1 Examensarbete 15hp, C-nivå, Vt. 2009
Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet
CLONING AND EXPRESSION OF THE CRIMEAN- CONGO HEMORRHAGIC FEVER
VIRUS GLYCOPROTEINS Mariam Sliwa
Handledare: Ali Mirazimi, Annette Krause Kunskapscentrum för mikrobiologiskt beredskap Smittskyddsinstitutet, Solna
2 ABSTRACT
Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is a worldwide tick-borne disease that originally belongs to the Bunyaviridae family, the genus Nairovirus. In addition to infection from ticks, humans become infected if any contact with infected blood or tissue material occurs. To study the disease, several methods such as real-time Polymerase Chain Reaction, enzyme-linked immunosorbent assay and Immunofluorescence assay are used for detection of the virus.
All viruses in Bunyaviridae consists of three single stranded RNA sequences, the small, the medium and the large segment, that encode for the nucleocapsid protein, the glycoproteins, GN and GC, and the RNA-dependent RNA polymerase, respectively. The main purpose of this study was to express the M RNA segment´s glycoproteins, GN and GC. By using the reverse transcription reaction, the cDNA was synthesized from vRNA and the M RNA sequence was amplified using Phusion DNA-polymerase. In the storage vector, pcDNA3.1/V5-His-TOPO, the insert was ligatured followed by transformation into Escherichia coli. Restriction digestion was made with specific enzymes that cut out the insert. In the second ligation and transformation two different expression vectors (pTM1/pI.18) was used. After observation of the gel analysis from the test-PCR, an insert in the expression vector was shown.
Keyword: Bunyaviridae family, RNA sequences, M RNA segment, Phusion DNA- polymerase, Reverse transcription reaction
3 ABBREVIATIONS
CHF Crimean hemorrhagic fever
CCHF Crimean-Congo hemorrhagic fever CCHFV Crimean-Congo hemorrhagic fever virus DIK Disseminerad intravasal koagulation M ORF M segmentets open reading frame M ORF+ M ORF med ”restriction sites”
ORF Open reading frame
4 INTRODUKTION
Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) är en allvarlig virussjukdom som ursprungligen kommer från en av de största virusfamiljerna, Bunyaviridae och tillhör genuset Nairovirus. Viruset, som orsakar sjukdom hos människan har en dödlighet på upp till 50% och smittan överförs av fästingar (Morikawa et al., 2007). Den tidiga historien bakom virussjukdomen beskrevs redan på 1200-talet i en stat i Centralasien, dagens Tadzjikistan, som gränsar till Afghanistan, Kina, Kirgizistan och Uzbekistan.
Utbrottet beskrevs då i form av en hemorragisk liknande sjukdom med blödningar från bland annat rektum, tandköttet och bukhålan. Utbrottet sägs möjligen ha förorsakats av en koltrast, som lus eller fästing normalt parasiterar (Hoogstraal, 1979 och Ergönül, 2006). Chumakov et al. (1976), beskrev olika varianter av hemorragiska sjukdomar som förekommit i centrala delar av Asien. Hit hör bland annat de akuta infektionssjukdomarna som varit kända i århundrade, författaren menar att de tillsammans kom att bilda en sjukdomsbild som är likt dagens CCHF.
Den första riktiga upptäckten av Crimean hemorragiska feber (CHF) inträffade under 1944-45 då ca 200 soldater från en Sovjetisk militärstyrka infekterades under en epidemisk period i samband med ett krig på halvön Krim i Ukraina (Chumakov, 1963 och Sanchez et al., 2002). Detta gjorde att man kom att använda namnet CHF (Whitehouse, 2004). Intresset för virussjukdomen blev allt större, varför Chumakov och hans kollegor, 1967, började försöka isolera CHF-viruset i nyfödda vita möss.
Efter ytterligare något år, 1969, identifierades CHF-viruset med en annan patogen som förorsakat liknande sjukdomsbild, nu i Kongo under 1956. Av den anledningen kom man att ge sjukdomen och viruset dess nuvarande namn; Crimean-Congo hemorrhagic fever (Hoogstraal, 1979 och Whitehouse, 2004).
Idag vet man att sjukdomen har brett ut sig över stora delar av världen. Drabbade länder man redan känner till är, subsahariska Afrika, Balkanhalvön, norra Grekland, europeiska Ryssland, Pakistan, Xinjiang provinsen i nordvästra Kina, Arabiska halvön, Turkiet, Irak, Iran m.fl. (fig. 1) (Weber et al., 2008). Fästingarten som har ett brett spektrum av värdorganismer och som smittar människor, tillhör genuset Hyalomma, särskild arten Hyalomma marginatum marginatum. Denna art har en
5
känd potentiell vektor inom sin etiologiska agens som bland annat orsakar sjukdomar som CCHF och fästingburen encefalit (Buczek, 2000). Man har även på senare tid funnit att människan kan bli smittad av de andra Hyalomma-arterna. Utöver smitta från fästingar, kan människan bli infekterad av viruset om hon kommit i kontakt med blod eller annat vävnadsmaterial som redan är infekterat (Weber et al., 2008). Därför är det inte konstigt att personer på landsbygden och slakteriarbetare, eller veterinärer och sjukvårdspersonal som på något sätt kommit i kontakt med viruset, kan insjukna (Whitehouse, 2004).
Figur 1. Utbredningen av CCHFV i välden. De rödmarkerade områdena är där man idag har isolerat viruset. Det gulmarkerade är länder som löper risk att drabbas, Smittskyddsinstitutet.
Allvarliga infektionsrisker medför att det krävs utbildad personal som kan arbeta på laboratorier med höga säkerhetsklasser, för att infektionen ska hanteras på rätt sätt. Detta kan således begränsa analyseringen av sjukdomen CCHF, vilket speciellt drabbar länder där det råder brist på utbildad personal. Med säkra och moderna utrusningar samt olika molekylärtekniska metoder, så som realtids-PCR, ELISA, Immunofluorescence Assay (IFA) m.fl. kan man detektera och utreda sjukdomen (Whitehouse, 2004 och Morikawa et al., 2007). Det man hittills känner till om sjukdomen kommer i de flesta fall från blodanalyser samt leverbiopsier från
6
infekterade patienter. Swanepoel et al. (1989), gjorde fler omfattande studier på ett 50-tal CCHF-patienter från södra Afrika, där intresset mestadels låg på patienternas tillstånd. De beskrev olika hemorragiska fall av anemier, uttorkning och chock som bidragande faktorer till att vissa patienter utvecklade multipel organsvikt, som i sin tur lett till mortalitet. I andra studier fann Swanepoel et al. (1989), ett samband mellan minskad produktionen av trombocyter och förhöjda leverprovsnivåerna av ASAT och ALAT i serum, redan i ett tidigt stadium av sjukdomen (Swanepoel et al., 1989 och Weber et al., 2008). På senare tid har man sett en ökning av sjukdomen (fig. 2), speciellt i Turkiet och länderna omkring, där det rapporterades ca500 fall under 2002-2005 (Ergönül, 2006).
Figur 2. Rapporterade fall av CCHFV i olika världsdelarna mellan år 2002 och 2008. Den blåa linjen är antalet insjuknade personer medan den röda linjen visar antalet personer som dött.
1979 beskrev Hoogstraal, i sitt projekt, fynden av CCHF´s fyra sjukdomsfaser (fig. 3); inkubation, prehemorragisk period, hemorragisk fas samt konvalescens period. Den vanligaste inkubationstiden efter ett fästingbett varar 1-3dagar, i vissa fall längre, vilket beror på olika faktorer och i vilket mån man blivit utsatt. Den
7
prehemorragiska perioden karaktäriseras av en plötslig febertopp (39-41oC) som kan vara i 5-12dagar i sträck. Dessutom känner patienten sig frusen, får skarp huvudvärk, känner yrsel, blir ljuskänslig (photophobia) samt får rygg-, muskel- och buksmärtor.
I den här fasen kan även symptom som kräkningar, illamåenden, diarréer, aggressioner och häftiga humörsvängningar uppträda. Det hemorragiska sjukdomsförloppet fortsätter att utvecklas efter 3-6dagar till en allt mer synlig sjukdom. Små till extremt stora röd/purpurfärgade fläckar framträder över stora delar av kroppen. Dessa syns ofta på slemhinnor och hud, speciellt på de övre kroppsdelarna och/eller extremiteter. Symptom uppstår efter att endotelcellerna har skadats, vilket ofta leder till disseminerad intravasal koagulation. Oftast upptäcker man att näs- avförings- samt kräkblödningar har blivit mörkare. Andra vanliga hemorragiska fynd är blödningar från vagina och tandkött samt hjärnblödningar.
Patienter som överlevt de tre första faserna, är på bättringsvägen och kommer då in i konvalescensperioden 15-20dagar efter insjuknandet. Svaghet i kroppen, svag puls samt håravfall är vad som dominerar i detta skede (Hoogstraal, 1979 och Ergönül, 2006). Även huvudvärk, yrsel, illamående, andningssmärtor samt minskad aptit, minne- och hörselproblem kan uppstå, dock är dessa symtom sällan permanenta, men kan vara upp till 1år eller något mer (Whitehouse, 2004).
8
Figur 3. CCHF fyra sjukdomsfaser; inkubation, prehemorragisk period, hemorragisk period samt konvalescens. Leverproverna, ALAT och ASAT, ökar samtidigt som leukocyt- och trombocytproduktionen minskar.
Som tidigare nämnts tillhör CCHF viruset Nairovirusgenuset, Bunyaviridae- familjen. Den principiella fortplantningstegen inom denna familj är lik många andra höljeförsedda virus. Viruspartikeln är sfärisk till form och omkring 100nm i diameter. Den har en värdcell med ett höljeförsett, 5-7nm tjockt, lipidskikt och glykoproteinspetsar som sticker ut 8-10nm (fig. 4). Alla virus inom Bunyaviridae- familjen består av tre enkelsträngade RNA-segment där genomet kodar för tre olika strukturproteiner. Glykoproteiner, GN och GC (kallas även G1 och G2), finns i virusets lipidhölje, nukleokapsidprotein (NP) innehåller virusets arvmassa, och den stora polypeptiden (L) som sammankopplas med virusets RNA-beroende RNA polymeras. Segmenten är uppkallade efter deras storlek; small (S), medium (M) respektive large (L) (Whitehouse, 2004). Förövrigt innehåller alla tre segment en open reading frame flankerat av en icke-kodande region. CCHFV M-segment som kodar polyproteinet klyvs under kotranslationsproccesen till två grundsubstans- molekyler, PreGN och PreGC, och genomgår sedan posttranslation. Glykoprotein- processen för nairovirus, särskild CCHFV, framstår som unik eftersom grund- substansmolekylerna är de som utvecklas först men kräver dock ett ytterligare
9
posttranslationssteg innan de förblir mogna glykoproteiner. Mogna glykoproteiner, GN och Gc, ansvarar för virusattacken till än så länge okända receptorer som är belägna på mottagliga värdceller. CCHF-infektion detekteras antigen genom att mäta immunoglobulin (Ig) G, och IgM antikropparna, eller genom att detektera CCHF arvmassa med PCR (Drosten, 2003).
Fokus för denna studie låg på M-segmentets open reading frame (M ORF). Syftet med projektet var att först klona in M ORF i en förvaringsvektor för att sedan klona det på nytt i en expressionsvektor. Detta för att testa om det är möjligt att uttrycka M- segmentets glykoproteiner, GN och GC. Metoder som främst användes var molekylärbiologiska metoder så som sedvanliga PCR samt RT-reaction.
Anledningen till att man är intresserad av att utrycka glykoproteinerna är för att man inom en snar framtid vill hitta ett vaccin mot denna hemorragiska febersjukdom. Idag finns det ingen säker eller effektiv behandling tillgänglig, förutom antivirala läkemedel som endast bromsar virusets utveckling (Lupi et al., 2003).
Figur 4. Schematisk bild av Bunyaviridae virus. Inuti det höljeförsedda lipidmembranet finns RNA genomets segment S, M och L med nukleokapsid proteiner respektive glykoproteinerna GN och GC
samt RNA-beroende RNA polymeras.
10 MATERIAL OCH METOD
Material
Under studiens gång, användes PCR, T1 Thermocycler, Biometra, vid många olika tillfällen. Primrar (tabell 1) och dess respektive primerpar (tabell 2) användes i olika syften.
Tabell 1. Primrar och dess respektive sekvens, samt tillverkare.
Primer Sekvens Företag
M ORF forward primer #12 5’-ATG CAT ATA TCA TTA ATG TAT GC -3’ Sigma M ORF revers primer #13 5-CTA GCC AAT GTG TGT TTT TGT A-3’ Sigma M ORF+ forward primer #110 5’-GAC AGA GGT ACC AGT CCT TCA ATC
ATG CAT ATA TCA TTA ATG TAT G-3’
Sigma M ORF+ revers primer #111 5’-GAC AGA CTC GAG TGC TCT TCC GGT
CTA GCC AAT GTG TGT TTT TGT AG -3’
Sigma M 2 forward 5’-ATT AAG GAC AGA GAC TGC AGA G-3’ Biotech
M 2 reverse 5’-ACA TCT TTC TGG GCA GTC ACC-3’ Biotech
M 1 reverse, #39 5’-GTG GCC CCT CCC TTC CTG-3’ Sigma
M 3 forward 5’-AAA GGA CAG GAA TCA GCT GGG-3’ Biotech
T7 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' Sigma
BGH Reverse 5'- TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3' Invitrogen
Inner M ORF1 fwd #16 5' AGACCACCAACCCCTCCTG 3' -
Inner M2 fwd #18 5' TCAAACCACCCCAAAACAACCA 3' -
11
Tabell 2. Olika forward och reverse primrar kombineras för att bilda sekvensens primerpar.
Primerpar Primrarna
M ORF1 M ORF forward primer #12 M 1 reverse, #39
ORF1+ M ORF+ forward primer #110 M 1 reverse, #39
M2 M 2 forward
M 2 reverse M ORF3 M 3 forward
M ORF reverse primer #13
Metoder
RNA-förberedelser i säkerhetslaboratorium
Smittskyddsinstitutet i Solna har säkerhetslaboratorium med högsta säkerhetsklass, s.k. biosafety level 4 (BSL-4) eller P4-laboratorium. Detta för att förhindra laboratoriesmitta och/eller spridning av högpatogena bakterier och virus. CCHF virusstammen som användes var av nigerianska typen, arten IbAR10200. Viruset avdödades vid BSL-4 innan arbetet påbörjades. RNA-preparerationen gjordes enligt Andersson et al., 2008. 100µl virus lyserades i 300µl TRIZOL-reagens (Gibco/Life Technologies/Invitrogen, Groningen, Nederländerna). 60µl kloroform tillsattes till de TRIZOL-behandlade proverna, som centrifugerades vid 12000g, 15min i 4oC.
Därefter extraherades RNA med QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) enligt tillverkarens instruktion.
Reverse Transcription reaction
cDNA syntetiserades från det extraherade och renade vRNA med hjälp av ”reverse transcription reaction” (RT-reaktion). 1,5µl random hexamer (sigma) samt 1µl, 10mM dNTP (Invitrogen) tillsattes till ett PCR-rör som innehöll 8µl templat och 2,5µl destillerat vatten. Lösningen värmdes sedan i en PCR-apparat med ett förvalt program på 5min i 65oC och 1min i 4oC. Därefter tillsattes 4µl av 5x First strand buffert (Invitrogen), 1µl av enzymerna Superscript III transcriptas (Invitrogen)
12
respektive RNaseOut (Invitrogen), samt 1µl av 0,1M ditiotreitol (DTT) till den uppvärmda lösningen. Slutligen värmdes extraktet upp igen i PCR-apparaten med 5min i 25oC, 60min i 50oC, 15min i 70oC och till sist fick den stå i 4oC ∞.
PCR med PhusionTM DNA polymeras
M ORF forward primer #12 respektive revers primer #13 samt M ORF+ forward primer #110 respektive revers primer #111 användes (tabell 1). Innan PCR sattes igång bereddes en mastermix. Den innehöll 5µl cDNA-produkt, 1µl av respektive forward och reverse primer, samt 35µl destillerat vatten. Primrarna användes för att DNA-polymeraset skulle kunna föröka cDNA-produkten. Dessutom tillsattes 5µl Phu 10X PCR buffert (Invitrogen), 1,5µl 10mM dNTP och sist 1,5µl av Phu DNA polymeras (Finnzymes). Mastermixen placerades i PCR-apparaten, där det valda programmet startade på 95oC i 2min och fortsatte sedan 35 gånger med PCR- cyklarna 95oC i 1min, 50oC i 30sek och 72oC i 3min. Därpå följde det slutliga steget 72oC i 5min. PCR-produkten visualiserades sedan med 1% agaros i gelelektrofores med tillsatt etidiumbromid med hjälp av UV-ljus (BioRAD GelDoc 2000) varefter lämpliga DNA-bitar skars ut för att användas till gelextraktionen. DNA-fragmenten hade en storlek på ca 5kb, varför QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) användes.
Kvar var endast DNA med det önskade fragmentet.
TA-kloning
TA-kloning innebar att basen adenin (A) tillsattes på både 5’- och 3’-änden, detta för att DNA-fragmentet skulle bilda ”sticky ends” som senare skulle passa ihop med den plasmid som kom att användas. För att kloningen skulle lyckas behövdes det en uppvärmd mastermix som bestod av 1µl Taq-buffert (Invitrogen), 2,5µl destillerat vatten samt 0,5µl 10mM dNTP mix och 1µl Taq-polymeras (Invitrogen). Detta blandades i ett PCR-rör som innehöll 5µl av den gelrenade PCR-produkten. Ett specifikt program valdes på PCR-apparaten med temperaturerna 95oC i 5min, 72oC i 10min, och till sist 4oC i 1min.
13
TOPO-kloning, transformation och odling av pcDNA3.1./V5-His-TOPO
En vektormastermix eller ”ligation reaction” som den också kallas, på totala volymen 10µl användes för TOPO-kloning. Den innehöll 1µl TA-produkt, 1µl saltlösning, 0,5µl av pcDNA3.1/V5-His-TOPO (pcDNA3.1), (5523baspar, Invitrogen) samt resten vatten. Ligeringslösningen stod 20min i rumstemperatur och sen på is. För att transformera Escherichia coli (E.coli)-bakterierna blandades 50µl TOP10 bacteria (Invitrogen) med 5µl av ligeringsprodukten. Bakterieklösningen fick stå 20min på is och chockvärmdes sedan i 42oC i 45sek. Blandningen fick sedan svalna på is en kort stund och därefter tillsattes 250µl S.O.C-medium (Invitrogen) till varje rör.
Agarplattor med ampicillin förvärmdes till 37oC, där 100µl av bakterielösningen slutligen spreds ut med glaspärlor. Plattorna inkuberades i 37oC över natten.
Plasmid-DNA-rening
Dagen därpå valdes ett antal kolonier, 1 koloni/bakteriebuljong, vilka fick växa i 4ml Luria Bertani medium (LB-medium) i ca 16h i 37oC på skak. Bakteriekulturen överfördes sedan till 2ml eppendorfrör och centrifugerades i 3min vid 6000g (8000rpm). Bakteriepelleten sedimenterade och hela supernatanten hälldes ut.
Plasmid-DNA renades ur bakterierna med hjälp av QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), följt av Taq-PCR. För Taq-PCR valdes specifika primerpar som endast band 2kb fragment (M ORF1, M2, M ORF3). Detta gjordes som en kontroll för att se att alla delar av M ORF/M ORF+ fragmenten hade amplifierats. Mastermixen för Taq-PCR hade en slutvolym på 30µl och bestod av 3µl taq-buffert, 0,8µl 10mM dNTP, 1µl av vardera forward respektive revers primer, 1µl minipreparations produkt, 0,2µl Taq-polymeras och resten destillerat vatten. Detta analyserades sedan i 1% agaros i gelelektrofores, 120V i 35-45min. Banden visualiserades med etidiumbromid.
14 Sekvensering
För sekvensering skickades 30µl renat DNA till GATC biotech (Tyskland) som utförde sekvenseringen med Sangers metod. Sekvenseringen utfördes med primrarna:
#16, #18, #39, M2fwd, M2rev, M3fwd, T7 och BGHrev.
Restriktionsklyvning
För att klyva ut ”insertet” (M ORF/M ORF+) från förvaringsvektorn pcDNA3.1 användes restriktionsenzymerna KnpI och XhoI (FastDigest®, Fermentas).
Dessutom användes enzymet SalI (FastDigest®, Fermentas), som endast klöv i vektorn, detta för att inte blanda ihop bitarna av pcDNA3.1-vektorn med insertet vid visualiseringen på gel. Plasmiderna pI.18 (4281baspar, Invitrogen) och pTM1 (5357baspar, F. Weber, University of Freiburg) öppnades med samma enzymer som användes för att klyva ut insertet. Detta gjordes eftersom man ville ha samma ”sticky ends” på expressionsvektorerna som på insertet, för att senare sammanfoga dem. En mastermix med 2µl 10X FastDigest buffert (Fermentas), 1µl av respektive enzym, 10µl minipreparationsprodukt eller 6µl av respektive plasmid och resten vatten till en volym på 20µl förberedes i ett PCR-rör. Rören inkuberades i 37oC i 5min och placerades sedan på ett värmeblock i 80oC i ytterligare 5min för att inaktivera enzymerna.
Ligering i expressionsvektorerna pI.18 och pTM1
Efter att ha kluvit isär insertet från förvaringsvektorn (pcDNA3.1) var tanken att hopfoga insertet med plasmiderna, pI.18 och pTM1, som används till att uttrycka protein. En mastermix för ligeringen tillreddes och bestod av 2,5µl, 10ng pI.18 vektor eller 2,3µl, 10ng pTM1, 10µl av insertet, 2µl, 10x ligation buffert (Fermentas), 0,4µl av T4 DNA-ligase (Fermentas) och resten vatten, till den totala volymen 20µl. Detta fick i sin tur stå 60min i rumstemperatur innan transformationen fullgjordes, samma procedur som tidigare nämnts. Efter odling på agarplattor plockades kolonier som sedan fick växa i LB-medium. DNA-plasmidrening utfördes
15
på nytt med minipreparationskitet. Produktens koncentration mättes med NanoDrop® (ND-1000) och testklövs med samma enzymer som tidigare, XhoI, KpnI samt SalI. Mastermixen för testklyvningen, ”Test Digest”, innehöll 1µl av respektive enzym, 2µl av minipreparationsprodukten, 2µl av FastDigest-bufferten, samt 13µl destillerat vatten för den totala volymen 20µl. Detta fick stå 3h i 37oC och därefter, 10min i 80oC för att inaktivera enzymerna. Slutligen analyserades testklyvningen på 1% agarosgel i gelelektrofores, 120V i 35-40min.
RESULTAT
RT-reaktion och cDNA-amplifiering med PhusionTM PCR
Två cDNA-prover syntetiserades från renat vRNA med RT-reaktion följt av amplifiering med Phusion DNA-polymeraset och de specifika primrarna för M- segmentet. Totalt fyra prov, M ORF cDNAI, MORF cDNAII, M ORF+ cDNAI samt M ORF+ cDNAII. De prov som kallades för M ORF+ hade ett antal extra nukleotider på M-sekvensen, så kallade ”restriction sites”. Resultatet visualiserades med gelelektrofores och UV-ljus och linjära band sågs vid 5000baspar (bp) för respektive M ORF/M ORF+ proven (fig. 5a), precis som väntat. Dessvärre gav M ORF-proven ganska svaga band, vilket tydde på att koncentrationen inte var tillräcklig hög för att kunna dessa prover skulle kunna användas. Av den anledningen skars endast M ORF+ banden ut och renades med gelextraktion. De gelrenade cDNA-fragmenten observerades på nytt med gelelektrofores och UV-ljus, där man då såg att produkten fortfarande hade den förväntade storleken på ca 5000bp (fig.
5b).
16
a b
Figur 5a) Phusion PCR för cDNA-amplifiering. Primrarna som användes var specifika för M ORF- fragmentet. Tydliga band vid 5000baspar för alla prov, dock svagare för M ORF-banden. b) Testanalys på gelrenad DNA-produkt. Efter gelreningen fick vi band för M ORF+ vid 5kb, precis som väntad.
TOPO-kloning och transformation
För TOPO-kloning behövdes förvaringsvektorn pcDNA3.1/V5-His-TOPO samt insertet. Ligeringslösningen spreds ut på två agarplattor och fick stå i 37oC över natten. Dagen därpå observerades plattorna. Få kolonier hade växt, dock plockades fyra olika kolonier från plattan som innehöll M ORF+ cDNAI, samt tre kolonier från M ORF+ cDNAII-plattan. Kolonierna odlades i falkonrör som innehöll LB-medium och inkuberades över natten.
Transformationen och ligeringen lyckades, vilket innebar att vektorn och insertet var hopfogade samt hade en storlek på ca 10,5kb. Detta syntes då gelelektrofores utfördes direkt på minipreparationsprodukten (fig. 6a). Jag utförde även en Taq-PCR, med primerparen M ORF1 och M ORF3, på minipreparationsprodukten för att screena M ORF+. Sekvensen som låg runt 5kb, delades upp i mindre bitar, till ca 2kb stora band, vilket fungerade väl för alla sju M ORF+ proven. I figur 6b syns tydliga band för alla fyra M ORF+-proven, med båda primerparen. Resultaten på M ORF+
cDNAII-proven var inte lika bra. Primerparet M ORF1 amplifierade alla tre M ORF+-fragmenten. Primerparet M ORF3 klarade bara av att amplifiera två av fragmenten, M ORF+ cDNAII 1 och 3.
17
a b
Figur 6a) Gelanalys på minipreparationsprodukt efter ligering och transformation av insertet, M ORF+, och förvaringsvektorn pcDNA3.1/V5-His-TOPO. Två prov av vardera analyserades. b) PCR- screen på minipreparationsprodukt med 2kb primerpar. Pilen visar att det inte finns något band för M ORF+ cDNAII prov nr 2, med primerparen M ORF3.
Sekvensering
Den första sekvenseringen utfördes med primrarna T7 och BGHrev. Alla fyra M ORF+ cDNAI-proven skickades, men endast två av M ORF+ cDNAII-proven, prov 1 samt 3. Resultatet för sekvenseringen, blev enligt tabell 3 nedan. Endast M ORF+
cDNAI 4 hade mutation, vilket var bra. Utifrån detta resultat skickade jag proverna M ORF+ cDNAI 1, 2 och 3 samt M ORF+ cDNAII 1 och 3 för en andra sekvensering, denna gång med primrarna: BGHrev, #16, #39, M2fwd, #18, M2rev, M3fwd och T7. Fler primrar vid sekvensering innebar säkrare resultat. Efter det andra sekvenseringsresultatet, (tabell 4) gick jag vidare med proverna M ORF+
cDNAI 1 och 2, samt M ORF+ cDNAII 1 och 3.
18
Tabell 3. Första sekvenseringen med primrarna T7 och BGHrev.
Sekvens Mutation Resultat
M ORF+ cDNAI #1 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
M ORF+ cDNAI #2 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
M ORF+ cDNAI #3 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
M ORF+ cDNAI #4 Ja, på nukleotid 10 samt 4878
Sekvensen kan ej användas p.g.a. mutation.
Deletion av A samt tyst mutation, G utbytt mot A.
M ORF+ cDNAII #1 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
M ORF+ cDNAII #3 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
Tabell 4. Resultatet från den andra sekvenseringen med primrarna BGHrev, #16, #39, M2fwd, #18, M2rev, M3fwd och T7.
Sekvens Mutation Resultat
M ORF+ cDNAI #1 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
M ORF+ cDNAI #2 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
M ORF+ cDNAI #3 Ja, på nukleotiden 3599 Sekvensen kan ej användas pga. mutation.
M ORF+ cDNAII #1 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
M ORF+ cDNAII #3 Nej Sekvensen såg bra ut, kan användas!
Restriktionsklyvning
Enzymerna KnpI och XhoI klöv precis innan 5’-änden respektive efter 3’-änden på M-segmentets open reading frame. Varje enzym klöv en gång, KpnI på positionen 913 och XhoI i positionen 933. Enzymet SalI klöv på tre olika platser, positionerna 33, 3334 och 5522, i själva förvaringsvektorn. Enzymet användes för att få mindre bitar vid gelobservationen, vilket därmed gjorde det lättare att urskilja insertet från vektorn. Resultatet för restriktionsklyvningen blev mycket bra, då skillnaden mellan M ORF+-fragmenten och plasmiden var stor (fig. 7a). De fyra M ORF+-fragmenten, ca5kb, som jag gick vidare med skars ut, gelextraherades och testanalyserades på gel.
19
Första testanalysen gav dåliga resultat med svaga, nästan inga band alls på gelen (fig.
7b). Restriktionsklyvningen gjordes om på nytt men denna gång med högre koncentrationer för respektive prov av M ORF+. Den andra testanalysen, (fig. 7c), gav band vid 5kb, dock var två av fyra svaga och av den anledningen användes endast M ORF+ cDNAI #1 samt #2 till resten av försöken. Resultatet för restriktionsklyvningen av plasmiderna var bra, man såg att plasmiderna hade rätt storlek samt var kluvna precis som de skulle (fig. 7d).
Figur 7a) Gel för restriktionsklyvning med M ORF+ cDNAI respektive cDNAII. b) Testanalys på gelrenade M ORF+. c) Testanalys med högre koncentration av M ORF+ proven. d) Restriktionsklyvning med kluvna plasmider.
20
Ligering i expressionsvektorerna pI.18 och pTM1
Jag fortsatte med ligeringen och transformationen på insertet M ORF+ 1 samt 2 i expressionsvektorerna pI.18 och pTM1. Efter att ha odlat dem på agarplattor, kunde kolonier plockas. Platta 1 hade få kolonier, men fem olika kunde hittas. Platta 2 hade lite fler kolonier, även därifrån plockades det fem kolonier. Bakteriekolonierna växte i LB-medium och renades sedan med minipreparationskitet samt koncentrationsbestämdes med NanoDrop®, (tabell 5). Testklyvningen visade dåliga resultat, inga förväntade band, endast ett band för varje prov vid 5kb. Proven borde innehålla klyvda insert och vektorer, vilka borde synas tydligare, med flera band på gelen. Eftersom proven klövs med flera enzymer, borde det även finnas mindre band än 5kb. Detta kontrollerades genom att en test-PCR utfördes på minipreparationsprodukten, med primerparet M2, som band till mittenfragmentet på M ORF-sekvensen samt med M ORF3 som band på den sista delen av sekvensen.
Även en positiv och negativ kontroll togs med i form av pcDNA3.1 respektive H2O.
Gelen (fig. 8) visade att vattenkontrollen var negativ och den positiva kontrollen var positiv. Sämre var det med proverna, där det endast kom upp små fragment med ej förväntade storlekar på gelen för alla prov. Ideala band borde ha en storlek på2kb.
Test-PCR utfördes således på nytt och resultaten visade sig vara bättre (fig. 9a), i alla fall för tre av de tio proverna. Rätt bandstorlek påvisades på M ORF+ #2, prov 2, 3 och 5. Positiva kontrollen var positiv, dock var vattenkontrollen inte helt ren. Det bortsåg jag ifrån eftersom det var starka och tydliga band på de prov där band uppkom. Jag gick därför endast vidare med dessa tre prov, som verkade ha ett insert, och utförde ytterligare en test-PCR, denna gång med primerpar som band till M ORF-sekvensens första del, (M ORF 1 och M ORF 1+). Resultatet såg lovande ut (fig. 9b), då det fanns rätt bandstorlek för respektive prov. Prov 5 på M ORF1 var dock lite svagare än de andra. Vattenkontrollen för M ORF1 var inte rent, vilket den var med det andra primerparet. De positiva kontrollerna var positiva.
21
Tabell 5. Koncentrationsbestämning med NanoDrop® på minipreparationsprodukt med M ORF+
cDNAI #1 respektive #2, med fem olika prov vardera.
M ORF+
cDNAI #1
Koncentration (ng/µl)
M ORF+
cDNAI #2
Koncentration (ng/µl)
1 125,0 1 113,5
2 149,7 2 115,3
3 127,6 3 130,6
4 109,6 4 127,9
5 90,8 5 82,4
Figur 8. Test-PCR, utfördes med primerparet M2 samt M ORF3, på minipreparationsprodukten. Även positiva samt negativa kontroller togs med. Alla prov verkar ha någon sorts kontamination, eftersom det inte syns rätt bandstorlek på gelen.
Figur 9a) Test-PCR med primerparet M2 på minipreparationsprodukten M ORF+ #1 samt M ORF+
#2, med fem prov vardera. Endast tre prov uppvisar band med rätt storlek, 2kb, M ORF #2, prov 2, 3 samt 5. b) Test-PCR med taq-polymeras och primerparen M ORF1 samt M ORF1+. Alla prov påvisar band med rätt storlek, ca 2kb. Positiva kontroller är positiva. I en av dem negativa kontrollerna finns det kontamination.
22 DISKUSSION
RNA-förberedelser utfördes alltid i BLS-4 laboratorium av delegerade personer. Det isolerade vRNA som jag använde förberedes på samma sätt som Andersson et al., (2008) beskrev proceduren för ”RNA preparation”. I deras studie användes samma CCHFV-art (IbAR10200, nigerianska typen) som användes i detta arbete. Studierna skiljer sig dock åt, varför endast RNA-förberedelserna efterliknades.
cDNA-amplifieringen för M segmentet med Phusion DNA-polymeraset och de specifika primrarna var det inte något problem med. Phusion DNA-polymeraset valdes eftersom den klarar av stora sekvenser samt ökar specificiteten för PCR- amplifieringen. En annan fördel är att den har korrektursläsning, vilket andra polymeras kan sakna. Nackdelen med Phu-PCR körningen med 5kb, är att den tar ca 3.5h.
Transformationen av E.coli bakterier (TOP10 bacteria) med DNA-plasmid var inte svår att utföra, dock syntes inte resultatet förrän kolonitillväxten var fullbordad. I mitt fall var det få kolonier, vilket antingen kan ha berott på att inte många bakterier tagit upp vektorerna, eller att plasmiderna inte tagit upp själva insertet vid ligeringen.
Rören som innehöll bakterielösningen fick stå på is ett tag för att sedan snabbt förflyttas till ett värmeblock, 42oC i 45sek och åter på is. Den plötsliga förändringen i temperaturen, ”heat shock”, gör att bakterieporer öppnar sig och vektorn kommer in.
När rören sedan får svalna på is, återsluter sig porerna och vektorn är inlåst i bakterien. För att få reda på om transformationen har lyckats, odlar man bakterierna på agarplattor. Växer det kolonier på plattan, efter ca16h i 37oC, som är den gynnsamma tiden och temperaturen för bakterierna, så innebär det att bakterierna har tagit upp vektorn. Plattorna innehåller ampicillin för att inga oönskade bakterier ska växa. Plasmiderna har en ampicillinresistent gen, vilket gör att de kan växa ifall bakterien tagit upp dem. E.coli-bakterierna som inte tagit upp plasmiden växer därför inte. Det förekommer många bra metoder för transformation av plasmid-DNA till E.coli-bakterier. I artikeln “Studies on Transformation of Escherichia coli with Plasmids” av Hanahan Douglas, 1983, beskrivs olika metoder för transformationen
23
av E.coli med plasmider. Författaren nämner även att den första DNA- transformationen som gjordes i E.coli presenterades redan 1970 av Mandel and Higa.
Ligeringsdelen var inte den enklaste, mycket kunde gå fel och det är sällan man exakt vet vad som inte fungerade. Slutsatsen som drogs utifrån testklyvningen, var att det endast fanns en tom vektor. Detta kan exempelvis bero på en ”incomplete digestion”, dvs. icke fullständigt klyvning, som i sin tur kan bero på många faktorer.
Det kan vara så att endast det ena enzymet klöv och därför kan plasmiden ha sammanfogats med sig själv, återligerat. En annan förklaring kan vara, att enzymerna klöv, och det bildades många små och/eller stora fragment av insertet som sedan hamnat inne i bakterien, men plasmiden tog inte upp det. Det är även inte helt omöjligt att MORF, insertet, agerar toxiskt, vilket då leder till att bakterierna dör.
Slutsatsen som drogs var att det endast fanns en tom vektor, och därför syntes det inget på gelen. Ett annat exempel kan vara att det blev en fullständig klyvning, men med många små fragment, ≤50bp, samt få stora, ≥5kb, vilket då gör att insertet inte passar in. Även om molarförhållandet, som bör ligga på 1:3 (en del vektor, tre delar insert), inte stämmer riktigt, kan det öka svårigheterna för insertet att hamna i vektorn.
Endast ovanbeskriva metoder fick plats inom tidsramen för examensarbetet. Jag är dock nöjd med det jag åstadkommit på så kort tid. Om tiden fanns var nästa steg att transfektera eukaryota celler med de tre proven av M ORF+ cDNAI som visade sig innehålla ett insert i vektorn. Att transfektera celler innebär att man smittar cellerna med främmande DNA. Studien fortsätter emellertid där jag avslutade mitt projekt.
Önskemålet är att lyckas uttrycka M-segmentets glykoproteiner genom att transfektera cellerna med hjälp av lipofectamin och analysera uttryckta proteiner med fluorescencemikroskop. Än så länge verkar metoderna som använts ha fungerat bra.
Vissa moment fick göras om flera gånger, vilket jag ser som en erfarenhet. Fortsätter projektet i samma banor, besvaras frågeställningen; att det är möjligt att uttrycka M segmentets glykoproteiner!
Hittills är information rörande CCHFV M-segment begränsad. I denna studie hade CCHF-virusets M segment 5103 nukleotider. Olika arter av CCHFV har olika stora segment. Bland de stammar som identifierats fullständigt, är genomet hos den ryska
24
arten, ROS/HUVLV-100, mest lik IbAR10200 (Meissner et al., 2006). Jämför man Nairogenuset med andra virusgenus tillhörande Bunyaviridaefamiljen så har det inte gjorts många studier för exempelvis CCHFV. Sanchez et al., (2002), resonerar i sin artikel att förutsättningarna för att arbete med CCHFV måste ske i BSL-4 laboratorier ökar svårigheterna att jobba med det, vilket därmed kan vara orsaken till att endast få studier har gjorts. De nämner även att Ibar10200 stammens M segment är den mest skilda av CCHF virusstammarnas sekvenser. Vidare diskuterar Papa et al., (2005) i sin studie att CCHFV-stammarna från olika världsdelar har olika genetiska skillnader inom en viss gren i den fullständiga M segmentets evolutionsträd. Trots att det finns många genetiska skillnader mellan CCHF- stammar, har de fortfarande en hel del gemensamma funktioner, t.ex proteolytisk klyvning. Fler omfattande studier behövs, innan man kan klarlägga exakta detaljer om de kodande proteinerna samt deras roll som patogen.
ACKNOWLEDGEMENT
Jag vill börja med att tacka Ali Mirazimi för att ha gett mig möjligheten att skriva mitt examensarbete på Smittskyddsinstitutet. Sedan vill jag rikta mitt tack till min praktiska handledare, Annette Kraus, som tagit sig tid att lära mig alla metoder inom denna studie.
REFERENSER
Andersson, I. Karlberg, H. Mousavi-Jazi, M. et al., (2008) Crimean-Congo hemorrhagic fever virus delays activation of the innate immune response. J Med Virol. 80, 1397–1404.
Buczek, A. (2000) Experimental teratogeny in the tick Hyalomma marginatum marginatum (Acari: Ixodida: Ixodidae): effect of high humidity on embryonic. J Med Entomol. 37(6): 807-814.
25
Chumakov, MP. (1963) Study of viral heamorrhagic fevers. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol. 7,125-140.
Chumakov, MP. Smirnova, SE. Shalunova, NY. et al., (1976) Proofs of etiological identity to Crimean hemorrhagic fever in Central Asian hemorrhagic fever. In: IX International Congress on Tropical Medicine and Malaria, Athens. 1, 33-34.
Drosten, C. Kümmerer, BM. Schmitz, H. and Günther, S. (2003) Molecular diagnostics of viral hemorrhagic fevers. Antiviral Res. 57, 61–87.
Douglas, H. (1983) Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 166, 557-580.
Ergönül, Ö. (2006) Crimean-Congo haemorrhagic fever. Lancet Infect Dis. 6, 203–
14.
Hoogstraal, H. (1979) The epidemiology of tick-borne Crimean-Congo hemorrhagic fever in Asia, Europe, and Africa. J Med Entomol. 15, (4), 307-417.
Lupi, O. and Tyring, SK. (2003) Tropical dermatology: Viral tropical diseases. J Am Acad Dermatol. 49, (6):979-1000.
Morikawa, S, Saijo, M. and Kurane, I. (2007) Recent progress in molecular biology of Crimean-Congo hemorrhagic fever. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 30, 375–389.
Papa, A. Papadimitriou, E. Bozovic. B. et al., (2005) Genetic characterization of
the M RNA segment of a Balkan Crimean-Congo hemorrhagic fever virus strain.
J Med Virol. 75, 466–469.
Sanchez, AJ. Vincent, MJ. And Nichol, ST. (2002) Characterization of the glycoproteins of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. J Virol. 76(14), 7263–
7275.
Swanepoel, R. Gill, DE. Shepherd, AJ. et al., (1989) The clinical pathology of Crimean-Congo hemorrhagic fever. Rev Infect Dis. 11(4), 794-800
Weber, F. and Mirazimi, A. (2008) Interferon and cytokine responses to Crimean- Congo hemorrhagic fever virus; an emerging and neglected viral zonoosis.
Cytokine Growth Factor Rev. 19, 395–404.
26
Whitehouse, CA. (2004) Crimean-Congo haemorrhagic fever. Antiviral Res. 64, (3):145-60.
