Del II hade som syfte att ta reda om en gen i I. dechloratans som misstänks koda för ett protein tillhörande FNR familjen gör det. Genom att kotransformera E.coli celler som själva saknar ett eget FNR med I. dechloratans möjliga FNR-gen och mina fragment kan man under aerob och anaerob uppodling av cellerna följt av b-galaktosidas mätningar observera om cellerna induceras under anaeroba förhållanden. Därmed kan man avgöra om den möjliga FNR-genen kodar för ett funktionellt FNR-protein som tillåter anaerob respiration.
Plasmidpreparation
Plasmidpreparationen av pBBR1-MCS2-LacZ gjordes i två omgångar där första omgången gav 13,5 µg och andra omgången gav 15,2 µg plasmid. Elueringsvolymen var 100 µL och kvantifieringen gav resultatet i tabell IV. Renheten som bestämdes definieras som kvoten mellan absorbansvärden vid 260 och 280 nm.
Tabell V: Visar resultatet av absorbansmätning vid 260 och 280 nm för renhet och koncentration efter preparation av plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ.
Elueringsvolym [µL] DNA Koncentration [ng/µL] Renhet [-]
100 135 ng/µL 1,9
Restriktionsklyvning
Innan plasmiden pBBR1MCS2-LacZ klövs med både EcoRI och SalI samtidigt inleddes med en testklyvning med varje enzym enskilt för att säkerställa att båda enzymerna var kapabla till att klyva den. Därefter klövs totalt 6 µg plasmid med båda enzymerna för att sedan användas i
ligeringssteget.
I figur 19 visas testklyvningen med EcoRI och SalI av plasmiden pBBR1MCS2-LacZ utkört på en 0,8 % TAE x 1 gel som verifierar att de klyver plasmiden. Där brunn (EcoRI) till vänster
representerar bandet som innehåller plasmiden kluven med EcoRI, brunn (SalI): plasmid kluven med SalI, brunn (OK): okluven plasmid och brunn (Stege): referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och bandet under 5077 bp. Figur 20 visar klyvningen av 6 µg plasmidpBBR1-MCS2-LacZ med enzymerna EcoRI och SalI samtidigt utkörd på en 0,8 % TAE x 1 gel. Tillsammans har enzymerna klyvt bort ett 27 bp långt fragment som senare i ligeringsteget ska ersättas av 189 bp och 172 bp fragmenten som också klyvts med samma restriktionsenzymer. De tre brunnarna till vänster
markerade (KP) visar tre vandrande band som innehåller 2 µg var kluven plasmid med både EcoRI och SalI, brunn (OK) näst intill är okluven plasmid och bredvid den (Stege) referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och bandet under 5077 bp.
Här syns direkt att båda banden som representerar kluven plasmid med EcoRI och SalI ligger skilt från bandet som representerar den okluvna plasmiden. DNA kan anta olika former som medför band på olika platser i gelen beroende på varje forms rörelsemotstånd i gelen. Den okluvna plasmiden tar i den här, mer relaxerade formen upp en större yta än den kluvna linjära plasmiden och rör sig därför långsammare genom gelen. Bandet för den kluvna plasmiden hamnar därför under bandet för den. Den kluvna plasmidens storlek är 8234 bp som ligger mitt emellan stegens 11501 bp och 5077 bp som den linjära plasmid bör göra.
Figur 19.Visar gelen med fyra prover från vänster till höger där plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ är kluven med EcoRI i första brunnen (EcoRI) och i brunnen (SalI) intill kluven med SalI. Den tredje brunnen (OK) innehar okluven plasmid och den fjärde brunnen (Stege) Lambda DNA/PstI Marker, 24.
Figur 20. Visar gelen där de tre första brunnarna från vänster innehåller 2 µg var kluven pBBR1-MCS2-LacZ med enzymerna EcoRI och SalI. Brunnen (OK) näst intill har okluven plasmid och bredvid den, brunnen (Stege) finns det en Lambda DNA/PstI Marker, 24.
Rening av kluven plasmid
Reningen av den kluvna plasmiden gav ett totalt utbyte på 18 %, ca 1 µg kluven plasmid DNA av de 6 µg som separerades ut på gelen. Elueringsvolymen var 50 µL och gav koncentrationen 22 ng/µL med renheten 1,9-2.
PCR
PCR reaktionerna gjordes med genomiskt I. dechloratans DNA som templat och med uppströms primer och nedströms primer_189 för att konstruera och amplifiera 189 bp fragmentet och med uppströms primer och nedströms primer_172 för att konstruera och amplifiera 172 bp fragmentet. Resultatet separerades efteråt ut på en 3 % TBE x 1 agaros gel för verifiering och visas i figur 21. Fragmenten testades tillsammans med en referensstege GeneRuler low range DNA ladder (Thermo Scientific). Stegens 150 bp och 200 bp är markerade på bilden. Två negativa kontroller gjordes med alla komponenter utan templat DNA. En kontroll innehöll nedströms primer_172 men ingen
nedströms primer_189 och den andra kontrollen innehöll tvärtom. Kontrollerna visade sig vara kontaminerade eftersom att produkter bildats i brunnarna 10 och 11. Jag försökte ta reda på vilken eller vilka av komponenterna som var kontaminerade genom att byta ut de olika komponenterna mot nytt av ur en annan förpackning. Alla komponenter hann jag inte byta p.g.a. att det tog för lång tid samtidigt som risken att fel produkt hade bildats i reaktionen var mycket liten.
När det var dags att tillsätta produkt ifrån PCR reaktionen till brunnarna på gelen i figur 21 inför verifieringen gjordes det genom att först lösa 2 µL av provet i 8 µL sterilt vatten. Det gjordes för att få en rimlig volym att tillsätta eftersom brunnarna är ganska djupa och för att späda ut provet p.g.a. att resultatet ifrån de två tidigare PCR reaktionerna (Figur 11 och 12) visat detta är en lämplig mängd som syns bra på gelen.
Figur 21. Visar PCR produkternas vandring genom gelen. Brunnarna 1-4: innehåller 189 bp fragment, brunn 5: GeneRuler low range DNA ladder, brunnarna 6-9 har 172 bp fragmentet och 10-11 är kontaminerade blankprover.
PCR Rening
Proverna renades totalt två gånger, en gång direkt efter PCR reaktionen och ytterligare en gång efter restriktionsenzymssätena i ändarna av fragmenten klyvts. Det gav resultaten 36 ng/µL för 189 bp fragmentet och 29 ng/µL för 172 bp fragmentet efter reningen och 19 ng/µL för 189 bp fragmentet och 14 ng/µL för 172 bp fragmentet efter den andra reningen. Elueringsvolymerna var 50 µL. Renheten blev 1,9 -2 respektive 1,9.
Transformering II
Figur 22 och 23 visar transformerade XL1-BLUE bakterier med 189 bp respektive 172 bp fragment som strukits ut och vuxit på kanamycin innehållande LB plattor t.o.m. dagen efter transformeringen. Cellerna ströks ut på enskilda plattor betecknade 200 L, 100 L och 40 L respektive 200 K, 100 K och 40 K, där står för (L) bakterier transformerade med 189 bp fragmentet och (K) bakterier med 172 bp fragmentet. Talen betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på plattorna.
Figur 22. LB + kanamycin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 189 bp fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.
Figur 23. LB + 3anamycin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 172 bp fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.
Verifiering II
Sekvenseringsresultatet av de inligerade fragmenten från den möjliga promotorn gav de tänkta 172 bp och 189 bp varianterna med undantaget att det fanns två insertionsmutationer i 189 bp
fragmentet. Båda var placerade inom ISIde1 elementet (Figur 24).
Plasmidsekvensen uppströms och nedströms 189 bp insertet var identiskt med den ifrån databasen. Gällande plasmiden med 172 bp insertet kunde sekvenseringsföretaget bara leverera resultatet för plasmidsekvensen nedströms insertet. Den också var identisk till databasens.