Utveckling och tillämpning av vätskebaserad cytologi: En metodoptimering för bronkiala borstbiopsier, pleuraexsudat och ascitesvätska

Examensarbete, 15 hp

Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2019

Utveckling och tillämpning av vätskebaserad cytologi

En metodoptimering för bronkiala borstbiopsier, pleuraexsudat och ascitesvätska

Lucas Grape

Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk analytikerprogrammet

Examensarbete, 15 hp

Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson ylva.hedberg.fransson@umu.se

Läraropponent: Ylva Hedberg Fransson

Examinator: Mari Norgren

Datum för godkännande: 2019 06 11

Optimization and Application of Liquid Based Cytology for Lung and Ascites Samples

Handledare

Charlotta Andersson, Klinisk patologi och cytologi, Norrlands universitetssjukhus

Nyckelord

lungcancer, vätskebaserad cytologi, ThinPrep, exsudat, ascites, borstbiopsier

3

Abstrakt

Lungcancer diagnosticeras ofta i ett avancerat stadie vilket medför en dålig prognos då högre stadie- tillhörighet korrelerar mot högre mortalitet. Diagnos ställs med mikroskopisk undersökning av konventionella cytologiutstryk, men metoden har sina brister och en bättre metod är önskvärd. För cervixcytologi används en vätskebaserad metod enligt ThinPrep®-metodologi (TP). Metoden har medfört ett antal fördelar över konventionella utstryk såsom standardiserad lagertjocklek, eliminering av lufttorkningsartefakter, bättre bibehållna celler och eliminering av obstruktiva blod- och inflamma- tionskomponenter. Syftet var att optimera TP för borstbiopsier, pleuraexsudat och ascitesvätskor samt att jämföra TP mot konventionell preparering. Materialet utgjordes av åtta borstbiopsier, 24 pleura- exsudat och 14 ascitesvätskor. TP-metoden optimerades på ett antal parametrar och ett bedömnings- formulär upprättades. Användningen av Non-Gyn och PAP-test-filter gav likartade provkvalitéer.

Optimeringen av buffertar resulterade i att Jkp40-bufferten gav bäst lysering av erytrocyter. Prover behandlade med TP-metoden saknade blodiga obstruktioner till skillnad från analys med

konventionell metod. Lufttorkade prover blev bättre infärgade än de etanolfixerade. Vid bedömning av borstbiopsier minskades antalet glas med TP vilket medförde kraftigt förkortade bedömningstider.

May-Grünewald-Giemsa-färgning av pleura och ascites var lågkvalitativ. I ett fall skiljde sig diagnosen mellan metoderna. Slutsatsen var att TP eventuellt kan införas för borstbiopsier, men för pleura och ascites krävs ytterligare metodoptimering.

4

Introduktion

Utvecklingen av lungcancer är en flerstegsprocess där normalt bronkialepitel omvandlas till maligna celler. Tumörgenesen är invecklad och består av ett flertal olika molekylära händelseförlopp som leder till förändrad cellfunktion, vilket i sin tur orsakar dysfunktionell genetisk reglering av cellulär

proliferation, differentiering, apoptos, migration och invasion. Olika mutationer som substitutioner, deletioner, translokationer och amplifieringar av genetiskt material kan bero på miljöfaktorer, randomiserade omständigheter och hereditära faktorer. Tumörens genetiska abnormiteter fortsätter att orsaka skada bortom enbart den initiala utvecklingen av en neoplasi, utan påverkar även processer som metastasfenomen och terapisvikt vid progredierad sjukdom (1). Lungcancer är ett stort globalt hälsoproblem och bidrar till 30% respektive 26% av cancerrelaterade dödsfall hos män respektive kvinnor (2). Incidens och mortalitet av lungcancer har undersökts i korrelation mot nationsspecifika socioekonomiska förhållanden, framförallt i förhållande mot Human Development Index (HDI) och Brutto Nationalprodukt (BNP) per capita. Incidensen och mortalitet är högre i länder med högre socioekonomisk utveckling, dock lider många utvecklingsländer av en glidande uppåttrend, speciellt bland kvinnor (3). Detta antyder att det finns gagn med preventiva strategier samt bättre diagnostiska metoder för tidigare upptäckt av sjukdom. När en lungcancerdiagnos ställs är det förekommande att kirurgiska ingrepp inte är möjliga, vilket medför en dålig prognos. Huruvida kirurgi är möjligt avgörs av tumörens storlek och placering, involvering av regionala lymfkörtlar och metastasbild. Dessa faktorer utgör TNM-systemet vilket används för att klassificera och stadieindela en lungcancer från stadie I - IV (4). För lungcancer i stadie I är 1-års-överlevnaden 81–85% jämfört med 15–19% i stadie IV.

Lungcancer indelas i de histologiska typerna småcellig lungcancer (SCLC), med cirka 15% prevalens, och icke-småcellig lungcancer (NSCLC), med cirka 85% prevalens. Vidare utgörs NSCLC av

adenocarcinom (ADC) och skivepitelcarcinom (SCC), där identifiering av särskilda DNA-mutationer med molekylärbaserade metoder delar upp subtyperna ytterligare (5).

Konventionella cytologimetoder har länge varit trygga, säkra och beprövade sätt att ställa diagnos, däremot är de ofta tids- och arbetskrävande. En vätskebaserad metod med ThinPrep® (TP) metodologi är en vedertagen metod för preparering av cervixprover. Metoden har vid lungcytologi visats medföra ett antal fördelar över konventionella utstryk, exempelvis enhetlig lagertjocklek, eliminering av lufttorkningsartefakter, bättre bibehållna celler och eliminering av obstruktiva blod- och inflammationskomponenter (6). God korrelation mellan TP och konventionell preparering har observerats för finnålsaspirationer. Vid metodjämförelse är TP lättare och mindre tidskonsumerande för diagnostikern varvid metoden lämpar sig väl för screening (7). TP-systemet fungerar genom att kontinuerligt mäta ett vätskeflöde samt tryck över ett filtermembran under en uppsamlingsfas, tills ett lämpligt antal celler har uppsamlats, därefter stansas cellerna ut på ett objektsglas. Detta resulterar i en standardiserad preparation där celldensiteten på glasen är lagom tät, dessutom har mängden cellöverlappning och bakgrund minskats (8). Andra försök har gjorts där TP föredras jämfört med konventionell cytospin baserat på bland annat bättre cellularitet vid lungcytologi, urincytologi och cytologi på andra kroppsvätskor (9).

5

Metoden har testats för att bättre kunna differentiera mellan olika typer av lungcancer, av de olika histologiska typerna av lungcancer är SCLC den som oftast är falsk negativ eftersom avsevärd cellatrofi leder till att tumörcellerna lätt misstas för normala lymfocyter. I dessa fall har TP uppvisat en likvärdig förmåga som konventionell preparering att identifiera SCLC (10). Det finns nackdelar med TP, arte- fakter och diagnostiska fallgropar som inte ses vid konventionell preparering förekommer. Detta ställer krav på att vederbörande diagnostiker håller sig ajour om den morfologiska skillnaden som kan uppstå mellan konventionell- och vätskebaserad preparering. Det finns studier som understryker att TP inte haft en signifikant skillnad kontra konventionell preparering avseende diagnostiskt värde på vissa tillstånd och provmaterial, bland annat mesoteliom och adenocarcinom i pleuraexsudat (11).

Vid klinisk cytologi i Umeå önskade cytodiagnostiker och övrig laboratoriepersonal att en vätske- baserad metod implementeras, men ett antal problem med gängse rutiner har identifierats av

personalen. De prover som testats enligt existerande protokoll för cervixcytologi har visat höga nivåer av utfällningar och bakgrund som omöjliggjort en säker diagnostik. Således måste ett enskilt protokoll för dessa provmaterial tas fram. Syftet med detta arbete var att optimera TP för borstbiopsier,

pleuraexsudat och ascitesvätskor samt att jämföra TP mot konventionell preparering.

6

Material och metoder

Patientmaterial

Proverna utgjordes av 24 pleuraexsudat, 8 borstbiopsier och 14 ascitesvätskor från Norrlands universitetssjukhus (NUS) (Umeå, Sverige). Könsfördelning, ålder, överlevnadsdata och behandling har exkluderats i denna studie. Inga särskilda urvalskriterier har förekommit. Proverna var initialt preparerade enligt konventionell metod, vilket gjordes genom att provmaterialet centrifugerades för att koncentrera cellerna följt av att pelleten ströks ut mellan två objektsglas.

Vätskebaserad preparering enligt TP-metod

Arbetsrutinen för vätskebaserad preparering enligt TP (TP-metod) skedde genom att 10 mL

patientmaterial överfördes till ett 50 mL Falconrör och centrifugerades i 5 min, 400 G (Rotanta 460 RS, Hettich Zentrifugen). Supernatanten dekanterades och pelleten resuspenderades i en TP-burk innehållande PreservCyt®-solution (Hologic Inc, Marlborough, MA USA). Burken fick stå i minst 15 min för efterfixering för att sedan prepareras på ThinPrep 5000 Benchtop (T5000) (Hologic Inc) enligt prepareringsprogram ”Non-Gyn” med ThinPrep Non-Gyn filters (Hologic Inc) på ThinPrep PAP Test Microscope slides (Hologic Inc). De erhållna glasen fixerades i 15 min i 95% EtOH följt av

färgning enligt Papanicolau på Tissue-Tek Prisma Plus (Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Nederländerna).

Borstbiopsier

Borstbiopsier anlände i TP-burkar varefter borstarna plockades ut och preparerades direkt på T5000 enligt TP-metod.

Volymoptimering

Patientmaterialet alikvoterades till åtta TP-burkar med 10 mL patientmaterial samt sju TP-burkar med 20 mL patientmaterial. Proverna centrifugerades i 5 min, 400 G (Rotanta 460 RS). Supernatanten dekanterades och pelleten resuspenderades i en TP-burk. Proverna preparerades på T5000 enligt TP- metod.

Filteroptimering

De 15 TP-burkarna från volymoptimeringen användes för att optimera val av filter. Dessa

preparerades på T5000 enligt TP-metod, fast med ThinPrep PAP test filters (Hologic Inc). Preparaten jämfördes mot de som erhölls från volymoptimeringen.

Lyseringsoptimering – mängdförhållande i lyseringsvätska

Dubbelprov preparerades enligt TP-metod, men analyserades inte på T5000, utan följdes av lysering via gängse för cervixprover vid klinisk patologi och cytologi, NUS. Sex olika lyseringslösningar med olika mängdförhållande testades, dessa hade 10%, 20%, 30%, 40%, 45% och 50% koncentrerad isättika spädd i CytoLyt Solution (Hologic Inc). Dessa respektive lyseringslösningar namngavs U10, U20, U30, U40, U45 och U50 och användes för att lysera proverna genom att 7 mL prov blandades med 7 mL lyseringslösning. Detta centrifugerades i 5 min, 1474 g (Rotanta 460 RS). Sedan avlägsnades

7

supernatanten och pelleten resuspenderades i nya TP-burkar. Dessa fick stå i 15 min för fixering därefter preparerades de på T5000 enligt TP-metod.

Lyseringsoptimering

Rutin för lysering erhölls från Klinisk patologi, Region Jönköping (Jönköping, Sverige), som skiljde sig från förfarandet i Umeå med avseende på koncentration av isättika samt preparering av prover. Istället för att använda koncentrerad isättika späddes den till de fem koncentrationer 50%, 40%, 30%, 20%

och 10% med destillerat vatten. Dessa respektive koncentrationer namngavs Jkp50, Jkp40, Jkp30, Jkp20 och Jkp10. Istället för en initial preparering enligt TP-metod användes 10 mL opreparerat patientmaterial som centrifugerades i 5 min vid 1474 g (Rotanta 460 RS). Supernatanten avlägsnades och pelleten resuspenderades i 7 mL CytoLyt och 7 mL spädd isättika. Detta centrifugerades under 5 min i 1474 g följt av att supernatant dekanterades och pelleten resuspenderades i TP-burk. Proverna preparerades på T5000 (Hologic Inc) enligt TP-metod.

Fyra patientprover valdes, dessa preparerades enligt TP-metod i två omgångar samt enligt lyserings- rutin för U40, U50 samt Jkp40 och Jkp50. Proverna preparerades på T5000. Slutlig bedömning gjordes av cytodiagnostiker med avseende på allmän kvalité. Därefter valdes lyseringsmetoden Jkp40 för vidare studier.

Färgningsoptimering

Dubbelprover preparerades i två omgångar med Jkp40. En omgång prover lufttorkades och den andra omgången prover efterfixerades i 95%-ig EtOH. Efter preparering färgades glasen på Leica Autostainer XL (Leica Biosystems) eller Tissue-Tek Prisma Plus (Sakura Finetek) enligt May-Grünewald-Giemsa (MGG). Därefter monterades glasen med täckglas och utvärderades av cytodiagnostiker med avseende på bedömningskriterier för TP.

Bedömningskriterier för analys av TP kontra KC

Efter optimering postulerades ett bedömningsformulär samt ett arbetsprotokoll baserat på studiens dåvarande resultat. Bedömning skedde av studenten i samråd med två erfarna cytodiagnostiker.

Bedömningar skedde enskilt, kriterierna var cellularitet, kärnfärgning, inflammatorisk komponent, blodmängd, allmän kvalité och diagnos.

Etiska överväganden

Provmaterialet erhölls som överblivet material efter gängse rutin och omhändertagande, således utsattes ej patienten för ett ytterligare provtagningstillfälle och därmed åsamkades inget ytterligare trauma på patienten. Proverna användes för kliniskt utvecklingsarbete vilket i enlighet med

biobankslagen kapitel 2, 2§ är en godtagbar anledning för att spara provmaterial. Proverna avidentifierades efter jämförelse med originalglas samt randomiserades två gånger inför presentationen av resultaten. Ingen spårning till provens ursprungliga identiteter är tillgänglig.

Därmed behövdes ej studien etikgranskas.

8

Resultat

Optimering av provvolym i relation till cellularitet

Efter jämförelse av preparering med 10 mL samt 20 mL patientmaterial ansågs i 14/20 prover

bedömdes vara likvärdiga med avseende på cellularitet. Bland de utförda 20 bedömningarna ansågs 10 mL patient-material ge högre cellularitet i ett fall samt lägre cellularitet i två fall. I tre fall ansågs glasen ej vara bedömbara. Baserat på dessa resultat och för att spara värdefullt material valdes 10 mL patientmaterial som standardvolym under studiens fortsatta gång.

Filteroptimering med avseende på Non-Gyn filter eller PAP-test filter

Vid jämförelse mellan Non-Gyn och PAP-test-filter noterades att de preparerade glasen var blodiga och hade hög nivå av bakgrund och inflammatoriska komponenter. Cellulariteten ansågs låg med viss variation. Slutlig bedömning i samråd med legitimerade cytodiagnostiker visade ingen skillnad i provkvalité mellan Non-Gyn och PAP-test-filter för detta ändamål. Vid fortsatta analyser användes PAP-test filter av ekonomiska skäl.

Lyseringsoptimering med avseende på blodmängd och artefakter

Proverna lyserades med olika koncentrationsförhållanden mellan isättika och CytoLyt. Försöket visade att lyseringsbuffertarna U10-U30 gav blodiga preparat. Gällande U40-U50 var glasen ej blodiga och med få fällningar. Jkp10-Jkp30 visade viss fällning och blodig bakgrund. Jkp40 och Jkp50 gav få fällningar utan förekomst av blod. Vid jämförelse mellan U40, U50, Jkp40 och Jkp50 gjordes en bedömning att Jkp40 var det bästa alternativet och skulle således användas vid fortsatta studier.

Färgningsoptimering med avseende på lufttorkad kontra etanolbaserad efterfixering för MGG

Proverna färgades med MGG och en skillnad i färgmättnad avseende infärgningen av cellkärnor sågs vid jämförelse av de etanolfixerade kontra de lufttorkade proverna. Vid etanolfixering blev proverna svårbedömda medan de lufttorkade proverna gav synligare strukturer i kärnan. En skillnad i allmän färgningskvalité mellan Leica Autostainer XL och Tissue-Tek Prisma plus kunde konstateras, där den senare ansågs bättre till följd av tydligare infärgning av cellkärnor. Tissue-Tek Prisma Plus medförde automatisk montering av glasen, en funktion som Leica Autostainer XL inte hade. I samråd med cytodiagnostiker valdes lufttorkade glas samt färgning på Tissue-Tek Prisma Plus som det optimala förfarandet för vidare studier.

Slutlig bedömning av TP kontra KC

Det var ingen distinkt skillnad i cellularitet eller inflammatorisk komponent mellan TP och KC enligt bedömarna. Det bedömdes finnas en positiv skillnad i blodmängd för TP jämfört med KC, där TP uppvisade renare glas utan blodiga obstruktioner. Denna bedömning gjordes av samtliga bedömare (Tab.1–3). Färgningskvalitén ansågs för PAP-KC och MGG-KC att vara av god kvalité, även PAP-TP ansågs vara av god kvalité. Dessvärre var MGG-TP av medel till låg kvalité med tydligt mörkare cellkärnor och cytoplasma enligt bedömare 3 (Tab. 3). Denna åsikt delades av de andra bedömarna.

9

Det fanns en tillsynes positiv skillnad i tidsåtgång av bedömningen för borstbiopsier vid TP jämfört med KC, detta observerades av båda bedömarna där detta var ett kriterium (Tab. 1 och 2).

10

Diskussion

Hög incidens, hög mortalitet och ekonomisk tyngd på samhället till följd av lungcancer medför att det alltid finnas ett incitament för utveckling av nya, snabbare och säkrare tekniker för diagnostik (5).

Vätskebaserad cytologi fortsätter vara ett område med stor potential och vidare forskning på metoden är viktig. Fördelarna med TP är tydligt klarlagda, de innefattar bland annat standardiserad

preparering, kraftig minskning av tidsåtgång per fall, bättre bibehållna celler och enhetlig lagertjocklek (6–7). Det har påvisats att ett glas preparerat enligt TP kan motsvara ett diagnostiskt värde av 2–4 glas med KC (12). Däremot diskuteras det mer sällan om de potentiella nackdelarna med metoden, något som har identifierats under denna studie.

Vid studier av olika lungcancerformer har TP visat sig ha störst diagnostiskt värde vid SCC och något lägre värde vid ADC samt SCLC, något som kan antas bero på svårigheter vid provtagning för de sistnämnda typerna (2). Däremot kan ytterligare en faktor förklara varför ADC inte har fungerat bra med TP, nämligen förekomsten av Invasiv Mucinös Adenocarcinom (IMA) vilket tillhör sub-

grupperingen Mucinös Adenocarcinom (MA) vilket i sin tur är en subtyp av ADC. Histologiskt karaktäriseras denna typ av cancer av cylinderepitel med tydliga mucus-strukturer. Denna subtyp karaktäriseras av produktion av mucus samt uttryck av KRAS-mutationer samt avsaknad av uttryck för Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1) (13). Dock visade IMA lågt uttryck av mutationer i p53, vilket vanligtvis förekommer hos ADC (14). Under denna studie upptäcktes att de mucusstrukturer som är ett starkt indicium för IMA försvann vid TP, något som inte noterades vid KC. Detta kan förmodligen kopplas till att i denna metod utfördes en direktlysering av proverna i samband med preparering, det kan poneras att lyseringslösningen förstörde mucusstrukturerna. Utan vidare studier är dock detta inte något som kan fastslås. Denna diagnos är förhållandevis ovanlig, cirka 5% av ADC (15), till följd av hög incidens av ADC kan detta antas vara ett potentiellt problem vid TP. En eventuell lösning på detta problem har föreslagits vara komplementanalyser med cellblock såväl som

immunhistokemiska analyser med avseende på p53, STK11, NKX2-1 och SETD2 (16).

Ett problem som identifierades under studiens gång var låg färgningskvalité på MGG-färgningen.

Trots de optimeringsförsök som gjordes kvarstod en tydlig tendens till mörka preparat, framförallt med avseende på cytoplasma och cellkärnor. Detta föranledde stor förvirring, men färgningen blev något tydligare vid lufttorkning av glasen, snarare än vid efterfixering i 95% EtOH. Dock kvarstår frågeställningen om detta är ett problem, eller ett signum för TP. Olika prepareringstekniker har fördelar och nackdelar och ger en varierande cellbild, resultatet kan vara en effekt av detta. En antydan till detta noterades då samma fenomen har åskådliggjorts förut, där glasen haft låg kvalité för just MGG (17). ven nyare studier har funnit att detta var fallet, där MGG-TP var av lägre kvalité än PAP-TP dock fortfarande godkänt för diagnostiskt bruk (18).

Ytterligare ett problem som identifierats med tekniken är tämligen konsekvent förekomst av inflammatoriska komponenter, något som kan bero på inneboende egenskaper hos ThinPrep 5000 Benchtop. Eftersom systemet räknar antal events samt tryck för att avgöra celldensiteten på glaset, kan det eventuellt resultera i att inflammatoriska celler ökar i takt med att erytrocyter lyseras bort.

11

Dessa inflammatoriska komponenter kan vara obstruktiva men i generellt lägre utsträckning än vad erytrocyter är. Intern kommunikation med Klinisk cytologi i Uppsala berättar att en annan leverantör av vätskebaserad cytologi (SurePath, Becton Dickinson, NJ, USA) inte har dessa problem med inflammatoriska komponenter, dessvärre har inga bredare studier utförts där detta varit en specifik frågeställning, men det har visat sig att diagnostiken i allmänhet förbättrats med SurePath med avseende på CIN I och CIN II (19), huruvida dessa två faktorer är kopplade är dock än idag oklart.

Vidare noterades att äldre prov kan ge upphov till rikligt med degenererade celler, särskilt vid volymoptimering när prover vilka kylförvarats i upp till fyra månader analyserades. För framtida studier bör noteras att provkvalitén försämras avsevärt efter 1–2 veckors förvaring i kyl varför direkt preparering och suspension i PreservCyt av provmaterial är att rekommendera.

Volymoptimering visade att 10 mL patientmaterial gav likvärdig cellularitet som 20 mL

patientmaterial, vilket är fördelaktigt ur en resurssynvinkel. Ibland anländer särskilt materialfattiga prover, i de fallen är denna insikt till gagn. Dessutom kan antas att en lägre volym patientmaterial medför en lägre grad av blod och inflammation, även om det påståendet inte stärks i denna studie.

Optimering av filter visade ingen skillnad i provkvalité mellan PAP-test filter och Non-Gyn filter, trots att det fanns en skillnad mellan dem med avseende på porstorlek. PAP-test filter har 6,9 µm stora porer och Non-Gyn filter har 5,6 µm stora porer. Detta bör ha gett upphov till en skillnad i cellularitet och blodmängd mellan preparaten. Det är tänkbart att det begränsade provunderlaget inte påvisade detta på ett rättvist sätt. En viktig aspekt är köpeskillingen mellan de två, PAP-test filter är billigare än Non-Gyn filter.

Lyseringsoptimeringen jämförde två olika metoder, gängse metod i Umeå jämfört med den vid Klinisk patologi i Jönköping. Den optimala metoden ansågs vara Jönköpingsmetoden med 7 mL 40%-ig isättika och 7 mL CytoLyt. Vid koncentrationer över 40% noterades att mängden artefakter ökade kraftigt och vid koncentrationer under 40% blev lyseringseffekten försumbar. Utöver att metoden gav effektiv lysering utan att höja mängden artefakter, var den dessutom marginellt billigare och mer tidseffektiv.

Från den slutliga bedömningen bör åskådliggöras att i endast en av 31 bedömningar skiljde sig diagnosen mellan KC och TP, något som noterades av båda bedömarna. I det aktuella fallet handlade det om en borstbiopsi som enligt KC var malign/atypi men enligt TP var benign. Huruvida detta är ett resultat av metoden eller andra faktorer kan i dagsläget inte fastställas, men det kan antas att de maligna cellerna inte hamnade på glaset. För borstbiopsierna noterades en positiv trend med minskad tidsåtgång, eftersom en borstbiopsi i regel innebär ett avsevärt större antal glas att analysera, i ett fall ingick 13 glas för en enskild borstbiopsi i KC, vilket minskades till ett glas för TP. Denna minskning i representativt provmaterial kan dock ha varit anledningen till den tidigare nämnda skillnaden i diagnos mellan KC och TP, något som bör utvärderas vidare. Den undermåliga MGG-färgningen hade ingen inverkan på den slutliga diagnosen, tack vare en god PAP-färgning för samtliga prover. Dock var MGG-färgningen i nästan samtliga fall överfärgad och i vissa fall till den grad att den blev ej

12

bedömbar. En enskild studie som enbart fokuserar på MGG-färgning torde vara nästa steg framåt i processen att introducera TP för de prover där MGG färgas på rutin.

Konklusionen är att TP optimerades med avseende på ett antal parametrar och kan eventuellt införas för borstbiopsier, men för pleura och ascites krävs ytterligare metodoptimering.

13

Tack tillägnas

Jag vill tacka Helén Waern och Åsa Burström på Klinisk cytologivid NUS för deras goda samarbete, uppvisade tålamod och vilja att dela med sig av sin kompetens under tiden vi delade labbutrymme. Jag vill tacka samtliga cytodiagnostiker på klinisk cytologi på NUS som gått utanför den dagliga

verksamheten och hjälpt mig på bedömningsfronten. Jag vill särskilt tacka cytodiagnostiker Fredrik Norberg som varit min bihandledare och som har spetsat projektet, bidragit med majoriteten av bedömningar och utlånat sin kunskap gång på gång.

14

Referenser

1. Kaufman J, Horn L, Carbone D. (2012). Lung Cancer. In Cancer: Principles & practice of

Oncology: Primer of the Molecular Biology of Cancer. DeVita V, Lawrence T, Rosenberg S, editors.

Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 216-230 ISBN: 978-1451118971

2. Liu C, Wen Z, Li Y , Peng L. Application of ThinPrep bronchial brushing cytology in the early diagnosis of lung cancer: A retrospective study. PLoS One. 2014;9(4):e90163

3. Wong M, Qian Lao X, Ho K-F, Goggins W, Tse S. Incidence and mortality of lung cancer: global trends and association with socioeconomic status. Sci Rep. 2017;7(1):14300

4. Baltayiannis N, Chandrinos M, Anagnostopoulos D et al. Lung cancer surgery: an up to date. J Thorac Dis. 2013;5(4):425-439

5. Blandin Knight, S. Crosbie P, Balata H, Chudziak J, Husell T, Dive C. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biol. 2017;7(9):170070

6. Konofaos P, Tomos P, Malagari K et al. The role of ThinPrep cytology in the investigation of lung tumors. Surg Oncol. 2006;3(15):173-178.

7. Dey P, Luthra UK, George J, Zuhairy F, George SS, Haji BI: Comparison of ThinPrep and

conventional preparations on fine needle aspiration cytology material. Acta Cytol. 2000;44(1):46- 50.

8. Rana D, O’Donnel M, Malkin A, Griffin M. A comparative study: conventional preparation and ThinPrep® 2000 in respiratory cytology. Cytopathology. 2001;12(6):390-398.

9. Elsheikh T, Kirkpatrick J, Wu H. Comparison of ThinPrep and cytospin preparations in the evaluation of exfoliative cytology specimens. Cancer. 2006;108(3):144-149.

10. Kim S, Owens C. Analysis of ThinPrep cytology in establishing the diagnosis of small cell carcinoma of the lung. Cancer. 2009;117(1):51-56.

11. Ylagan LR, Zhai J. The value of ThinPrep and cytospin preparation in pleural effusion cytological diagnosis of mesothelioma and adenocarcinoma. Diagn Cytopathol. 2005;32(3):137-144

12. Koivurinne KI, Shield PW. Thin-Layer preparations of dithiothreitol-treated bronchial washing specimens. Acta Cytol. 2003;47(4):637-644

13. Liu Y, Zhang HL, Mei JZ et al. Primary mucinous adenocarcinoma of the lung: a case report and review of literature. Oncol Lett. 2017;14(3):3701-3704

14. Shim HS, Kenundson M, Zheng Z et al. Unique genetic and survival characteristics of invasive mucinous adenocarcinoma of the lung. J Thorac Oncol. 2015;10(8):1156-1162.

15

15. Yoon Jin C, Hyo Sup S. Biology of invasive mucinous adenocarcinoma of the lung. Transl Lung Cancer Res. 2017;6(5):508-512.

16. Hwang DH, Sholl LM, Rojas-Rudilla V et al. KRAS and NKX2-1 mutations in invasive mucinous adenocarcinoma of the lung. J Thorac Oncol. 2016;11(4):496-503

17. Ahmed GH, Edris MA, Mohmed AE, Hussein OM. Value of centrifugated liquid-based cytology by papanicolaou and may-grünwald in oral epithelial cells. Rare Tumors. 2009;1(1):e12

18. Kinoshita Y, Yuri T, Yoshizawa K, Takasu K, Emoto Y, Tsubura A, Shikata N. Romanowsky staining using liquid-based cytology: a pilot study using Cytolyt(®)/HESPANDER(®) processing solution for ThinPrep(®) preparations. Diagn Cytopathol. 2015;43(12):960-965

19. Rozemeijer K, Penning C, Siebers GA et al. Comparing SurePath, ThinPrep, and conventional cytology as primary test method: SurePath is associated with increased CIN II+ detection rates.

Cancer Causes Control. 2016;27: 15-25.

16

Tabell 1. Bedömning av prover preparerade enligt ThinPrep (TP) och Konventionell Cytologi (KC) enligt bedömare 1.

a Provnummer randomiserat.

b - avsåg låg förekomst, + avsåg normal förekomst, ++ avsåg hög förekomst

c Tid uppmättes enbart för borstbiopsier, N/A = Ej analyserat

Diagnos Bedömningskriterier

Prov^a Provtyp TP KC Cellularitet^b Inflam. komp.^b Blodmängd^b Bedömningstid (min:s)^c

TP KC TP KC TP KC TP KC

1 2

Pleura Ascites

Benign Benign

Benign Benign

- + - + - - + ++

++

++

+ + + ++

++

++

++

+ + ++

+ + - - + + ++

- + - -

- ++

- - - - ++

++

+ ++

++

- - + + + ++

+ + ++

++

++

- - ++

+ + - + + +

++

++

++

++

+ + ++

++

+ + + - + + - - - - + - + - + - + + - + ++

- +

++

+ + ++

+ + + + - + + - + ++

+ - - - + + ++

+ + - + + + + + - +

- - + - - + - - - - - - - - - + + + - + + ++

- - - - - + - - ++

++

++

++

++

++

++

+ ++

- + ++

- ++

++

++

++

++

++

+ + + ++

++

+ ++

++

++

++

++

+ ++

N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 6:28 8:34 6:92 6:42 6:36 9:08 8:92 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 6:04

N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 18:28 85:24 25:36 42:23 44:12 20:24 33:04 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 22:42

3 Ascites Benign Benign

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Pleura Pleura Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste Borste Borste Borste Borste Borste Borste Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste

Benign Benign Benign Atypiskt Benign Benign Malign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Malign

Suspekt malign Benign

Benign Benign Malign

Suspekta celler Benign Suspekt atypi Malign

Benign Benign Benign

Suspekt malign Benign

Benign Malign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign Benign

Suspekt malign Malign

Suspekt malign Benign

Benign Benign Malign

Suspekta celler Benign Suspekt atypi Malign

17

Tabell 2. Bedömning av prover preparerade enligt ThinPrep (TP) och Konventionell Cytologi (KC) enligt bedömare 2.

a Provnummer randomiserat.

b - avsåg låg förekomst, + avsåg normal förekomst, ++ avsåg hög förekomst

c Tid uppmättes enbart för borstbiopsier, N/A = Ej analyserat

Diagnos Bedömningskriterier

Prov^a Provtyp TP KC Cellularitet^b Inflam. komp.^b Blodmängd^b Bedömningstid (min:s)^c

TP KC TP KC TP KC TP KC

1 2

Pleura Ascites

Inflammation Suspekta celler

Inflammation Suspekta celler

- + - + + + ++

++

++

+ + + + + ++

++

++

+ + - ++

+ - - ++

+ ++

- + - -

- + - + - - ++

+ + + + + + + ++

++

++

+ ++

++

++

++

- - ++

+ ++

- + + ++

+ + + - - + ++

+ + + ++

+ ++

++

+ - ++

- - - - - ++

+ ++

++

++

++

+ - -

++

++

++

+ ++

++

++

+ + ++

+ + + + + - ++

- - - - ++

+ + ++

++

++

+ + + +

+ + + - - + - + - + - - + + - - ++

- + - - + - - - - - + - - -

++

+ + + ++

++

++

++

++

++

+ - ++

++

+ - ++

- + - - + + + ++

++

++

+ + + ++

N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 10:00 N/A 8:00 10:00 8:00 10:00 6:00 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 16:00 N/A 16:00 30:00 30:00 16:00 16:00 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

3 Ascites Benign Benign

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Pleura Pleura Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste Borste Borste Borste Borste Borste Borste Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste

Reaktivt/Benignt Inflammation Inflammation Suspekt malign Benign

Benign Malign Benign Benign

Suspekt malign Suspekt malign Suspekt malign Benign

Benign Benign Benign Benign Benign Malign N/A N/A

Inflammation N/A

Malign

Suspekta celler N/A

N/A Malign

Reaktivt/Benignt Inflammation Inflammation Suspekt malign Benign

Benign Malign Benign Benign

Suspekt malign Suspekt malign Suspekt malign Benign

Benign Benign Benign Benign Atypi Malign N/A N/A

Inflammation N/A

Malign

Suspekta celler N/A

N/A Malign

18

Tabell 3. Bedömning utförd av bedömare 3 av prover preparerade enligt ThinPrep (TP) och Konventionell Cytologi (KC).

a Provnummer randomiserat

b - avsåg låg förekomst, + avsåg normal förekomst, ++ avsåg hög förekomst

Bedömningskriterier

Prov^a Provtyp Cellularitet^b Kärnfärgning Inflam. Komp^b Blodmängd^b Allmän kvalité

TP KC TP KC TP KC TP KC TP KC

1 2

Pleura Ascites

+ - - + + - + ++

+ ++

+ ++

- + ++

++

+ + + ++

++

+ + + ++

++

++

++

+ + +

+ + - + - - ++

++

+ ++

+ + + + ++

++

++

++

++

++

++

++

+ - ++

++

++

+ + + ++

God God

God, mörk MGG God

God, mörk MGG Ljus

God, mörk MGG God, mörk MGG God

God

God, mörk MGG God

God, mörk MGG God, mörk MGG God

God God God God God God God

God, mörk MGG God

God God God

God, mörk MGG God

God God

God God

++

+ + ++

+ + + + + - + + + + + - + - + - + + + - ++

+ + ++

++

- +

++

+ ++

++

+ ++

+ + + ++

+ + ++

+ + - ++

+ ++

+ + + + + ++

++

++

++

+ + ++

+ - - - + ++

- - - - + - + + - + + + + + + ++

- - - - - - - - +

++

++

++

+ ++

++

- + ++

++

++

+ ++

++

+ + ++

+ + + + ++

++

- + ++

++

++

++

+ ++

God God Låg God God Låg God God God God Medel God Låg Medel God God God God God God God Medel Medel God God God God God God Låg God

God God Medel God God God God God Låg God God God God God God God God Medel God God God God God God Medel God God God God Medel God

3 Ascites God

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Pleura Pleura Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste Borste Borste Borste Borste Borste Borste Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste

God God God God God God God God God God God God Blek God God God God God God God God God God God God God God God

19

Tabell 4. Jämförelse mellan ThinPrep (TP) och Konventionell Cytologi (KC) med avseende på färgning enligt May-Grünewald-Giemsa (MGG) och Papanicolau (PAP) från bedömare 1.

a Provnummer randomiserat.

b Prov 16–22 jämfördes ej mellan PAP och MGG till följd av att borstar endast färgas enligt PAP Prov^a,b Provtyp Färgning PAP Färgning MGG Allmän kvalité

TP KC TP KC TP KC

1 2

Pleura Ascites

God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God

God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God

Mörk God God God Dålig Mörk Mörk God Mycket God Mörk Mörk Mycket God Mörk God God N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Lite mörk God Mörk Lite mörk Mörk Mörk Mörk God N/A

God God God God God God God God God God God God God God God N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A God God God God God God God God N/A

Inflammatoriska cellhopningar God

PAP bättre än MGG God

Undermålig MGG God

Atypisk

Mycket god t.fa. inget blod Mycket god kvalité

Mörk MGG försvårar diagnos God

Mycket god MGG, avsaknad av inflammation Cellfattigt

God God God God God God God God God Låg cellhalt God, cellfattig MGG lite mörk God

MGG svårbedömd

Inflammatoriska cellhopningar Inflammatoriska cellhopningar Artefakter, slem, ej bedömbar God, något blodig, tydligare ursprung

God God God God

Låg Cellularitet Kraftigt blodig God

God God God God God Cellfattigt God God God God God God God God God Låg cellhalt God, cellfattig God

God God God God

Artefakter, låg kvalité God

3 Ascites 4

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Pleura Pleura Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borst Borst Borst Borst Borst Borst Borst Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste

20

Tabell 5. Jämförelse mellan ThinPrep (TP) och Konventionell Cytologi (KC) med avseende på färgning enligt May-Grünewald-Giemsa (MGG) och Papanicolau (PAP) från bedömare 2.

a Provnummer randomiserat

b Prov 16–22 jämfördes ej mellan PAP och MGG till följd av att borstar endast färgas enligt PAP

Prov^a,b Provtyp Färgning PAP Färgning MGG Allmän kvalité

TP KC TP KC TP KC

1

2 Pleura

Ascites God

God God God Ljus Ljus God God God God God God God God God God God God God God God God God God God Svag God God God

Ej bedömbar God

God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God God

Mörk Mörk Mörk Mörk Mörk Mörk Mycket mörk Mörk Mörk Mörk Mörk Mörk Mörk Mörk Mörk N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Mörk Något mörk Ej bedömbar Mörk Mörk Mörk Mörk Ej bedömbar N/A

God God God God God God God God God God God God God God God N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A God God God God God God God God N/A

Riklig inflammation Svårtolkad MGG

Mycket mörk MGG kärnfärgning Annorlunda utseende på cellgrupper Överfärgad inflammation

Bakgrund Ej bedömbar God, mörk MGG God, mörk MGG God

God, mörk MGG MGG svårbedömd God, mörk MGG God, mörk MGG God, mörk MGG God Rikligt blod och inflam God God

God God God

Riklig Inflammation God

MGG ej bedömbar Inflammation God, mörk MGG

Överfärgad inflammation Inflammation

För lite celler Sparsamt med celler

Riklig inflammation God God

God Extremt blodig Rikligt med blod God

God God God God God God God God

God Rikligt blod och inflam God God

God God God Cellfattigt Fattigt mesotel Blod och inflam God God

God God

Sparsamt med celler God

3 Ascites 4

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Pleura Pleura Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borst Borst Borst Borst Borst Borst Borst Pleura Ascites Pleura Ascites Ascites Pleura Ascites Ascites Borste

21

Figur 1. Celler som preparerats enligt konventionell cytologi (KC) samt ThinPrep (TP) vid 40x förstoring. Preparaten har färgats enligt May-Grünewald-Giemsa (MGG) samt enligt Papanicolau (PAP). KC-MGG visar normal infärgning och tydlig kärnstruktur. TP-MGG visar något mörkare infärgning. KC-PAP visar normal infärgning och hög blodhalt. TP-PAP visar normal infärgning, men höga nivåer av inflammatoriska celler och avsaknad av blod.

MGG

KC TP

PAP