Figur 18 och 30 visar också att det möjligen finns en anaerob induktion av både
bakgrundsplasmiden och 172 bp fragmentet. Det fenomen är lite svårt att förklara direkt. En orsak kan vara att cellernas form ändras under anaeroba förhållanden som påverkar OD mätningen. Den mäter ljusspridningen som medförs när ljuset träffar cellernas yta och ger mått på celltätheten i ett prov. Därför spelar cellformen roll under denna mätning. Induktionen tror jag beror på att formen ändrat sig sådant att en lägre celltäthet mäts upp än vad som egentligen fanns i proven.
galaktsidas mätningen ger därför ett intryck av en induktion som istället beror på en större celltäthet som medför att en större mängd substrat bildas beroende på att det nu finns fler celler och inte att uttryck har ökat i varje cell. Figur 30 visar till skillnad ifrån figur 18 att det finns en skillnad i uttryck mellan bakgrundsplasmiderna och 172 bp fragmentet. Det beror troligtvis på att resultatet endast baseras på tre och fyra mätningar medans resultaten i figur 18 baseras på ett 20:tal
mätningar. Antalet mätningar kan nog också förklara varför induktionen för 189 bp fragmentet i RM 101 bestämdes till 2.8 ggr som är lite mindre än 3.3 i XL1-BLUE. Det kan också bero på två olika celler och FNR-protein.
Slutsats
Resultaten visar tydligt att 189 bp fragmentet stödjer uttryck på basal och inducerad nivå under aeroba respektive anaeroba förhållanden. 172 bp fragmentet ger inte upphov till något uttryck vilket leder till slutsatsen att den sekvens som avlägsnats i 172 bp fragmentet troligen är ett -10 elementet och att en komplett promotor region finns i 189 bp fragmentet. Detta motbevisar hypotesen om att en ytterligare promotor uppströms den FNR-beroende promotorn skulle stå för ett basaluttryck och att den FNR-beroende endast skulle aktiveras för att anordna en uppreglering utav uttrycket. Att FNR uppreglerar uttrycket kan konstateras då ingen uppreglering observeras i den FNR-negativa stammen RM 101 men gör det i XL1-BLUE som har FNR. Möjligheten till en anaerob uppreglering inom 189 bp fragmentet i närvaro utav FNR hävdar att promotorn är FNR-beroende och är en klass II promotor. Den möjliga FNR-genen i I. dechloratans har visat sig koda för ett protein som kan inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Proteinet har också förmågan att ersätta E.coli's FNR proteins i roll under NaNO3 respiration vilket konstaterar att proteinet troligtvis är ett funktionellt FNR.
Tackord
Tack till Maria Rova som har varit en utmärkt handledare med väglett mig genom det här arbetet. Thomas Nilsson tackar jag för upplägget av kursen Bioteknik: Praktisk nukleinsyra och
proteinbiokemi som passade mig väldigt bra. Jag lärde mig väldigt mycket som jag fick användning för i det här arbetet.
Tack Miriam Hellberg för alla tips och för allt materiel som jag fick innan du slutade, det hjälpte mig mycket på vägen.
Referenser
1.
Nilsson T, Rova M, Smedja Bäcklund A. Microbial metabolism of oxochlorates: a bioenergetic perspective. BBA-Bioenergetics 2013; 1827: 189–972.
M. Zimmermann and P.R. Trumbo. IodineAmerican Society for Nutrition. Adv. Nutr 2013; 4: 262–64,
3.
Impact of Chlorine Dioxide on Transmission, Treatment, and Distribution System Performance. Zamir Alam, Ron Hofmann, Lisa Lachuta, Ray Cantwell. American Water Works Association, 2005. sid 105.4.
Hellberg Lindqvist M, Johansson N, Nilsson T, et al. Expression of chlorite dismutase and chlorate reductase in the presence of oxygen and/or chlorate as the terminal electron acceptor in I. dechloratans. Appl Environ Microb 2012; 78: 4380–55.
Samuel P. Kounaves, Shannon T. Stroble, Rachel M. Anderson, et al. Discovery of Natural Perchlorate in the Antarctic Dry Valleys and Its Global Implications environmental science & technology 2010; 44: 2360–646.
Myers KS, Yan H, Ong IM, Chung D, et al. Genome-scale Analysis ofEscherichia coli FNR Reveals Complex Features of Transcription Factor Binding.
PLoS Genet 2013; 9
7.
Panyukov VV, Ozoline ON Promoters of Escherichia coli versus Promoter Islands: Function and Structure Comparison. PLoS ONE 2013; 88.
Mendoza-Vargas A, Olvera L, Olvera M, Grande R, Vega-Alvarado L, et al. Genome-Wide Identification of Transcription Start Sites, Promoters and Transcription Factor Binding Sites in E. coli. PLoS ONE 2009; 49.
Jennie E. Mitchell, Dongling Zheng, Stephen J. W. Busby and Stephen D. Minchin Identifcation and analysis of `extended -10' promoters in Escherichia coliNucleic Acids Research, 2003; 31, 4689-95
10.
John D. Coates and Laurie A. Achenbach Microbial perchlorate reduction:Rocket-fuelled metabolism. Nature Reviews Microbiology2004; 2: 569-80
11.
Miriam Hellberg Lindqvist, Thomas Nilsson, Pontus Sundin and Maria RovaChlorate reductase is cotranscribed with cytochrome c and other downstream genes in the gene cluster for chlorate respiration of I. dechloratans.
FEMS Microbiology Letters 2015; 362
12.
Vladimir Mekler, Konstantin Severinov, RNA polymerase molecular beacon as tool for studies of RNA polymerase–promoter interactionsMethods 2015; 86: 19–26
13.
Virgil A. Rhodius1, Vivek K. Mutalik and Carol A. Gross. Predicting the strength of UP-elements and full-length E. coli sE promoters. Nucleic Acids Research, 2012; 40: 2907–2414.
Helen J. Wing, Jeff Green, John R. Guest, and Stephen J. W. Busby. Role ofActivating Region 1 of Escherichia coli FNR-protein in Transcription Activation at Class II Promoters.
The Journal Of Biological Chemistry 2000; 275: 29061–65
15.
Miriam Hellberg Lindqvist. 2016. Oxygen-dependent regulation of key components in microbial chlorate respiration, Doctorial thesis. Karlstad University studies, Karlstad, Sweden.17.
Alex O. Schwarz, Homero Urrutia, Jose´ Miguel Vidal, Norma Pe´rez, Chlorate reduction capacity and characterisation of chlorate reducing bacteria communities in sediments of the rio Cruces wetland in southern Chile, water research 2012; 46: 3283 – 9218.
Hongzhi He & Haishuo Gao & Guikui Chen & Huashou Li & Hai Lin & ZhenzhenShu, Effects of perchlorate on growth of four wetland plants and its accumulation in
plant tissues, Environ Sci Pollut Res 2013; 20: 7301–08,
19.
Pawel Jajesniak and Tuck Seng Wong, From genetic circuits to industrial-scalebiomanufacturing: bacterial promoters as a cornerstone of biotechnology.
Bioengineering 2015; 2: 277-96
20.
Danielsson Thorell H. 2004. Enzymes and Genes for Microbial Metabolism of Oxochlorates. Ph.D. thesis. Karlstad University, Karlstad, Sweden.21.
Helena Danielsson Thorell, Jan Karlsson, Erik Portelius, Thomas Nilsson.Cloning, characterisation, and expression of a novel gene encoding chlorite dismutase fromIdeonella. dechloratans. Biochimica et Biophysica Acta 2002; 1577: 445– 51.
22.
Miller JH: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.23.
G. Unden, S. Achebach, G. Holighaus, H.-Q. Tran, B. Wackwitz and Y. Zeuner. Control of FNR Function of Escherichia coli by O2 and Reducing Conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002; 4: 263–68.24.
Next Generation Sequencing-based Parallel Analysis of Melting Kinetics of 4096 Variants of a Bacterial Promoter. Ewa Heyduk and Tomasz Heyduk.Biochemistry. 2014; 53: 282–92.
25.
Meysman P, Collado-Vides J, Morett E, Viola R, Engelen K, et al. Structural Properties of Prokaryotic Promoter Regions Correlate with Functional26.
www.softberry.com 2016-02-05 kl 123327.
www.fruitfly.org 2016-02-05 kl 123428.
www.cbs.dtu.dk 2016-02-05 kl 123529.
www.biophp.org 2016-02-09 kl 115630.
www.idtdna.com 2016-02-10 kl 130031.
Luitpold Fried, Jürgen Lassak 1, Kirsten J. A comprehensive toolbox for the rapid construction of lacZ fusion reporters. Journal of Microbiological Methods 2012; 91: 537–4332.
Fiona A. Marshall, Sarah L. Messenger, Neil R. Wyborn, et al.A novel promoter architecture for microaerobic activation by the anaerobic transcription factor FNR. Molecular Microbiology 2001; 39: 747-53
Appendix
Tabell AI: Visar b-Galaktosidas aktiviteten utryckt i Miller units under aeroba förhållanden för E.coli XL1-BLUE och RM 101 tillsammans med reaktionsparametrarna för: andel volym celler, reaktionstid, ursprunglig celldensitet, absorbansvärden vid 420 nm, absorbansvärden som korrektionsfaktor vid 550 nm.
Cell prov Plasmid Volym [ml] Tid [min] OD A420 A550 pBBR1-MCS4-LacZ - 0,5 15 0,73 0,81 0,403 19,1 - 0,5 15 0,73 1,256 0,398 102,2 - 0,5 15 0,73 1,061 0,372 74,9 - 0,5 15 0,69 1,172 0,41 87,8 - 0,5 15 0,69 1,13 0,411 79,4 - 0,5 15 0,69 1,105 0,42 71,5 - 0,5 15 0,58 0,99 0,354 85,2 - 0,5 15 0,58 1,1 0,377 101,2 - 0,5 15 0,58 0,915 0,325 79,6 - 0,5 5,5 0,67 0,989 0,449 110,3 - 0,5 5,5 0,67 0,957 0,453 89,1 - 0,5 5,5 0,67 0,924 0,425 97,8 - 0,5 7,23 0,56 0,831 0,33 125,2 - 0,5 7,258 0,56 0,971 0,356 171,2 - 0,5 7,341 0,56 0,878 0,348 130,9 - 0,5 6 0,72 0,893 0,35 129,9 - 0,5 6 0,72 0,921 0,359 135,5 - 0,5 6 0,72 0,901 0,341 140,9 - 0,5 5 0,82 1,338 0,634 111,5 - 0,5 5 0,82 1,291 0,637 86,0 - 0,5 5 0,82 1,152 0,527 112,1 - 0,5 5 0,72 1,013 0,467 108,8 - 0,5 5 0,72 1,143 0,554 96,4 - 0,5 5 0,72 1,01 0,462 111,9 - 0,5 7 0,53 0,681 0,337 49,2 - 0,5 7 0,53 0,639 0,332 31,3 - 0,5 7 0,53 0,639 0,34 23,7 - 0,5 7 0,58 0,75 0,385 37,6 - 0,5 7 0,58 0,717 0,443 -28,7 - 0,5 7 0,58 0,624 0,378 -18,5 - 0,5 15 0,64 0,753 0,401 10,7 - 0,5 15 0,64 0,84 0,451 10,6 - 0,5 15 0,64 0,72 0,384 10,0 - 0,5 10 0,62 0,791 0,423 16,4 - 0,5 10 0,62 0,735 0,393 15,2 - 0,5 10 0,62 0,765 0,418 10,8 - 0,5 10 0,71 0,832 0,434 20,4 - 0,5 10 0,71 0,843 0,449 16,1 - 0,5 10 0,71 0,867 0,46 17,5 - 0,5 5 0,66 0,889 0,462 48,8 - 0,5 5 0,66 1,086 0,585 37,7 - 0,5 5 0,66 0,971 0,531 25,3 - 0,5 5 0,46 0,438 0,22 46,1 - 0,5 5 0,46 0,519 0,259 57,2 - 0,5 5 0,46 0,5 0,25 54,3 - 0,5 5 0,67 0,818 0,446 22,4