5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGT
TGAGAAGTCAATTTCCACTGGAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAG
TTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCA
AACACA
TAAAAAAGGAGAAA
T
G
C
GAAGAT
TCGTGCA '3
Sekvenseringsresultat 189 bp fragment
TAGAACTAGTGGATCCCCCGGG
TAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCGAGGTCGGCGTCAAGTG
TCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGTTGAGAAGTCAATTTCCACTG
GAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACT
TAAATCA
AACACA
TAAAAAAGGAGAAA
TG
C
GAAGAT
TCGTGCAGT
CGACCTCGAGGGGGGGCCCAGGAGGACGTCCATGCTCGAGGGGGGGCCCAGGAGGACGTCCATG
Figur 24. Visar jämförelsen mellan den möjliga promotor sekvensen uppströms cld och 189 bp framgentet som ligerats in i plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ. Sekvens med grå bakgrund är bindningsekvens för uppströms primer och nedströms primer_189. I fet stil markeras den möjliga promotor regionen uppströms cld. Den resterande omodifierade sekvensen t.o.m 5'-änden tillhör ISIde1 elementet. Vit sekvens med svart ytterlinje är restriktionssekvenser och kursiverad sekvens med sträck över sig är plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ. Insertionsmutationerna är markerade som vit sekvens inom svart bakgrund. Extended -10 element och -35 element är markerade med större teckenstorlek. FNR-boxen är understruken.
Transformering III
Den tredje transformeringen var en kotransformering som gjordes av redan transformerade RM 101 celler. Cellerna kom från två olika kulturer. Den ena kulturen var sedan tidigare transformerad med plasmiden pBR322 och den andra med pBR322_IdFNR. Där IdFNR betonar att plasmiden innehöll ett insert som kodar för en gen i I. dechloratans som möjligen tillhör en FNR familj. Jag behövde transformera dessa celler med mitt 189 bp och 172 bp fragment för att senare kunna utföra b-galaktosidas mätningar som gav en indiktation på om det möjliga FNR proteinet i I. dechloratans hade förmåga att förmedla en anaerob induktion genom att binda in till den möjliga promotorn. Det första bildparet (Figur 25) visar RM 101 celler innehållande plasmiden pBR322_IdFNR och
transformerade med plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ innehållande mina 189 bp och 172 bp fragment. Cellerna har strukits ut och vuxit på ampicillin och kanamycin innehållande LB plattor t.o.m. dagen efter transformeringen. Det andra bildparet (Figur 26) visar RM 101 celler
innehållande plasmiden pBR322 utan FNR-genen transformerade med plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ innehållande mina 189 bp och 172 bp fragment och vuxit under samma förhållanden som cellerna i figur 25. På tredje bildparet (Figur 27) visas två kontroller, på LB plattan till vänster med ampicillin har en liten del utav otransformerade RM 101 bara innehållande pBR322 strukits ut och växt på. På plattan med kanamycin till höger har den resterande mängden strukits ut på. Detta gjordes för att verifiera att cellerna endast innehöll plasmiden pBR322 med ampicillin resistens och inget annat. Det visade sig att cellerna växte på ampicillin plattan men inte på kanamycin plattan som indikerar att plasmiden pBR322 som innehåller ampicillin resistans finns i cellerna. Hade cellerna växt på kanamycin plattan hade någon form av kanamycin resistens utvecklats eller att de på något sätt tagit upp en plasmid med det. Det hade inneburit att transformeringen inte kunnat göras eftersom en selektivitetskontroll då hade saknats.
För övrigt gav transformeringsförsöken gav en stor andel transformanter på ytterligare plattor än de som redovisas nedan.
Figur 25. LB + ampicillin + kanamycin plattor med RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322_IdFNR transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande fragment. IdFNR betecknar att I. dechloratans FNR-gen är inligerad i plasmiden. Talet 30 står för antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem. Bokstaven L betecknar att cellerna transformerats med 189 bp fragmentet och K med 172 bp fragmentet.
Figur 26. LB + ampicillin + kanamycin plattor med RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322 transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande fragment. Talet 25 står för antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem. Bokstaven L betecknar att cellerna transformerats med 189 bp fragmentet och K med 172 bp fragmentet.
Figur 27. Till vänster en LB + ampicillin platta med otransformerade RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322 och till höger en LB + kanamycin platta med likadana celler. Med beteckningarna (L) och (K) i menas att cellerna tillhörde den mängd var tänkta till att transformeras med 189 bp fragmentet respektive 172 bp fragmentet.
galaktosidas assay II
Figur 28 visar -galaktosidas uttrycket i RM 101 celler transformerade med 189 bp och 172 bp fragmenten. Mätningarna är gjorda på celler transformerade med olika innehåll. Alla celler
innehåller två plasmider som bas. Dessa plasmider är pBR322 och pBBR1-MCS2-LacZ. I en del av cellerna innehåller en utav plasmiderna eller båda två ett insert. Detta insert kan i plasmiden
pBR322 bara vara IdFNR som betonar att genen som kodar för I. dechloratans FNR har ligerats in. I plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ kan det finnas ett utav mina insert, 189 bp eller 172 bp
fragmentet. Vissa av cellerna innehåller bara dessa plasmider utan insert. Beteckningarna som införts här är följande ”189 bp/172 bp fragment med FNR” för celler innehållande 189 bp eller 172 bp fragmentet inligerat i plasmiden pBBR1MCS2-LacZ samtidigt som FNR-genen är inligerad i plasmiden pBR322. Är beteckningen ”189 bp/172 bp fragment utan FNR” är FNR-genen inte inligerad i pBR322 men fragmenten finns i pBBR1MCS2-LacZ. Om fragmenten är frånvarande men FNR-genen inligerad heter beteckningen och ”bakgrundsplasmider med FNR” respektive bakgrundsplasmider utan FNR om både fragment och FNR är frånvarande. Dessa mätningar i figur 28 gjordes enbart aeroba förhållanden. I mätningen har det förmedlade uttrycket från
bakgrundsplasmiderna med eller utan FNR insertet inte subtraherats ifrån någon av de andra uttrycksmätningarna i figuren. Mätningens syfte var få en uppfattning om FNR genens innebörd under aeroba förhållanden, om den har någon påverkan på uttrycket. Figur 29 visar -galaktosidas uttrycket i celler innehållande 189bp och 172 bp fragmenten inligerat i pBBR1MCS2-LacZ med FNR-genen inligerat i pBR322 under aeroba och anaeroba förhållanden. I mätningarna har uttrycket förmedlat från bakrundsplasmiderna med FNR subtraherats bort för att ge det riktiga uttrycket. Mätningarna gjordes för att ta reda på hur stort uttrycket var i cellerna, om det fanns en anaerob induktion och om i.s.f. för vilket eller vilka fragment. Figur 30 ställer uttrycket i celler med bakgrundsplasmiderna innehållande FNR-genen utan inligerade fragment mot celler med både FNR-genen och 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden. Det gjordes för att ta reda på hur stort -galaktosidas uttryckt bakgrundsplasmiderna med FNR bidrog med, om det var någon skillnad mellan det och uttrycket i celler som också innehöll 172 bp fragmentet och om det fanns en anaerob induktion. De uppmätta resultaten i figurerna 28, 29, 30 som sammanfattas i tabell VI och är bestämda med 95 % konfidensintervall.