma förhållanden som innan. Vätskan dekanterades och 1 mL vätska från behållare med ThinPrep™

PreservCyt-lösning (Hologic Inc, Malborough, USA) fördes över till provrör och pelleten suspenderades. Några droppar av suspensionen fördes sedan över till

PreservCyt-behållaren utifrån grumligheten och inkuberades i rumstemperatur under 15 minuter (34). Från färsk tonsill (Tabell I) togs material med en cytologiborste och blandades ned i PreservCyt-behållare.

Inför preparering på objektglas poolades innehållet av PreservCyt-behållarna för exsudatproverna A och B.

Applicering av kontrollmaterial på objektglas med Cytospin™ 4

Preparering på objektglas utfördes med Cytospin™ 4 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Centrifugeringsenheter monterades ihop bestående av Superfrost objektglas

(14)

Waltham, USA) i Cytoclip™ slide clips (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) (Figur 2). De poolade exsudaten och tonsillmaterialet applicerades till olika

centrifugeringsenheter som sattes i Cytospin™ 4 instrumentet och program med 500 rpm i 6 minuter användes. De preparerade objektglasen fick sedan lufttorka över natten (34).

Immunfärgning i BenchMark ULTRA

Preparaten fixerades i 4 % formaldehyd (Histolab, Göteborg, Sverige) i 15 minuter och sköljdes sedan i destillerat vatten. Därefter placerades de i BenchMark ULTRA (Ventana Medical Systems, Oro Valley, USA) med några droppar tris-baserad reaktionsbuffert (pH 7.6 ±0.2, Ventana Medical Systems, Oro Valley, USA) och färgades enligt protokoll för respektive antikropp (Bilaga I) (35). Preparaten med poolat exsudat infärgades med antikropparna Cytokeratin 5 (SP27) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (0,28 µg/mL) Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA), Confirm anti-Cytokeratin 7 (SP52) Rabbit

Monoclonal Primary Antibody (0,536 µg/mL, Ventana Medical Systems, Oro Valley, USA), Confirm anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (2 µg/mL, Ventana Medical Systems, Oro Valley, USA) och WT1 (6F-H2) Mouse Monoclonal Antibody (2,21 µg/mL)Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA). Preparaten med

tonsillmaterialet infärgades med Confirm anti-CD20 (L26) Primary Antibody (0,3 µg/mL, Ventana Medical Systems, Oro Valley, USA) och Confirm anti-CD3 (2GV6) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (0,4 µg/mL, Ventana Medical Systems, Oro Valley, USA).

Grundsteg för immunfärgning

(15)

Dehydrering och montering

Efter infärgning tvättades preparaten i varmt vatten med diskmedel och sattes i

infärgningsinstrumentet Coverstainer (Agilent, Santa Clara, USA) för dehydrering och montering. Dehydrering utfördes med 96 % etanol, 99 % etanol och Histo-Clear II (Agilent, Santa Clara, USA). Montering utfördes med Toluenfritt monteringsmedium (Agilent, Santa Clara, USA) och täckglas (24x50mm, Agilent, Santa Clara, USA)(35).

Test av kontrollmaterial i rutinarbete

Tio patientprover valdes ut för vidare utvärdering av kontrollmaterial i rutinarbete. De patientprover som valdes ut bestod av exsudatprover som tidigare infärgats med de aktuella antikropparna enligt standardmetoden för IHC med CBT på klinisk patologi i Kalmar. Patientproverna utgjordes av maligna prover då dessa blir positivt infärgade för de flesta av antikropparna och vid bedömning och utvärdering av de positiva kontrollerna i rutinarbete behövs patientprover som till större utsträckning är positiva för samtliga antikroppar. Det ger möjligheten att jämföra positiv infärgning av kontrollmaterial och patientprover (Tabell II).

Som positiv kontroll för CD20 och CD3 användes tonsillmaterial och för övriga antikroppar i panelen användes det poolade exsudatet.

Tabell II. Översikt av de selekterade patientproverna. Kort beskrivning av provmaterial, kön, ålder, diagnos och bedömning av provmaterialet.

Patientprov Provmaterial Kön, ålder Klinisk diagnos/Bedömning

1 Ascitesvätska Kvinna född 1945

Peritonealcarcinomatos. Maligna celler i ascites 2 Ascitesvätska Man född

1935

Duodenalsår, leversvikt och blåscancer. Inflammatorisk bild och reaktiva

mesotelcellsförändringar i ascitesvätskan. 3 Pleuravätska Kvinna född

1941

Ensidig pleuravätska. Cancerceller i pleuravätska.

4 Pleuravätska Man född 1937

Misstanke om recidiv lungcancer. Maligna celler av cancertyp i pleuravätska.

5 Pleuravätska Kvinna född 1957

Lungcancer, progress. Maligna celler i pleuravätskan.

6 Pleuravätska Man född 1953

Lungcancer. Malignitetsmisstänkt atypi i pleuravätska.

7 Pleuravätska Kvinna född 1958

Bröstcancer. Malignitetsmisstänkt atypi i pleuravätska.

8 Bukvätska Man född 1970

Bukvätska innehållande mesotelceller och kronisk inflammation, maligna celler påvisades inte.

9 Ascitesvätska Man född 1935

Urotelialcancer. Ascitesvätska visade involvering av carcinom.

10 Ascitesvätska Kvinna född 1941

(16)

De framtagna kontrollmaterialen preparerades på objektglas via Cytospin™ 4. För att åstadkomma en optimal placering av kontrollmaterialet med avseende på patientprov och täckglas sattes objektglaset upp och ned i centrifugeringsenheten och filtret sattes ca 0,3 cm högre upp än avsett (Figur 2). För att utesluta kontamination tillsattes även en liten mängd grön markörfärg (Histolab, Göteborg, Sverige) till varje centrifugeringsenhet. Två objektglas med tonsillmaterial och fyra med poolat exsudat förbereddes till varje

patientprov. De utvalda patientproverna sattes till objektglasen med kontrollmaterialet med hjälp av ThinPrep™ 5000-processor (Hologic Inc, Malborough, USA) (Figur 4). Funktion för preparering av flera objektglas från en PreservCyt™-behållare innehållande

patientprovet användes. Ett patientprov sattes in åt gången i instrumentets insatskarusell tillsammans med 6 UroCyte™ filter(Hologic Inc, Malborough, USA) och de 6

objektglasen preparerade med kontrollmaterial. Preparaten med

kontrollmaterial och patientprov fick sedan lufttorkas över natt och följde därefter samma process för infärgning, dehydrering och montering som tidigare beskrivits.

Bedömning av samtliga preparat gjordes av överläkare på avdelningen för klinisk Patologi och Cytologi i Kalmar som

värderade infärgningen i en skala från + till +++ beroende av dess intensitet och

bedömbarhet där intensiteten och

bedömbarheten var som högst vid +++ och lägst vid +.

Statistik

En statistisk jämförelse genomfördes av infärgningarna utförda enligt LBC och enligt CBT. Bedömningen poängsattes från 0-6 där patientprov och kontrollmaterial summerades utifrån skalan av infärgningen från + till +++. Bedömningen Neg eller 0 motsvarade 0 och bedömningen +++ hos både patientprov och kontrollmaterial motsvarade 6. Med hjälp av poängsättningen beräknades ett medelvärde för varje antikropp enligt respektive metod. Ur metodernas medelvärde beräknades hur stor procent av preparaten hanterade enligt LBC som stämde överens i infärgningen med preparaten hanterade enligt CBT.

Etik

Samtliga prover som användes i studien hade tidigare fått diagnos och materialet som användes var kvarblivet och skulle kasseras. Lag om etikprövning av forskning som avser människor syftar till att skydda den enskilda människan samt respekten för människovärdet vid forskning. Eftersom arbetet utfördes på utbildningsnivå krävdes ingen etikprövning enligt SFS 2003:460 (36).

(17)

RESULTAT

Utvärdering av kontrollmaterial

Det poolade exsudatet A+B samt tonsillmaterialet bedömdes utifrån infärgningens intensitet och preparatets bedömbarhet med +++ som högst och + som lägst (Tabell III). Exsudat A+B bedömdes + för infärgning med anti-CK5, +++ för anti-CK7, ++ för anti-Ki-67 och anti-WT1 efter preparering enligt LBC. Tonsill bedömdes +++ för infärgning med anti-CD20 och ++ för anti-CD3 efter preparering med LBC. Samtliga infärgningar av exsudat A+B och tonsill bedömdes +++ efter preparering enligt CBT.

Tabell III. Resultat av kontrollmaterial (exsudat A+B och tonsillmaterial). Exsudat A+B infärgat med CK5, anti-CK7, anti-Ki-67 och anti-WT1. Tonsill infärgat med anti-CD20 och anti-CD3. Samtliga infärgningar gjorda med LBC och CBT. Bedömning gjord utifrån infärgningens intensitet och bedömbarhet där intensitet och bedömbarhet är som högst vid +++ och som lägst vid +.

Vätskebaserad cytologi LBC

Kontrollmaterial CD20 CD3 CK5 CK7 Ki-67 WT1

Exsudat A+B + +++ ++ ++

Tonsill +++ ++

Cell block teknik CBT

Kontrollmaterial CD20 CD3 CK5 CK7 Ki-67 WT1

Exsudat A+B +++ +++ +++ +++

Tonsill +++ +++

Kontrollmaterial i rutinarbete

(18)

Tabell IV. Resultat av patientprover 1-10 samt kontrollmaterial infärgade med CD20, CD3,amti- CK5, anti-CK7, anti-Ki-67 och anti-WT1 enligt LBC och CBT. Bedömning gjord utifrån infärgningens intensitet och bedömbarhet som är högst vid +++ och lägst vid +. 0 står för inga celler. ”*” står för enstaka celler. ”Neg” står för negativt. ”?” innebär osäkert resultat. Resultaten uppdelade i patient (P) och kontroll (K).

1 2 3 4 5 Vätskebaserad cytologi (LBC) P K P K P K P K P K CD20 +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ CD3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ CK5 + ++* +++ +++* +++ +++ ?+ Neg +++ +++ CK7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Ki-67 +++ +++ +++ +++ +++ +++* ++ +++ +++ +++ WT1 ++ + +++ +++ + +* + ++ ++ +++

Cell block teknik (CBT)

CD20 +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ CD3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ CK5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ CK7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Ki-67 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ WT1 +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ 6 7 8 9 10 Vätskebaserad cytologi (LBC) P K P K P K P K P K CD20 +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ + +++ CD3 ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++* +++ +++ CK5 Neg +++* +++ +++* +++ 0 +++ 0 ++ ++ CK7 ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++* +++ +++ Ki-67 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 0 +++ +++ WT1 Neg +++* + Neg ++ ++ ++* 0 0 0

Cell block teknik (CBT)

(19)

Immuncytokemisk infärgning

Resultat av infärgning med anti-CD20 enligt LBC utföll ojämnt med varierande intensitet hos cellerna i patientprov och kontrollmaterial. Resultaten bedömdes därför vara mindre pålitliga än de gjorda enligt CBT. Detta var till följd av sparsam mängd CD20 positiva celler. Bakgrundsfärgning observerades i några av infärgningarna och trots den varierande intensiteten var bedömbarheten stark (Figur 5).

Resultaten av infärgningarna med anti-CD3, anti-CK5, anti-CK7 och anti-Ki-67 enligt LBC blev pålitliga med liten variation av intensiteten hos infärgning mellan patientprov och kontrollmaterial (Figur 6-9). Bedömbarheten av dessa infärgningar vad likvärdiga i bedömbarhet och intensitet med infärgningarna gjorda enligt CBT.

Majoriteten av infärgning med anti-WT1 enligt LBC hade svagt och ojämnt utfall i bedömbarhet och intensitet hos både patientprov och kontrollmaterial. Enstaka

patientprover med dess kontrollmaterial korrelerade (Figur 10). Dessa infärgningar var inte tillförlitliga i jämförelse med de gjorda enligt CBT.

(20)

Figur 6. Exempel på en framgångsrik infärgning med anti-CD3 enligt LBC av patient 3: patientprov bedömt +++ och kontrollmaterial bedömt +++ (vit pil). 200 x förstoring.

Figur 7. Exempel på en framgångsrik infärgning med anti-CK5 enligt LBC av patient 3: patientprov bedömt +++ och kontrollmaterial bedömt +++ (vit pil). Här syns den gröna markörfärgen i kontrollen (svart pil). 200 x förstoring.

(21)

Figur 9. Exempel på en framgångsrik infärgning med anti-Ki-67 enligt LBC av patient 5: patientprov bedömt +++ och kontrollmaterial bedömt +++(vit pil). Här syns den gröna markörfärgen i kontrollen (svart pil). 200 x förstoring.

Figur 10. Exempel på en framgångsrik infärgning med anti-WT1 enligt LBC av patient 5: patientprov bedömt ++, kontrollmaterial bedömt +++ (vit pil). Här syns den gröna markörfärgen i kontrollen (vit pil). 200 x förstoring. Kontaminationskontroll

Den gröna markörfärgen bedömdes till en fungerande kontaminationskontroll. Celler i kontrollen färgat med markörfärgen kunde tydligt skiljas från cellerna i patientprovet. Cellerna i kontrollmaterialen observerades som gröna när cellerna inte infärgats med antikroppar eller som bruna med bakomliggande grön nyans när de infärgats med antikroppar (Figur 7, 9, 10).

Statistik

(22)

(23)

DISKUSSION

Syftet med arbetet var att framställa positiva kontroller för immuncytokemi med

vätskebaserad cytologi. Dessa kontroller skulle sedan testas i rutinarbete med hjälp av 10 patientprover och utvärderas i jämförelse med resultaten för patientproverna infärgade enligt cell block teknik.

Val av prepareringsmetod

Vid val av prepareringsmetod beslutades Cytospin™ vara mest lämplig för

kontrollmaterial eftersom målet, utöver framställningen av kontrollmaterial, var att kunna skapa färdiga objektglas med en kontroll som direkt kan användas för patientprover. Till Cytospin™ kan man använda vanliga filter, vilket användes i denna studie (Figur 2), som applicerar ett material till objektglaset (37). Det finns även filter med dubbla brunnar som gör det möjligt att applicera två material på samma gång (38). Men det skulle förhindra möjligheten att förbereda objektglas med kontrollmaterial som kan förvaras i väntan på patientprov. Därför valdes Cytospin™ för applicering av kontrollmaterial och ThinPrep™ 5000 processor för applicering av patientprov. Placeringen av kontrollmaterialet

korrigerades med några millimeter vilket gjorde att hela kontrollen hamnade under täckglaset samtidigt som det fanns plats kvar åt patientprovet (Figur 4). ThinPrep™ 5000 processor valdes då detta instrument griper objektglaset runt kanterna och på så vis bibehålls kontrollen intakt (3).

Kontrollmaterial i rutinarbete

Vid infärgning av de selekterade kontrollmaterialen enligt CBT bedömdes alla med +++. Exsudat A+B bedömdes dock endast + för infärgning med anti-CK5 preparerade enligt LBC. Detta kan vara till följd av sparsam mängd CK5 positiva celler. Eller möjligtvis vara relaterat till antigenretrieval eftersom enzym används här och färgprotokollen är utformade för den standardiserade tekniken CBT (Bilaga I). Infärgning med anti-CK5 av patientprov 4 och kontrollmaterial preparerade med LBC visade även där avsaknad av CK5 positiva celler. Resultatet enligt CBT preparerat material visade att både patientprov 4 och kontrollmaterial innehöll CK5 positiva celler. Infärgningen med anti-CK5 hade dock en bra korrelation mellan patientprov och kontrollmaterial.

(24)

Några av resultaten som var svårbedömda eller saknade positiva celler var till följd av bortfallet material. Det berodde troligtvis på prepareringen av materialet på objektglasen eller hanteringen av objektglasen med applicerat material. En åtgärd för detta skulle vara att exempelvis centrifugera under en längre tid eller med ett högre varvtal i Cytospin™ vilket kan göra att cellerna fäster bättre till glaset och mer vätska kan absorberas av filtret.

Statistiken som beräknades är baserad på endast 10 patientprover och beskriver därför inte metoden med säkerhet utan beskriver endast detta försök. Däremot blev resultatet av statistiken lovande då anti-CD20, anti-CD3, anti-CK7 och anti-Ki-67 beräknades att med över 90 % korrelera mellan LBC och CBT. Ytterligare optimeringar av kontrollmaterial, preparering och färgprotokoll kan få korrelationen att öka och ytterligare tester kan göra de statistiska beräkningarna mer tillförlitliga.

De infärgningar som fick ett sämre och mer ojämnt resultat enligt LBC än enligt CBT, så som för anti-WT1 och anti-CD20, kan bero på fixeringsmetoden. Antikropparna som används vid ICC är utformade för formalinfixerade vävnader vilket kan medföra

svårigheter. Cellerna som genomgår ICC är först och främst metanolfixerade och fixeras endast under 15 minuter i formalin och detta kan medföra både falska negativa och falska positiva resultat. Detta beror på att olika fixeringsmetoder påverkar epitoper på olika sätt, beroende på var epitopen befinner sig samt typen det är (4, 11). Formaldehyd är ett tvärbindande kemiskt fixeringsmedel som ger strukturellt stöd utan att ändra den totala lösligheten. Metanol är ett koaguleringsfixeringsmedel som verkar direkt genom att fälla ut proteiner vilket gör att proteinerna fixerar på plats samtidigt som vatten avlägsnas. När vattnet avlägsnas sker intra- och intermolekylära interaktioner som gör att proteiner ändrar struktur samtidigt som lösligheten ändras (11). Slutresultatet av dessa fixeringsmetoder blir olika och kan därför i vissa fall medföra att antikroppar inom dagens kliniska verksamhet inte kan användas på celler fixerade med metanol. Detta beroende på

strukturförändringarna som sker vid metanolfixering och om dessa påverkar epitopen som antikroppen är riktad mot (7, 11). I detta fall var intensitet och bedömbarhet av respektive antikroppar hög hos minst 50 % av patientproverna som testades. Detta var lovande med avseende på fixeringsmetoden då den inte har påverkat inbindningen av dessa antikroppar.

Kontaminationskontroll

Markörfärgens syfte var att urskilja kontrollmaterialets celler från patientprovet på objektglaset för att utesluta kontamination (8). Användning av en histologisk markörfärg, som man annars använder för att markera vävnader i syftet att orientera den, var

(25)

Tidigare resultat

I en liknande studie gjord av T. Hansen m.fl. i Danmark (8) producerades liknande resultat. T. Hansen m.fl. framställde positiva kontroller för immuncytokemi med den

vätskebaserade cytologi-metoden SurePath™, vars fixering skiljer sig från den i

ThinPrep™ då SurePath™ är formalinbaserad istället för metanolbaserad som ThinPrep™. I studien testades 21 antikroppar som förväntades reagera med minst en komponent i material från tonsill, exsudat eller bronksköljvätska. Positiva reaktioner erhölls för relevanta antikroppar och en hållbarhetsstudie visade att objektglas med kontrollmaterial kunde förvaras i kyl åtminstone 40 dagar (8). Studien jag gjorde var avsevärt mindre men resultaten lovande. Prepareringsmetoderna i dessa studier skiljer sig åt något vilket gör att de blir svårt att jämföra infärgningarnas intensitet och bedömbarhet dem emellan. Däremot verkade markörfärgen ha liknande effekt i min studie som i T. Hansens (8).

I en annan studie gjord av I. Norman m.fl. testades en serie av prover med ICC färgning i kombination med vätskebaserad cytologi där ThinPrep™ användes (40). Syftet med studien var att detektera ackumulering av p16 (INK4a) och jämföra dessa

expressionsanalyser med resultat från histopatologin. P16 (INK4a) fungerar som en

biomarkör för dysplastiska celler från cervix och i studien blev alla godartade förändringar negativa och mer än hälften av de höggradiga förändringarna blev positiva. Ur studien drogs slutsatsen att denna färgning kan användas som ett komplement på cytologiska cervixprov för att upptäcka vilka kvinnor som är på väg att utveckla höggradiga

förändringar. Även för att vinna tid utan förnyad provtagning där man tar en minibiopsi för histopatologisk analys, vilket kan upplevas traumatiskt. I studien nämndes det att negativ och positiv kontroll användes vid färgningen men inte vad de bestod av (40). Slutsatsen av denna studie var bl.a. att vinna tid och minska traumatisk provtagning vilket är en stor fördel vid kombinationen av ICC och LBC (40). Tyvärr är det vanligt med studier om ICC där kontroller inte presenteras vilket medför svårigheter i utvecklingen och säkerheten av metoden (7).

Ekonomiska aspekter

Eftersom ICC utfört ihop med LBC ger ett resultat 1-2 dygn före ICC ihop med CBT gör det att arbetsinsatsen i tid minskar avsevärt vilket i sin tur ger en ekonomisk vinst.

(26)

SLUTSATS

Vid framställning av kontrollmaterial krävs noggrann selektion där poolat material förmodligen fungerar bäst. Att skrapa material från färsk vävnad, som här gjordes från tonsill, tycks vara framgångsrikt. En annan förutsättning att denna metod ska fungera är optimering av prepareringsstegen vid Cytospin™ där bland annat ett högre varvtal skulle kunna säkra kontrollmaterialet på objektglaset så cellerna inte försvinner. Även optimering av färgprotokoll där några få justeringar av inkubations-temperaturer och -tider möjligen skulle kunna eliminera bakgrundsfärgningar som uppstod vid infärgning med anti-CD20. För att kunna förbereda objektglas med kontrollmaterial skulle även en hållbarhetsstudie av dessa behöva utföras med hänsyn till cellernas bevarande över tid och vilken miljö som är bäst lämpad för förvaring.

Resultaten uppnådde syftet av arbetet som var framställning av positivt kontrollmaterial. Korrelationen mellan kontrollmaterialet och patientprovet bedömdes bra och metoden framstår som lovande. Kombinationen av ThinPrep™-prepareringsmetod och applicering med Cytospin™ var framgångsrik för kontrollmaterialet och följande applicering av patientprov med ThinPrep™ 5000 processor gjorde det möjligt att få kontrollmaterial och patientprov på samma objektglas utan att skada cellerna.

TACK

Jag vill främst tacka Margareta Nilsson, Kristina Bramstedt, Sofie Rolf, Rosita Fust, Henrik Engström och Marek Witkowski för att ni hjälpt mig med allt från de praktiska laborationsmomenten till resultat och skrivarbete.

(27)

REFERENSER

1. Kinoshita Y YT, Yoshizawa K, Takasu K, Emoto Y, Tsubura A, Shikata N. Romanowsky staining using liquid-based cytology: A pilot study using

Cytolyt(®)/HESPANDER(®) processing solution for ThinPrep(®) preparations. Diagnostic cytopathology. 2015 Dec;43(12):960-5.

2. Koss LG MM. Koss’ diagnostic cytology and its histopathologic bases. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2006.

3. Hologic Inc. HOLOGIC THINPREP 5000 OPERATOR'S MANUAL Pdf Download. [Internet]. 2018. Available from:

https://www.manualslib.com/manual/1312347/Hologic-Thinprep-5000.html 4. van Hemel BM SA. Effective application of the methanol-based PreservCyt(™)

fixative and the Cellient(™) automated cell block processor to diagnostic cytopathology, immunocytochemistry and molecular biology. Diagnostic cytopathology. 2013 Aug;41(8):734-41.

5. ThermoFisher Scientific. Cytospin™ 4 Cytocentrifuge, CytoSpin 4 [Internet]. 2018. Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78300003 6. Kshatriya AS, Santwani PM. Comparison of FNAC smears, cytospin smears, and

cellblocks of transthoracic guided FNAC of suspected lung tumor: A study of 100 cases. J Cytol. 2016;33(3):141-44.

7. Burry RW. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 2011 Jan;59(1):6-12.

8. Hansen T, Pedersen H, Brauner V, Hariri J. Control specimens for

immunocytochemistry in liquid-based cytology. Cytopathology. 2011 Aug Aug;22(4):243-6.

9. Levenson RM BA, Angelo M. Immunohistochemistry and mass spectrometry for highly multiplexed cellular molecular imaging. Laboratory Investigation. 2015 Apr;95(4):397-405.

10. Utbildningsdokument: BenchMark ULTRA Training. Ventana. Roche Tissue Diagnostics EMEA-LATAM Education and Training Center. 2012.

11. Stradleigh TW, Ishida AT. Fixation Strategies For Retinal Immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye research. 2015 Sep;48:181-202.

12. Mason DY, Comans-Bitter WM, Cordell JL, Verhoeven MA, van Dongen JJ. Antibody L26 recognizes an intracellular epitope on the B-cell-associated CD20 antigen. Am J Pathol. 1990;136(6):1215-1222.

13. Chu PG, Loera S, Huang Q, Weiss LM. Lineage determination of CD20-B-Cell neoplasms: an immunohistochemical study. Am J Clin Pathol. 2006;126(4):534-544. 14. Schmid C, Pan L, Diss T, Isaacson PG. Expression of B-cell antigens by Hodgkin’s

and Reed-Sternberg cells. Am J Pathol. 1991;139(4):701-707.

15. Ventana Medical Systems. CONFIRM anti-CD20 (L26) Primary Antibody [Internet]. 2018. Available from: http://ventana.com/product/36?type=31

16. Matter M, Schwarz E, Marafioti T, Rechsteiner MP, Moch H. Immunohistochemical detection of CD3 in T-cell lymphomas: superior sensitivity of rabbit monoclonal 2GV6 antibody compared to mouse monoclonal F7·2·38 antibody. J Histotechnol.

2014;37(1),21-25.

(28)

epsilon complexes in fetal NK cells. Implications for the relationship of NK and T lymphocytes. J Immunolol. 1992,149(6),1876-80.

18. Ventana Medical Systems. CONFIRM anti-CD3 (2GV6) Rabbit Monoclonal Primary Antibody [Internet]. 2018. Available from: http://ventana.com/product/30?type=25 19. Lersch R, et al. Sequence and expression of type II keratin, K5, in human epidermal

cells. Molecular and Cellular Biology. 1988; 8:486-93.

20. Dabbs DJ, et al. Basal phenotype of ductal carcinoma in situ: recognition and immunohistologic profile. Mod Pathol. 2006; 19:1506-11.

21. Ordoñez NG. What are the current best immunohistochemical markers for the

diagnosis of epithelioid mesothelioma? A review and update. Human Pathology. 2007; 38:1–16.

22. Ventana Medical Systems. Cytokeratin 5 (SP27) Rabbit Monoclonal [Internet]. 2018. Available from: http://www.ventana.com/product/1797?type=2288

23. Wick MR, et al. Immunohistology of the Gastrointestinal Tract, Pancreas, Bile Ducts, Gallbladder, and Liver. Diagnostic Immunohistochemistry, 2nd Edition. Philadelphia, PA. Elsevier Inc; 2006:464-465.

24. Ventana Medical Systems. CONFIRM anti-Cytokeratin 7 (SP52) Rabbit Monoclonal Primary Antibody [Internet]. 2018. Available from:

http://www.ventana.com/product/71?type=66

25. Keng PC, Siemann DW. Measurement of proliferation activities in human tumor models: a comparison of flow cytometric methods. Radiatn Oncol Investig, 6(3):120-7, 1998

26. Rey A Lara PC. Ki67 proliferation index in tumors of the upper urinary tract as related to established prognostic factors and long-term survival. Arch Esp Urol, 51(2): 204-10, 1998.

27. Bacchi CE, Gown AM. Detection of cell proliferation in tissue sections. Braz J Med Biol Res, 26(7): 677-87, 1993.

28. Alliegro M. Coiled body heterogeneity induced by G(1) arrest with amiloride bumetanide. Exp Cell Res, 279(1): 111-17, 2002.

29. Scholzen T Gerdes J. The Ki-67 protein from the know and the unknown. J Cell Physiol, 182(3): 311-22, 2000.

30. Ventana Medical Systems. CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody [Internet]. 2018. Available from: http://ventana.com/product/114?type=108 31. May RJ, et al. Peptide epitopes from the Wilms’ tumor 1 oncoprotein stimulate CD4+ and CD8+ T cells that recognize and kill human malignant mesothelioma tumor cells. Clin Cancer Res. 2007; 13: 4547-55.

32. Foster MR, et al. Immunohistochemical analysis of nuclear versus cytoplasmic staining of WT1 in malignant mesotheliomas and primary pulmonary adenocarcinomas. Arch Pathol Lab Med. 2001; 125:1316-20.

33. Cell Marque. WT1 - 6F-H2: Mouse Monoclonal. [Internet]. 2018. Available from: http://www.cellmarque.com/antibodies/CM/152/WT1_6F-H2

34. Metodbeskrivning Exsudat. C Nilsson, M Lindén. Avdelning för klinisk patologi och cytologi. Länssjukhuset Kalmar. 2017.

35. Metodbeskrivning immuncytokemi. J Björkemar, M Lindén. Avdelning för klinisk patologi och cytologi. Länssjukhuset Kalmar. 2015.

(29)

https://www.riksdagen.se/sv/dokument- lagar/dokument/svensk-forfattningssamling/lag-2003460-om-etikprovning-av-forskning-som_sfs-2003-460

37. ThermoFisher Scientific: Shandon™ Single Cytofunnel™ with White Filter Cards [Internet]. 2018. Available from:

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5991040?SID=srch-srp-5991040 38. ThermoFisher Scientific:Shandon™ Double Cytofunnel™ [Internet]. 2018. Available

from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/1102547?SID=srch-srp-1102547

39. L.P Hedner. Invärtesmedicin. 10:e uppl. Lund: Studentlitteratur; 2011.

40. Norman I BS, Zhu J, Gaberi , Hagmar B, Hjerpe A, Andersson S. p16(INK4a)

(30)

Bilaga I Protokoll summering av antikroppsinfärgning

CD20

1. Värme Förbehandling [Vald] 2. ULTRA Conditioner 1 [Vald]

3. Värmer upp glasen till 95°C, och inkuberar i 8 minuter (Cell Conditioner nr. 1) 4. 20 minuter med ULTRA CC1 [Vald]

5. 36 minuter med ULTRA CC1 [Vald] 6. 52 minuter med ULTRA CC1 [Vald] 7. 64 minuter med ULTRA CC1 [Vald]

8. Temperaturer för antikroppsinkubering [Vald]

9. Värmer upp glas till 37°C, och inkuberar i 4 minuter (antikropp) 10. Antikropp [Vald]

11. Applicerar en droppe av CD20 (antikropp), applicerar Coverslip och inkuberar i 16 minuter

12. Kontrastfärgning [Vald]

13. Applicerar en droppe av Hematoxylin (kontrastfärgning), applicerar Coverslip och inkuberar i 4 minuter

14. Efter-kontrastfärgning [Vald]

15. Applicerar en droppe av Bluing Reagent (efter-kontrastfärgning), applicerar Coverslip och inkuberar i 4 minuter

CD3

5. 36 minuter med ULTRA CC1 [Vald] 6. 52 minuter med ULTRA CC1 [Vald]

8. Vämer upp glas till 37°C, och inkuberar i 4 minuter (antikropp) 9. Antikropp [Vald]

10. Applicerar en droppe av CD3 (antikropp), applicerar Coverslip och inkuberar i 32 minuter

11. ultraWash

CK5

(31)

7. Applicerar en droppe av PROTEASE 3 (enzym), applicerar Coverslip och inkubera i 4 minuter

9. Värmer upp glasen till 37°C och inkuberar i 4 minuter (antikropp) 10. Antikropp [Vald]

11. Applicerar en droppe av CK5 (antikropp), applicerar Coverslip och inkuberar i 32 minuter

12. ultraWash [Vald] 13. Kontrastfärgning [Vald]

CK7

11. Applicerar en droppe av CK7 (antikropp), applicerar Coverslip och inkuberar i 32 minuter

Ki67

5. 36 minuter med ULTRA CC1 [Vald]

9. Applicerar en droppe av Ki-67 (antikropp), applicerar Coverslip och inkuberar i 32 minuter

10. ultraBlock [Vald]

(32)

WT1

11. Applicerar en droppe av WT1 (antikropp), applicerar Coverslip och inkuberar i 32 minuter