Undersökning av en möjlig FNR-beroende promotor uppströms genen för kloritdismutas i Ideonella dechloratans

Undersökning av en möjlig FNR-beroende promotor uppströms genen för kloritdismutas i Ideonella

dechloratans

Examination of a possible FNR-dependent promoter upstream the gene for chlorite dismutase in Ideonella dechloratans

Shady Blomqvist

Fakulteten för hälsa, natur- och teknikvetenskap Civilingenjörsprogrammet i kemiteknik

Examensarbete Civilingenjör 30 HP Handledare: Maria Rova

Examinator: Lars Järnström Datum

Löpnummer

Sammanfattning

Ideonella dechloratans är en fakultativ anaerob som innehåller generna för kloratreduktas och kloritdismutas nödvändiga för respiration av klorat. Man har tidigare visat att kloritdismutas induceras under anaeroba förhållanden och anses regleras på transkriptionsnivå. Inom sekvensen uppströms genen har ett möjligt FNR-säte lokaliserats, en konsensus-sekvens dit

transkriptionsfaktorn FNR kan binda in. FNR är ett regleringsprotein som tillåter anpassning av fakultativa anaerober som Ideonella dechloratans till syrefattiga miljöer. I det här arbete undersöks sekvensen uppströms genen för kloritdismutas efter en möjlig FNR-beroende promotor. Genom tillverkning av två fragment 189 bp respektive 172 bp långt av sekvensen, innehållande en möjlig promotor med och utan -10 elementet och via en plasmidvektor med en -galaktosidas reportergen transformera in dessa i Escherichia coli och mäta uttrycken med -galatosidas mätning under aeroba och anaeroba förhållanden. Det 189 bp fragmentet gav upphov till basaluttryck och anaerob induktion på 3.3 x basaluttryck medans 172 bp fragmentet inte gav upphov till något uttryck

överhuvudtaget. fragmenten kotransformerades också in i en FNR-negativ stam tillsammans med en möjlig FNR-gen ifrån Ideonella dechloratans som visade sig ha förmåga att inducera uttrycket av kloritdismutas under anaeroba förhållanden med 2.8 x basaluttrycket. Detta visar att -10 elementet är viktigt för både aerobt och anaerobt utrryck vilket föreslår att det finns en promotor inom 189 bp fragmentet som både står för ett basaluttryck och ett anaerobt uttryck. Resultaten visar också att att den regleras utav FNR och att FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans kan utföra den anaeroba induktionen.

Innehållsförteckning

Sammanfattning...2

Övergripande Sammanfattning...7

Bakgrund...7

Transkription och promotor regioner i prokaryoter...8

Tidigare resultat och avsikten med arbetet...9

Metodiken kortfattat...10

Sammanfattning av resultaten...11

De viktigaste slutsatserna...12

Executive Summary...13

Background...13

Transcripiton and promoter regions in prokaryotes...14

Earlier results and the purpose of this thesis...15

Methods...17

A summary of the results...18

Conclusion...19

Förkortningar...20

Introduktion...21

Problemformulering...21

Syfte...21

Klorat och perklorat: Egenskaper och miljöproblem...22

Enzymer för kloratmetabolism...23

Transkription och promotor regioner i prokaryoter...24

Möjliga promotorer för cld-genen i I. dechloratans och FNR-reglering...26

Metodiker...29

Uppnådda resultat...31

Viktigaste slutsatserna...31

Material och metoder...32

Bakteriestammar, plasmider och odlingsförhållanden...32

Analys av promotorsekvens...32

Plasmidpreparation...32

Klyvning av plasmid...33

PCR: Tillverkning av insert...34

Klyvning av fragment...35

Ligering...35

Transformering...35

Verifiering av kolonierna med 189 bp och 172 bp transformanter...35

- galaktosidas Assay  ...36

Elektrokompetenta celler...36

Elektroporering...36

Resultat: Del I...37

Analys av promotorsekvens...37

Primers...38

Plasmidpreparation...40

Restriktionsklyvning...41

PCR...44

Rening av PCR produkterna...45

Transformering...46

Verifiering...47

Celltillväxt XL1-BLUE...48

- galaktosidas assay   ...49

Resultat: Del II...52

Plasmidpreparation...52

Restriktionsklyvning...53

Rening av kluven plasmid ...54

PCR...55

Transformering II...56

Verifiering II...57

Transformering III...58

galaktosidas assay II  ...61

Celltillväxt RM 101...66

Diskussion ...67

Val av plasmider...67

Val av primrar för test om hypotes...68

Fragmenten för test om hypotes...69

Den FNR-beroende promotorn...70

FNR´s roll i I. dechloratans...72

Celltillväxt...73

Klyvning av plasmid...74

PCR...74

Felsökning assayer...75

Slutsats...76

Tackord...77

Referenser...78

Appendix...82

Övergripande Sammanfattning

Bakgrund

Under en längre tid har nu industriella processer som använder sig utav klorat och perklorat sökt en lösning på hur man skulle kunna förhindra vidare utsläpp av dessa ämnen ut naturen. Ämnena är viktiga komponenter i många av processerna och där klorat t. ex. används som blek och

deligninfieringsmedel inom pappersindustrin [3,4,17] och perklorat som komponenter i olika raket- [5, 17, 18], och missilbränslen eller som gödningsprodukter [18]. Samtidigt besitter klorat och perklorat egenskaper som gör dem extremt tåliga och mobila [17, 18] som medför att de väldigt lätt kan röra sig långa avstånd ifrån källan ut i naturen. Dessutom är båda kompunden hälsoskadliga både för människor, djur och växter. Klorat är framförallt skadligt för vattenväxter, främst brunalger [1, 4, 17] där föreningen tros inhibera och stänga av ett nitratreducerande system som medför att många av dessa växter dör [3, 17]. Perklorat har visat sig vara mer skadlig för människor och djur där intag leder till försämrat jodupptag som i sin tur kan leda till växt och utvecklingsproblem hos individen [2, 10, 16, 18]. Som lösning på problemet anses mikroorganismer som anaerobt kan respirera dessa ämnen och på så sätt bryta ned dem till ofarliga grundämnen. Dessa bakterier återfinns på platser där klorat och perklorat naturligt uppkommer. Det är vanligtvis i

minneralfyndigheter lokaliserade i öknar värden över som t. ex. i Chile och Kanada eller i förhistoriska vattenansamlingar i runt om i USA [1, 5]. Mikroorganismerna finns i två typer, perkloratreducernade bakterier som både kan reducera perklorat och klorat, och kloratreducernade bakterier som bara kan reducera klorat [4, 11, 17]. Enzymen som gör det möjligt att under anaeroba förhållanden respirera dessa ämnen är perklorat reduktas, klorat reduktas och kloritdismutas. Endast perkloratreducerande bakterier bär på perklorat reduktas som både kan reducera perklorat och klorat vidare till klorit, likaledes gäller kloratreduktas som bara finns kloratreducernade bakterier och bara reducerar klorat till klorit men klarar inte av perklorat. Kloritdismutas är gemensamt för de båda huvudtyperna och omvandlar klorit till syre och kloridjoner [4,10]. Reaktionsvägen för nedbrytning av perklorat och klorat visas i Figur S1.

Figur S1. Visar reaktionsvägen för reduktionen av klorat och perklorat.

Transkription och promotor regioner i prokaryoter

För att en gen i en mikroorganism ska uttryckas till ett funktionellt protein måste först ett RNA- polymeras binda in till en sekvens strax uppströms genen. Den sekvensen kallas en promotor och tillåter initiering utav en transkriptionsprocess. Det innebär att RNA polymeraset skriver om genen som en kopia i form av ett ”messenger RNA” som senare översätts till ett funktionellt protein in annan process som kallas translation. Promotorregionen är mycket viktig för uttrycket och bestämmer i vilken grad det sker. Den har karakteristika drag som identifieras av en s-faktor, ett protein associerar med RNA polymeraset och leder polymeraset dit strax innan transkription.

Beroende på om de karakteristiska dragen är mer eller mindre konserverade avgör de hur aktiv promotorn är och därmed om uttrycket är högt eller lågt. Dessa drag identifieras som ett transkriptionsstart som är nukleotiden A eller G och två element som benämns -10 och -35.

Elementen är ungefärligt positionerade -10 och -35 nukleotider från transkriptionsstart och har konsensussekvenserna TATAAT respektive TTGACA (Figur S2). Ett avvikande ifrån sekvenserna är vanligt i promotorer där normalt 3/6 eller fler av nukleotiderna är bevarade [8, 9]. Det finns också en större preferens för vissa nukleotider på bestämda positioner inom -10 elementet som anses ha en större betydelse inom för identifiering av promotorn och inledning av transkription. Dessa är det första T:t inom – 10 elementet, närmast transkriptionsstart och benämns ha position -7, och A på position -11 räknat uppströms från -7 positionen. De tar direktkontakt med RNA-polymeraset [24].

-10 elementet i sig själv är oftast mest bevarat, speciellt i de fall där -35 området avviker ibland uppkommer en TG determinant positionerat en nukleotid uppströms -10 hexameren (Figur S2) som ytterligare styrker promotorn identifieringen [9, 12]. Elementet benämns då ”exteneded – 10” och har konsensus-sekvensen TGNTATAAT. Även optimala avstånd mellan elementen och TSS utgör en effekt på promotoraktiviteten, för störst aktivitet är avstånden sjutton nukleotider mellan -10 och -35 elementet [12, 24] och sju nukleotider mellan -10 elementet och transkriptionsstart. Små

proteiner som kallas utav transkriptionsfaktorer kan ibland binda in till promotorn och underlätta eller motverka inbindning av ett RNA-polymeras och därmed öka eller sänka uttrycket av

genprodukten. En sådan transkriptionsfaktor är FNR som kontrollerar övergången mellan aerob och anaerob metabolism via reglering på transkriptionsnivå [6, 14, 23]. FNR är en monomer som aktiveras i syrefria miljöer och får då ett [4Fe–4S]²⁺ kluster som tillåter dimerisering [23]. Det leder till att proteinet sekvensspecifikt kan binda in till en egen konsensus-sekvens som är placerade på promotorer och reglera uttrycket.

Figur S2. Visar den typiska arkitekturen för en bakteriell promotor och konsensus-sekvenserna för ^faktorn hos E.coli [19].

Tidigare resultat och avsikten med arbetet

Problemet med mikroorganismerna är att många av dem är fakultativa anaerober som innebär att de lever under aeroba förhållanden men har förmågan att utnyttja anaeroba respiration i frånvaro av syre. Det betyder att man måste avlägsna syret i miljön runt omkring för att få bakterierna att gå över till en anaerob respiration för att de t. ex. ska kunna reducera klorat och perklorat. Ideonella dechloratans tillhör kloratreducerande bakterier där studier kring den anaeroba uppregleringen utav kloritdismutas främst stått i fokus. Målet är att förstå vad som orsakar den så att man potentiellt skulle kunna styra över den oberoende av hur miljön runt omkring ser ut. Hittills har ett möjligt transkriptionsstart identifierats [21] och en möjlig FNR-box [20] (Figur S3) inom sekvensen uppströms kloritdismutas-genen. Man har visat att mutationer på FNR-boxen inte bara stänger ned den anaeroba induktionen men också leder till att basaluttrycket under aeroba nästan försvinner helt [15]. Genom att istället bevara FNR-boxen och föra över promotorregionen till en bakteriestam som inte har förmåga att uttrycka ett FNR har det visat att ett basalt uttryck ändå förmedlats [15]. Detta gav upphov till en hypotes om att en FNR-beroende promotor längre nedströms finns som leder den anaeroba induktionen eftersom med FNR-sätets position i förhållande till transkriptionsstart (Figur S3) ser ut att ha en undertryckande roll utav genen.

Figur S3. Visar var en möjlig promotor skulle kunna vara belägen för kloritdismustas-genen i Ideonella dechloratans. De lätt understrukna nukleotiderna i -10 och -35 elementen stämmer överens med konsensus-sekvenserna i Escherichia coli [15]. Den grövre understrukna sekvensen är ett möjligt FNR-säte position.

Därför gjorde jag en teoretisk analys av sekvensen uppströms kloritdismutas-genen i förhållande till FNR-pallindromet med i hopp om att finna en möjlig FNR-beroende promotor (Figur S4). Av den gjorde jag sedan två fragment, ett 189 bp långt som bevarar hela den möjliga promotorn och ett 172 bp långt där det möjliga -10 elementet avlägsnats. De ligerades in i reportervektorer och

transformerades in i två olika Escherichia coli stammar med (XL1-BLUE) och utan (RM 101) förmåga att producera ett FNR. En del av celler som saknade FNR transformerades också med en gen ifrån Ideonella dechloratans som möjligen kodar för ett FNR. Genom att mäta uttrycken under aeroba och anaeroba förhållanden kunde resultatet av mätningarna relateras till frågeställningen om hur vida det finns en FNR-beroende promotor uppströms kloritdismutas-genen och om den regleras utav ett FNR-protein.

Figur S4. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn för kloritdismutas genen i Ideonella dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en klass II promotor som allmänt har ett transkriptionsstart 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet. Det optimala avståndet på sju nukleotider uppströms transkriptionsstart gav ett möjligt extended -10 element markerat i fet stil med understrukna nukleotider som överensstämmer med Escherichia coli konsensus-sekvens TATAAT. -35 elementet bestämdes sjutton nukleotider uppströms första nukleotiden i -10 hexameren, elementet är markerat med fet stil och överensstämmande nukleotider understrukna.

Metodiken kortfattat

Tillverkningen av sekvenserna innehållande den möjliga FNR-beroende promotorn med och utan -10 elementet gjordes med Polymerase Chain Raction eller PCR. Tekniken går ut på att man amplifierar en önskad sekvens ifrån t. ex. en större DNA molekyl. För att utföra reaktionen behövs två primrar som är komplementära till en del utav sekvensen som ska amplifieras, ett polymeras, nukleotider, MgCl och templat DNA. Reaktionen delas därefter in i tre steg efter varandra

denaturereing annealing och extension. Stegen utförs sedan i ordning med bestämda temperaturer och tider sådant att primrarna binder in till sekvensen som ska amplifieras och polymeraset kan förlänga primrarna. Stegen utförs flera gånger som ger upphov till att ett stort antal produkter bildas.

För att mäta om fragmenten av den möjliga FNR-beroende promotorn kunde ge upphov till

transkription och därmed uttryck ligerades de in framför en promotorlös gen som kodar för enzymet

galaktosidas i plasmiderna pBBR1MCS-4-LacZ och pBBR1MCS-2-LacZ. Plasmiden som är en cirkulär DNA sekvens och klövs upp så att den blev linjär och efter det sammanfogades med den amplifierade promotorsekvensen och återförslöts igen.

Klyvningen görs med restriktionsenzymer som identifierar en specifik DNA sekvens som benämns ett restriktionssäte bestående av ett par nukleotider och klyver av DNA:t där. Plasmiden innehåller många sådana säten från början medans ett specifikt säte som också fanns i plasmiden adderades på promotorsekvensen under amplifieringen. Både plasmid och promtorsekvens kan då klyvas med samma restriktionsenzym som gör att komplementära ändar hos plasmid och promotorsekvens som kan binda till varandra via vätebindningar. Sammanfogningen slutförs sedan i ett ligeringssteg där enzymet DNA ligas syntetiserar ihop DNA strängarna kovalent med fosfodiesterbindningar som återförsluter promotorsekvensen med plasmiden som återgår till cirkulär form, nu innehållande promotorsekvensen framför galaktosidas-genen.

För att introducera in plasmiden innehållande den möjliga FNR-beroend promotrsekvensen in i en bakterie användes transformering. Två olika transformeringsmetoder användes. En mer generell metod som involverar att man utsatte cellerna för ett elektriskt fällt en kort tid som ger upphov till att porer bildas i cellväggen och medför att DNA molekyler ifrån omgivningen kan tränga in. Den andra metoden var mer specifik och där tillgjorda celler som mycket lätt tar upp DNA beställdes ifrån ett företag och där igenom följa ett protokoll som beskriver hur man ska gå till väga för att introducera DNA utifrån in i cellen.

Cellerna odlas därefter upp under aeroba och anaeroba förhållanden i lämpligt odlingsmedium med antibiotika. Det skördas under exponentiell fas och toulen tillsattes som permeabiliserar cellerna så att det färglösa substratet o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG), när tillsatt, kan diffundera in i cellen och konverteras av galaktosidas till två produkter varav en är färgad. Mängden gul produkt kan då mätas via absorbans vid våglängden 420 nm som är, proportionellt mot, om substratet tillsätts i överflöd, mängden enzym som bildats och reaktionstiden [22].

Sammanfattning av resultaten

Den 189 bp långa sekvensen med den fullständigt bevarade möjliga FNR-beroende promotorn gav upphov till basaluttryck och anaerob induktion. Induktionen bestämdes till 3.3 ggr basaluttrycket i XL1-BLUE och till 2.8 i RM 101 som också kontransformerats med den möjliga FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans. Den kortare 172 bp sekvensen där -10 elementet avlägsnats gav inget uttryck i XL1-BLUE till väldigt låga uttryck i RM 101 utan tydlig anaerob induktion (Figur S5 och S6).

Figur S5. Visar galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ med 189 bp fragmentet mot celler med 172 bp fragmentet efter tillväxt under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 22 st för 189 bp aerobt, 12 st för 189 bp anaerobt, 24 st för 172 bp aerobt och 18 st för 172 bp anaerobt.

-50 0 50 100 150 200 250 300

Beta - galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler med 189 bp och 172 bp fragmenten under aeroba och anaeroba förhållanden

Aerobt (189 bp fragment) Anaerobt (189 bp fragment) Aerobt (172 bp fragment) Anaerobt (172 bp fragment)

Beta – galaktosidas [Miller Units]

Figur S6. Visar Galaktosidas aktiviteten i RM 101 celler med I. dechloratans FNR innehållande fragmenten 189 bp och 172 bp under aeroba och anaeroba förhållanden. Det bidragande uttrycket förmedlat i celler med bakgrundsplasmiderna innehållande FNR har subtraherats bort ifrån alla mätningar. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 3 för alla aeroba prov och 4 st för de anaeroba.

Det verifierades genom att jämföra uttrycken aerobt och anaerobt för 172 bp fragmentet mot uttryck i celler som enbart bar på reportervektorn utan inligerat fragment. Resultaten visade också att RM 101 som endast transformerats FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans överlevde under anaeroba förhållanden med NaNO3-respiration till skillnad från RM 101 utan någon FNR-gen.

De viktigaste slutsatserna

Resultaten visar tydligt att utan det föreslagna -10 elementet sänks uttrycket under både aeroba och anaerob förhållanden till nära noll och måste bevaras för fullt uttryck utav kloritdismutas. Av det dras slutsatsen att transkription under aeroba och anaeroba förhållanden startar ifrån den FNR- beroende promotorn. En annan slutsats är att den möjliga FNR-genen Ideonella dechloratans kodar för ett protein som kan inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Proteinet har också

förmågan att ersätta Escherichia coli 's FNR-proteins i roll under NaNO3-respiration.

0 20 40 60 80 100

Beta - galaktosidas aktivitet i RM 101 med FNR av 189 bp och 172 bp fragmenten aerobt och anaerobt

Aerob 189 bp fragment med FNR utan bakgrund

Anaerob 189 bp fragment med FNR utan bakgrund

Aerob 172 bp fragment med FNR utan bakgrund

Anaerob 172 bp fragment med FNR utan bakgrund

Beta - galaktosidas [Miller Units]

Executive Summary

Background

Under a longer peridod of time industriall processes that makes use of chlorate and perchlorate has been seekeing a solution on how to stop the effluent of these compounds reaching the environment.

Both chlorate and perchlorate are important componenents in many of the processes and are specifically used as bleech and delignifying agents in the paper and pulp indusrty [3,4,17],

respektive as components in combustionaccelerants such as rocket [5, 17,18], and missilfuels, and fertilizeragents in agriculture [18]. At the same time chorate and perchlorate are extremly mobile and inert [17, 18] which makes it easy for them, once they escape an industriell area, to travel long distances from the source and widley contaminate the environment. Further, the compounds are considered hazardous for both animal and plants. Chlorate does most damage to waterplants such as algea, where it inhibits a nitratereducing pathway causing it to fail [3, 17] which has resultet in that many of these plants have dissapeard, in particular brown algea [1, 4, 17]. Perchlorate has shown to be more hazardous toward animals and humans where it interferes with the iodine uptake causeing growth and developmental problems to the individual [2, 10, 16, 18]. A possible solution to this problem might be to use of naturally found microorganisms with the ability to anaerobically respire on these compunds, reducing them into the their corresponding elements, rendering them harmless.

These creatures are found all around the world in places where know sources of natural chlorate and perchorate has been found. This is usually mineralldeposits found in desserts like in Chile and Canada or in prehistoric aquifers around the USA [1, 5]. The microorganisms are present in two types, perchlorate-respiring bacteria and chlorate-respiring bacteria. Perchlorate-respiring bacteria can reduce both perchlorate and chlorate while chlorate-respiring bacteria can only reduce chlorate [4,11, 17]. The enzymes which makes this possible is perchlorate reductase, chlorate reductase and chlorite dismutase. Perchlorate reductase has the ability to reduce both perchlorate and chlorate to chlorite and is only present in perchlorate-respiring bacteria. Chlorate reductase can reduce chlorate to chlorite but not perchlorate, and is present in chlorate-respiring bacteria. The enzyme chlorite dismutase turns chlorite into molecular oxygen and chloride ions [4,10], and are present in both perchlorate-respiring bacteria and chlorate-respiring bacteria. The reaction pathway for the degradation of chlorate and perchlorate is shown in Figure SI.

Figur SI. Shows the reaction pathway for the reduction of chlorate och perchlorate.

Transcripiton and promoter regions in prokaryotes

In order for a functional protein to be expressed from a gene an enzyme called RNA-polymerase must attach itself to small region just upstream the gene. This sequens is termed a promoter and allows for the initation of a process called transcription. The meaning of transcription is when the RNA-polymerase rewrites a copy of the gene in the form of a ”messenger RNA”, the mRNA is later transalted into a functional protein in another process called translation. The promoter is essentiell for the expression of the gene and decides to what extent it is done. It has some characteristic features that can be identifiead by another protein, the s-factor, which associates it self with the RNA-polymerase and leads the polymerase to the promoter in time for transcription. Depending on how well conserved these characteristic features are helps decide how active the promoter is and by that if the gene expression is high or low. The features are a transcription start site which is an A or a G nucleotide and beyond that two elements termed -10 and -35. The elements have the consensus sequenses of TATAAT respektive TTGACA and are approxemalty possitioned -10 respektive -35 nucleotides uppstream the transcription start site (Figure SII). Usually the elements are not

compleatly conserved and a match of 3/6 nucleotieds per element or more is to be expected [8, 9]. It has also been shown that there is a preference for some nucleotides at certain positions within the -10 element. These are the first T within the -10 element closest to the transcription start site referred to as the -7 position, and A on position -11 counting uppstream from the -7 position.

Because of the higher preference of the nucleotides -7T and -11A, it has predicted that they have more of an importans than the other nucleotides in the -10 element in the process of identyfiying the promoter. Later is has been shown that they make direct contact with the RNA-polymerase under the initiation of transcription process [24]. The -10 element is the more conserved element between the two especially when the – 35 element is not. Then the appearance of a TG determinant might happen, possitioned on nucleotde upstream the -10 element (Figure SII), that can further strengthens the promotor identification and activity [9, 12]. The combination of this TG determinant with the -10 element is called an ”extended -10 element” and has the consensus sequence TGNTATAAT.

Even the distances between these elements and in relationship to the transcription start site has an impact on the promotor strength. The most common distances between the -10 and -35 elements are 17 nt [12, 24] and 7 nt between the -10 region and the transcription start site, this is also considered to be the most optimal distances that contributes most to the promotor activity. The expression of a gene can also be regulated by the binding of small proteins referred to as transcriptionfactors to the promotor, facillitating or counteracting the transcription process and thereby increase or repress the exprsseion. FNR is an example of such a transcriptionfactor, that regulates the transition between aerobic and anaerobic respiration on the trancriptional level [6, 14, 23]. The protein consists of a monomer that activates under oxygen starvation and is then presented with a [4Fe–4S]²⁺ cluster allowing it to dimerize [23] and successfully bind to a consensus sequence of its own located somwhere on the promoter region of genes whom are regulated by FNR.

Figur SII. Shows the typical architecture of a bacterial promoter and consensus sequence of the ^- factor of E.coli [19].

Earlier results and the purpose of this thesis

Many of the microorganisms are facultative anaerobs which means that gathers energy through aerobic respiration if oxygen is present but has the ability to switch to anaerobic respiration or fermentation if oxygen i abscent. This presents qiute of a problem in that the effluent from an industriell process must be deprivied of oxygen in order for the bactereia to enter anaerobic respiration and reduce chlorate and perchlorate. Ideonella dechloratans is a chlorate respiring bacteria in which studies connected to the uppregulation of the chlorite dismutase gene has been of main focus. The goal is to get an understanding of what's causing this increase so that one would be able to controll it without having to deprive the effluent of oxygen. So far a possible

transcritionstart site [21] and a FNR-box [20] (Figure SIII) within the sequence upstream the chlorite dismutase gene. It has been shown that mutating the FNR-box inside the promoter region leads to almost total loss of expression under both aerobic and anaerobic conditions. By insted preserving the FNR-box and cloning the entire possible promoter region into the FNR negative Escherichia coli type RM 101 has shown that the promoter still supports basal expression under aerobic condition [15]. This gave to the hypothosis of that there might be a FNR-dependent promoter further downstrem the FNR-box which is responsible for the upregulation since the postion of the FNR-box in relationship to the possible transcription start site (Figure SIII) is mostly seen in cases when FNR acts as a repressor.

Figur SIII. Shows where a possible promotor could be positioned relative to the chlorite dismutase gene in Ideonella dechloratans.

The thin underlined nucleotides inside the -10 and -35 elements match the consensus sequence in Escherichia coli. The coarser underlined sequence is a possible FNR-site [15].

Therefor I made a theoretical analysis of the sequence upstream the chlorite dismutase gene with respect to the position of the FNR-box in hope of finding a possible FNR-dependent promotor (Figure SIV). I then made two constructs of the result i found, one 189 bp long sequence containing the entire possible FNR-dependent promoter and one 172 bp long sequence where the -10 element had been removed. The sequences where ligetad in reprtervectors and transformed into to types of Escherichia coli types with (XL1-BLUE) and without (RM 101) the ability to produce FNR. Into some of the cells lacking the ability to produce FNR, a gene that might code for a FNR-protein in Ideonella dechloratans was also transformed indroduced into them. By conducting chemicall assays I was able to measure the expression each construct provided under aerobic and anaerobic

conditions and by doing so it was possible to relate them to issue if there exists a FNR dependen promoter upstream the chlorite dismutase gene and if it is regulated by FNR.

Figur SIV. Shows where the possbile FNR-dependent promtoter for the chlorate dismutase gene in Ideonella dechloratans is located.

The sequence was assumed to be a class II type FNR promoter which has a transcription start site 41.5 nucleotides downstream the centre of the FNR-site. The optimal distance of seven nucleotides upstream the transcription start introduced a possible extended -10 element marked in bold type with underlined matching nucleotides to the Escherichia coli consensus sequence TATAAT. The -35 element was found seventeen nucletides upstream the fisrt nucleotide in the -10 hexamer, the element is also marked in bold type with underlined matching nucleotides.

Methods

The production of the constructs containing the possible FNR-dependent promoter with and without the -10 element was made by the use of a technique called Polymerase Chain Raction or PCR. It makes it possible to amplify a short fragment of DNA from a known sequence. In order to conduct this method two primers are needed whom are short oligonucleotied complementary to a short strech flanking part of the sequnce intended for amplification. Also needed are nucletiodes, a polymerase, some MgCl and a DNA template. The reaction which produces the products is devided into three stages, denaturation, annealing and extension and are conducted in that order with set times and temperatures. This makes it possible for the primers to bind to the sequence of intresst and for the polymerase to extended the primers and thereby make a copy of the fragment. This is performed multiple times through the process resulting in a large number of products.

In order to estimate if the constructs were able to give rise to expression they had been ligated infront off the b-galactosidase gene in the reportervector pBBR1MCS-4-LacZ and pBBR1MCS-2- LacZ. The reportervector which has a circular shape was cut open to give a linear shape and thereafter a construct were joined together with the reportervector and ligated into circular form again. The digestion was done by using restrictionnezymes which identifies a specific DNA

sequance called a restriction site consisting of a short strech of nucleotides. The restricitionenzymes cuts the DNA at this loaction. The vector contains alot of these sequances corresponding to multiple restrictionenzymes. One of these restriction sites is added to the constructs during the PCR

amplification so that both the vector and the constructs can be digested with the same

restrictionenzyme. This leads to that complementary ends are formed on the vector and constructs which can then bind to each other through hydrgenbonding. By addning DNA ligase, new

phosphodiesterbonds are formed between the vector and the construct which returns the vector to its circular shape now containing the possible FNR-dependent promoter sequence infront off the

galactosidas-gene.

To introduce the reportervector carrying the variations of the possible FNR-dependend promoter into bacteria the method of transformation was used. Transformation can be conducted in many ways where as in this work two methods were used. One was a more common method which involve exposing the cells to an electric pulse under a short period of time which promotes the formation of pores in the cell wall therby making it possible for DNA molecules in the surrounding solution to enter.

The cells were thereafter cultivated under aerobic and anaerobic conditions in a propper cultivation medium and an antibiotic. They were then harvested under exponentiall growth and was treated with toluene directly afterwards. This shatters the cell making entry of small molecules such as the substrate o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG) into the cell possible. ONPG is collorless which is converted into two products, one of which is yellow, in the presence of b-galactosidase. The amount of yellow product can be measured with absorbance at 420 nm, and if ONGP was added in excess, the amount of product is proportional to the amount of enzyme present and the reaction time between the enzyme and ONPG [22].

A summary of the results

The 189 bp construct containg the entire possible FNR-dependent promoter was shown to support both basal expression and was upregulated under anaerobic conditions. The anaerobic induction was determined to be 3.3 times the basal expression in XL1-BLUE, and 2.8 in RM 101 containing the the possible FNR gene from Ideonella dechloratans. The shorter cosntruct with the -10 element removed didn't give rise to any expression at all in XL1-BLUE and a very low expression in RM 101 (Figure SV and SVI).

Figur SV. Shows the galactosidase activity in XL1-BLUE cells containing the vector pBBR1-MCS4-LacZ with the 189 bp fragment vs cells with the 172 bp fragment after growth under aerobic and anaerobic conditions. The errorbars represent a 95 % confidnece interval for the mean value. The number of observations for each mean value are 22 and 12 for the 189 bp under aerobic and anaerobic conditions respecively. For the 172 bp fragment the number of observations were 24 under aerobic and 18 under anarobic conditions.

Figur SVI. Shows the galactosidase activity in RM 101 cells with Ideonella. dechloratans FNR-gene and the vector pBBR1- MCS2-LacZ containing the fragments 189 bp och 172 bp under aerobic and anaerobic conditions. The expression mediated by the backbone vectors alone containing the FNR-gene has been subtracted from all measurements. The errorbars represent a 95 % confidnece interval for the mean value. The number of observations were 3 under aerobic and 4 under anarobic conditions.

-50 0 50 100 150 200 250 300

Beta - galactosidase activity in XL1-BLUE cells containing 189 bp and 172 bp fragments under aerobic and anaerobic conditions

Aerobic (189 bp fragment) Anaerobic (189 bp fragment) Aerobic (172 bp fragment) Anaerobic (172 bp fragment)

Beta – galactosidase [Miller Units]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Beta - galactosidase activity in RM 101 with FNR and

189 bp and 172 bp fragments under aerobic and anaerobic conditions

Aerobic 189 bp fragment with FNR minus backbone vectors with FNR

Anaerobic 189 bp fragment med FNR minus backbone vectors with FNR

Aerobic 172 bp fragment med FNR minus backbone vectors with FNR

Anaerobic 172 bp fragment med FNR minus backbone vectors with FNR

Beta - galactosidase [Miller Units]

This was verified by comparing the expressions under both aerobic and anaerbic conditions between the 172 bp construct and the expression mediated by the reportervector alone. The results also showed that RM 101 containing the FNR-gene from Ideonella dechloratans but not any of the constructs was able to survive under anaerobic conditions duringNaNO3 respiration.

Conclusion

Regarding the -10 element, it has been shown that it is important for full expression and without it there is no expression, under both aerobic and anerobic condition. The conclusion that this is the one and only promoter from whom which both aerobic and anaerobic transcription is initiated at is drawn. Another colusion is that the possible FNR-gene in Ideonella dechloratans encodes such a protein with the ability to induce the expression of the chlorite dismutase gene and also has the abillity to replace Escherichia coli 's FNR under anaerobic respiration with NaNO3.

Förkortningar

PRB Perkloratreducerande bakterier CRB Kloratreducerande bakterier

FNR fumarate and nitrate reduction regulatory protein PCR Polymerase chain reaction

MCS Multiple cloning site

Ö. N Över natt

bp Baspar

SD Site Directed

ONPG o-nitrofenyl-b -D-galaktosid

sRNAP Sigma factor bundet RNA polymeras

TAE Tris-Acetat-EDTA Buffert

TBE Tris-Borat-EDTA Buffert

Cld Kloritdismutas

Clr Kloratreduktas

LB Luria Bertani Broth

OD Optisk densitet

nt Nukleotider

Introduktion

Problemformulering

I dag hanterar många industriella processer ämnen som potentiellt kan vara skadligt för vår miljö, sådana ämnen är perklorat ClO4- och klorat ClO3-. De är båda inerta och stabila nog att under flera decennier kvarstå i naturen. Eftersom de är hälsoskadliga för både djur och växter vill man finna ett sätt att ofarliggöra dem. Bakterier som kan livnära sig på klorat och perklorat via anaerob

respiration finns i naturen, främst på platser där dessa ämnen förkommer naturligt. Dessa bakterier anses kunna vara en potentiell lösning till problemet med den ökande mängden klorat och perklorat i naturen som resultat av användning i industriella processer. För rening av förorenade områden behöver man veta hur regleringen av generna för de enzymer som deltar i nedbrytningen perklorat och klorat fungerar eftersom de endast aktiveras under anaeroba förhållanden och den kunskapen finns inte idag. Ideonella dechloratans är en kloratreducerande bakterie som med gener för enzymerna kloratreduktas och kloritdismutas kan bryta ner klorat till de ofarliga produkterna kloridjoner och syrgas. Det som hitintills är känt om bakterien är att genuttrycken ökar under anaeroba förhållanden. På sekvensen uppströms kloritdismutas-genen (cld) har ett

transkriptionsstart identifierats och en sekvens med stor likhet till en känd bindningssekvens för transkriptionsfaktorn FNR. Det är ett protein som tillåter anpassning av bakterier till syrefattiga miljöer genom på transkriptionsnivå nedreglera enzymer som är nödvändiga för aerob respiration och uppreglera uttrycket av enzymer som är viktiga för anaerob respiration. Detta sker genom att transkriptionsfaktorn binder in till en specifik DNA sekvens som ligger inom en promotorregion uppströms genen ifråga och därmed underlättar eller undertrycker transkription. Det finns två typer av promotorer som regleras utav FNR, dessa typer delas in klass I och II promotorer beroende på FNR-sätets position i förhållande till transkriptionsstart. En klass II promotor har ett

transkriptionsstart (TSS) centrerat 41,5 nt nedströms FNR-sätet och klass I promotorer har ett TSS längre nedströms. Detta arbete delas upp i två delar, del I och del II som kretsar kring huruvida FNR reglerar uttrycket utav cld.

Syfte

Syftet med arbetet var identifiera om cld uppreglerades utav FNR under anaeroba förhållanden och därmed om det möjligen fanns en klass II FNR-beroende promotor placerad 41,5 nt nedströms det möjliga FNR-sätet. Utöver det tog jag reda på för om en gen i I. decloratans som antogs koda för ett funktionellt FNR-protein gjorde det och om det kunde binda in till FNR-sätet och inducera uttrycket av cld.

Klorat och perklorat: Egenskaper och miljöproblem

I dagens samhälle beror vår vardag till stor del av industriella processer som genom produktion av viktiga varor och tjänster underlättar livet. För att dessa viktiga uppgifter ska kunna utföras krävs ibland hantering av ämnen som potentiellt kan vara skadligt för djur och natur. Dessa ämnen efterlämnas ofta i processen, eller bildas som biprodukter och kontaminerar olika delar av naturen.

Därför är det ett globalt mål att finna praktiska lösningar på dessa problem. Exempel på förorenande processer är sådana som använder sig av och släpper ut oxyanjonerna perklorat ClO4- och klorat ClO3-. Klorat förekommer ofta inom pappersindustrin där klorat främst används i tillverkning av klordioxid som sedan används för blekning av produkter, man får också tillbaka klorat då det återbildas efter blekningsprocessen. Det används också som delignifieringsmedel inom massa och pappersindustrin och inom jordbruk som herbicider och avlövningsmedel [3,4,17]. Perklorat kan också förekomma ifrån antropogen aktivitet, dvs i processer som utförs utav människor, ett exempel är tillverkning av ammoniumperkloratsalter som främst används i oxidationsmedel för fast

raketbränsle, pyroteknik [5, 17, 18], bomber, färgproduktion, batterier och smörjmedel [5]. Det återfinns också i produkter som ammunition, missilbränsle och gödningsprodukter [18]. Dessa ämnen är starkt inerta och vattenlösliga och eftersom de inte adsorberas på partiklar så som jord och sediment är de extremt mobila och tåliga. Konsekvensen blir att de lätt följer med ut i naturen, kan spridas långt ifrån ursprungskällan och ansamlas på platser som i jord och vattenkällor under flera decennier [17, 18].

Det har visat sig att perklorat kan ge upphov till dysfunktionalitet av hormonproduktionen i sköldkörteln genom att binda till natrium-jod symportern i sköldkörteln och inhibera upptaget av jod. Det leder till endokrina sjukdomar och kan ge upphov till tillväxt- och utvecklingsproblem, framförallt hos foster och spädbarn [2, 10, 16, 18]. Klorat är framförallt giftigt för många typer av vattenväxter, där vissa typer av brunalger drabbas hårdast [1, 4, 17]. Det kan förklaras genom att klorat ClO3- är strukturellt likt nitrat NO3- och kompetetivt inhiberar enzymet nitratreduktas som finns i dessa vattenväxter. Man tror också att eftersom enzymet har svårt att skilja mellan nitrat och klorat kan det ibland förekomma en förväxling mellan dem som resulterar i att enzymet istället reducerar klorat till klorit eller hypoklorit som är två extremt reaktiva ämnen. Effekten av detta blir att det nitratreducerande systemet stängs av [3, 17]. Eftersom både perklorat och klorat har visat sig vara giftiga och därmed klassificerats som hälsoskadliga för både människor och djur försöker man nu hitta en lösning som oskadliggör dem.

Dessa ämnen förkommer också i naturen på platser som inte påverkats av människan. Perklorat och klorat finns världen över och hittas på torra platser såsom i öknar och i förhistoriska

vattenansamlingar [1, 5, 16]. Den största kända ackumuleringen av naturligt perklorat finns i nitratrika områden i Chiles Atacama öken, men har också funnits Death Valley och Mission Valley Eocene deposits i Kalifornien, Potash deposits of Saskatchewan i Kanada och förhistoriska

vattenansamlingar i Texas och New Mexiko [5]. Naturliga förekomster av klorat har upptäckts först på senare tid och förekommer på liknande platser. Den naturliga produktionen av dessa ämnen är inte helt förstådd. Många system föreslås som t. ex. fotokemiskt i atmosfären, på kloridbelagda mineralytor, som slutprodukt av fotokemiska reaktioner av klorprekursorer som hypoklorit, klorit och klorat under ultraviolett strålning eller genom ozonoxidation av kloridjoner i dessa torra regioner och vattenansamlingar [5]. Senare forskning styrker hypotesen om en global och kontinuerlig produktion av perklorat och klorat i jordens atmosfär [1, 5, 11].

Man har hittat mikroorganismer som kan livnära sig på klorat och perklorat genom anaerob respiration spridda på många ställen i naturen men de första stammarna man isolerade var ifrån kontaminerade vatten, industriområden mm. Dessa mikroorganismer anses vara en potentiell lösning för de industriella processer som hanterar klorat och perklorat.

Där är tanken att mikroorganismerna skulle kunna reducera bort klorat och perklorat i utflödet och därmed stoppa fortsatt kontaminering av miljön. Mikroorganismerna som kan livnära sig på dessa ämnen är fakultativa anaerober, det betyder att de lever under aeroba förhållanden men har

förmågan att utnyttja anaeroba respiration i frånvaro av syre. För att då få mikroorganismerna att reducera dessa ämnen måste de först gå över till anaerob respiration. Det medför att allt syre i miljön runt omkring t. ex. i utflödet måste avlägsnas, någonting som kostar mycket pengar och är opraktiskt. Därför studeras nu genregleringen som leder till den anaeroba respirationen på

molekylär nivå i hopp om att förstå hur den fungerar. Målet är att det med tillräcklig kunskap ska vara möjligt att styra över vilken respiration som inleds och inte behöva anpassa miljön runt omkring.

Enzymer för kloratmetabolism

Det finns två typer av bakterier med förmågan att reducera dessa ämnen, perkloratreducerande bakterier (PRB) och kloratreducerande bakterier (CRB). Bakterier tillhörande (PRB) kan reducera båda perklorat och klorat medans (CRB) kan reducera klorat men inte perklorat [4, 11, 17].

Enzymerna som står för den anaeroba respirationen av klorat och perklorat är perkloratreduktas (Pcr) som reducerar perklorat till klorit via klorat. Det finns enbart hos perkloratreducerande bakterier. Kloratreduktas (Clr) reducerar klorat till klorit men har inte förmågan att reducera perklorat och finns i kloratreducerande bakterier. Kloritdismutas (Cld) är gemensamt för båda bakterietyperna och omvandlar klorit till syre och kloridjoner [4,10]. Reaktionsvägen för nedbrytning av perklorat och klorat visas i Figur 1.

(PRB) (PRB)/(CRB) (PRB)/(CRB)

2e^- 2e^-

ClO4- ---> ClO3- ---> ClO2- ---> Cl^- + O2 Pcr Pcr/Clr Cld

Figur 1. Visar reaktionsvägen för reduktionen av klorat och perklorat.

Transkription och promotor regioner i prokaryoter

Vägen ifrån en gen till ett funktionellt protein är kräver två processer, transkription och translation.

Transkription är då en gen avskrivs som en kopia i form av ett ”meddelar RNA” (mRNA). Enzymet som initierar och utför transkriptionen är RNA polymeras. Därefter kommer translation där

ribosomer binder in till mRNA:t och avläser den information som genen kodar och syntetiserar det korresponderande proteinet. Transkriptionen skiljer sig i detalj men är i huvuddragen samma mellan olika celltyper såsom djurceller och bakterieceller. För att transkription i bakterier ska kunna inledas behöver RNA polymeraset associera sig med en faktor, ett protein som leder polymeraset till en region strax uppströms genen. Detta område kallas för en promotor och sträcker sig mellan -60bp till + 20bp relativt till transkriptionsstart som utgör +1 positionen [12, 13]. Varje promotor har karakteristiska drag som bestämmer hur hög affiniteten mellan RNA polymeraset och DNA

sekvensen är. En del drag är samma för alla promotorer medans andra beror på vilken faktor som är bundet till RNA polymeraset. Ett tydligt mönster för bakteriella promotorer är att det innehåller en lägre halt av nukleotiderna G och C i förhållande till det genomiska medelvärdet. Istället är nukleotiderna A och T mer frekventa som har en lägre stabilitet och smälttemperatur [25]. Detta uppkommer p.g.a. DNA är dubbelsträngat och består utav två komplementära enkelsträngade molekyler som sammanfogas genom vätebindningar och måste separeras för att RNA polymeraset ska kunna inleda transkription där en utav strängarna används som mall. Det finns också två viktiga regioner positionerade ca -10 och -35 nt uppströms relativt till transkriptionsstart och kan

identifieras av faktorn som binder RNA polymeraset dit. Utan faktorn bundet besitter

fortfarande RNA polymeraset den katalytiska förmågan men kan inte identifiera promotorn [12]. De två -10 och -35 elementen identifierar också själva promotorn och finns i alla bakterier. De består av karakteristiska sekvenser som faktorerna känner igen och är specifika beroende på vilken

faktor som är bundet till RNA polymeraset. Sekvenserna skiljer sig också mellan bakterier där en ideél karakteristisk sekvensen i en bakterie inte är det i en annan.

En av de mest förekommande bakteriella faktorerna är de som tillhör ^ – familjen och de flesta gener transkriberas med dem , 8]. Andra faktorer förekommer också och uttrycker specifika gener under normala eller mer stressrelaterade förhållanden. Konsensus-sekvenserna består av sex nukleotider var och är för ^faktorn TATAAT vid -10 regionen och TTGACA vid -35 regionen för Escherichia coli (Figur 2). Det är väldigt sällan konsensus sekvenserna är helt konserverade i en promotor utan en kvot på 8/12 matchande nukleotider förekommer för en typisk promotor men är sällan lägre än en kvot på 6/12 [8, 9]. Det har även visat sig att regionerna är olika viktiga för promotoraktiviteten där -10 regionen har en större betydelse eftersom den oftare är mer konserverad än -35 regionen och därför kan kompensera för en mindre välbevarad sådan. De olika nukleotiderna i konsensus-sekvensen har också olika stor betydelse för promotoraktiviteten och man har visat att vissa av dem förekommer oftare än andra på specifika positioner inom elementen, speciellt när de är mindre konserverade [9, 24]. I -10 hexameren är nukleotiderna -7T, -11A och ibland -12T mest konserverade, vilket indikerar att de har en större betydelse än resterande nukleotiderna i -10 sekvensen. Positionerna inom – 10 elementet numreras från nukleotiden närmast TSS som -7 till -12 som är nukleotiden längst ifrån TSS enligt: -12T-11A-10T-9A-8A-7T---TSS. I de initiala stegen för initiering av transkription och därmed separation av de dubbelbundna DNA strängarna flippas baserna -11 A och -7T ut ur stackning konformationen i DNA-helixen och associerar med

RNA polymeraset som bär på specifika fickor för dessa två baser [24]. Undersökningar om hur smältningskinetiken beror av förändringar i -10 sekvenserna visar att A vid -11 och T vid -7 positionen har betydelse för snabb smältning av promotorn. Det är -11A som främst är viktig för snabb smältning medans -7T som är den mest konserverade nukleotiden är viktig för initiering av transkriptionsprocessen i sig själv [24]. -10 elementet kan ibland förekomma som en förlängd version ”extended -10 region” på promotorer, oftast då -10 och -35 regionerna är mindre

välbevarade eller då de inte finns något -35 element alls [9, 12]. Regionen som utgör ”extended”

delen utav -10 elementet är att det en nukleotid uppströms hexameren sitter ett TG baspar.

Konsensus-sekvensen lyder då TGNTATAAT där N är någon nukleotid A,T,C, eller G (Figur 2). En mutation på TG determinanten sänker i dessa avseenden aktiviteten drastiskt och därför andningen till att den anses kompensera för mindre välbevarade -10 och -35 element. Positionen mellan -10 och -35 regionerna och mellan -10 regionen och transkriptionsstart har också påvisats ha betydelse för promotoraktiviteten. Ett vanligt förekommande avstånd på 16-18 nukleotider mellan -10 och -35 regionen där 17 nukleotider är oftast förekommande och därmed anses vara det mest optimala avståndet [12, 24] (Figur 2). Mellan transkriptionsstart och -10 regionen varierar avståndet oftast mellan 2-11 nt [7] (Figur 2) där 7 nt är mest förekommande och har visats vara optimal för

promotoraktiviteten. Promotorsekvensen uppströms -35 elementet som sträcker sig mellan ca -40 till -60 kallas ”Upstream Element” (UP-Element) som ytterligare ökar promotoraktiviteten [12].

Den består främst av A och T nukleotider och innehåller två säten som kan identifieras av ett RNA polymeraset. Sätena har ingen specifik sekvens utan en preferens för en ökad mängd A och T vid dessa områden är en viktig egenskap för identifiering [13].

Figur 2. Visar den typiska arkitekturen för en bakteriell promotor och konsensus-sekvenserna för ^faktorn hos E.coli [19].

Möjliga promotorer för cld-genen i I. dechloratans och FNR-reglering

I. dechloratans är en mikroorganism som tillhör kloratreducerande bakterier, den har gener för Clr och Cld och kan därmed utöva klorat metabolism (Figur 3). I den här bakterien har man studerat regleringen av dessa gener där man genom att mäta mRNA-nivåer har funnit att transkriptionen är högre under anaeroba odlingsförhållanden jämfört med aeroba odlingsförhållanden [4, 11]. Under fortsatta studier på hur genregleringen utav cld fungerar har sekvensen uppströms genen undersökts för en möjlig promotorregion och möjliga inbindningssäten för transkriptionsfaktorer. Utav detta har man identifierat ett transkriptionsstart för cld lokaliserat 85 nukleotider uppströms den första nukleotiden i translation initieringskodonet [21] och även möjliga -10 och -35 element (Figur 3) [15]. Sekvenserna antogs utgöra dessa element efter att man observerat en stor och minskning och ibland total avskaffande utav uttrycket av cld när mutationer eller avkapning av elementen gjorts.

Dessa sekvenser skiljer sig mycket från konsensus-sekvensen i E. coli då bara 1 av 6 respektive 4 av 6 nukleotider överensstämmer med den. Det medför en osäkerhet i huruvida detta verkligen är en promotor [15]. Ett möjligt bindningssäte tillhörande proteinet (fumarate and nitrate reduction regulatory protein) FNR har också identifierats [20] och är centrerat 19,5 nt uppströms transkriptionsstart och kan tydligt observeras överlappa med – 10 elementet (Figur 3).

Figur 3. Visar var en möjlig promotor skulle kunna vara belägen för cld i I. dechloratans. De lätt understrukna

nukleotiderna i -10 och -35 elementen stämmer överens med konsensus-sekvenserna i E.coli. Den grövre understrukna sekvensen är ett möjligt FNR-säte position [15]. Ett insertionselement ISIde1, genen för kloratreduktas (clrA-D) och cld-genen visas i pilarna, där pilarnas riktning visar organiseringen av sekvenserna och transkriptionsrikitningen för clrA-D och cld.

FNR är ett av de vanligaste förekommande regleringsproteinen som kontrollerar övergången mellan aerob och anaerob metabolism hos bakterier via reglering på transkriptionsnivå [6, 14, 23].

Proteinet finns i cellens cytoplasma och fungerar som en O2 sensor. Då syre finns tillgängligt inaktiveras proteinet och i frånvaro utav syre aktiveras det. Ett E.coli FNR i aktiv form har ett [4Fe–

4S]²⁺ kluster per monomer som sitter bundet till fyra cystein [23]. Det förmedlar nödvändig konformationsförändring som tillåter dimerisering av monomererna. Den formen av proteinet har förmågan att sekvensspecifikt binda in till DNA och därmed reglera uttrycket [6, 14, 23]. Det är också klusteret som är känsligt för O2 och under aeroba förhållanden konverteras det till ett [2Fe–

2S]²⁺ kluster vilket medför att dimererna separeras till enskilda monomerer och därmed proteinets inte längre kan binda in till DNA sekvensen och reglera uttrycket [23].

Konsensus-sekvensen för ett E.coli FNR är TTGATNNNNATCAA och det möjliga FNR-sätet som identifierats uppströms cld-genen i I. dechloratans stämmer överens till 9 av 10 nukleotider ett sådant. Precis som för promotorregionerna -10 och -35 behöver inte FNR sekvensen vara identisk till konsensus-sekvensen för ett FNR-säte ett FNR komplex ska kunna identifiera det och binda in dit. Det finns också vissa baser som är mer eller mindre konserverade och som anses vara mer viktiga för identifiering av sätet (Figur 4).

Figur 4. Visar en positionsmatris av de förekommande baserna i FNR-sätet hos E.coli där höjden av baserna visar

konservationsgraden vid respektive position, dvs de mest frekventa nukleotiderna som allmänt observeras på dessa positioner.

Informationen kommer ifrån artikel [6].

Vart det är lokaliserat någonstans på promotorn bestämmer om FNR har en positiv eller negativ inverkan på transkription. I de fall där FNR har en undertryckande roll på transkription kan sätet vara placerat från -35 regionen till transkriptionsstart. För en aktiverande roll i en promotor är centrum för FNR-sätet 41,5 nukleotider uppströms transkriptionsstart och överlappar med någon nukleotid -35 regionen, dessa promotorer är kända som klass II promotorer [6, 14]. En centrering på 60,5, 71,5, 72,5, 74,5, 82,5 eller 92,5 nt från transkriptionsstart förekommer för klass I promotorer, de är betydligt mer sällsynta [6, 15]. Ett inbundet FNR komplex med en aktiverande roll tar binder till RNA polymeraset när de båda bundit till DNA:t. Det förstärker bindningen mellan RNA polymeraset och promotorn vilket leder till att transkriptionen av den specifika genen ökar. Tidigare resultat där man arbetat med ett 200 bp långt fragment innehållande den möjliga promotor regionen och muterat det möjliga FNR-sätet visar det att både basal uttrycket av cld under aeroba

förhållanden såsom det anaeroba nästan totalt slås ut [15]. När man i ett annat försök istället bevarade det möjliga FNR-sätet men placerade 200 bp fragmentet i en bakteriestam, RM 101 som saknar förmågan att producera FNR visade mätningarna ändå ett basalt uttryck [15]. Detta gav upphov till en hypotes som tillsammans med FNR-sätets position i förhållande till det tidigare bestämda TSS som vanligtvis associeras med en undertryckande roll av gener, bör finnas en FNR- beroende promotor längre nedströms som står för den anaeroba induktionen. För att undersöka hypotesen utförde jag i det här arbetet gjorde en teoretisk analys av sekvensen uppströms cld i förhållande till FNR pallindromet med ovanstående kunskap som verktyg. Det resulterade i att ett nytt transkriptionsstart och nya -10 och -35 element längre lokaliserades (Figur 5). Analysen gjordes genom att räkna 41.5 nt nedströms ifrån FNR-sätet centrum där typ II promotorer har sitt

transkirptionsstart. Ett A lokaliserades på den positionen. Därifrån stegades det sju nukleotider uppströms som gav upphov till ett möjligt -10 element som också innehöll determinanten TG en

nukleotid uppströms -10 hexameren vilket tillsammans formar ett möjligt ”extended – 10 element”.

Genom att till sist mäta vandra ett avstånd på sjutton nukleotider uppströms den första nukleotiden -10 hexameren identifierades ett möjligt – 35 element, överlappande med FNR-sätet, precis som konstaterats för en aktiverande roll av FNR.

Figur 5. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn för cld i I. dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en klass II promotor som allmänt har TSS 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet. Det optimala avståndet på sju nukleotider uppströms TSS gav ett möjligt extended -10 element markerat I fet stil med understrukna nukleotider som överensstämmer med E.coli

konsensus-sekvens TATAAT. -35 elementet bestämdes sjutton nukleotider uppströms första nukleotiden i -10 hexameren, elementet är markerat med fet stil och överensstämmande nukleotider understrukna.

Metodiker

Genom att använda en sekvensamplifieringsteknik kunde den möjliga promotor regionen till cld ifrån I. dechloratans DNA isoleras och amplifieras, tekniken kallas Polymerase Chain Reaction eller PCR. Metoden kräver att man känner till sekvensen som ska amplifieras för att kunna syntetisera två primrar som är komplementära till en del av ett område som sträcker sig över den önskade sekvensen som ska amplifieras. Komponenterna som ingår i reaktion är primrar, polymeras enzym, nukleotider, MgCl och templat DNA. Processen sammanfattas i tre olika steg, denaturering, annealing och extension. Dessa steg utförs flera gånger och under specifika temperaturer. Under denatueringssteget höjs temperaturen till 90 °C som separerar DNA strängarna ifrån varandra som gör sekvensen som önskas amplifieras tillgänglig. I annealingssteget sänks temperatuern till mellan 50-60 °C som medför att hybridisering av de två primrarna till det komplementära området i DNA:t som sträcker sig över målsekvensen. Därefter i extensionsteget höjs temepraturen till 74°C som tillåter polymeraset att vid optimal hastighet amplifiera den önskade sekvensen. Eftersom processen upprepas många gånger amplifieras sekvensen till ett stort antal kopior. Temperatur, tid och antal cykler för processerna skiljer sig från system till system.

För att mäta om fragmenten av den möjliga FNR-beroende promotorn kunde ge upphov till transkription och därmed uttryck hade de ligerats in framför en promotorlös gen som kodar för enzymet galaktosidas i plasmiderna pBBR1MCS-4-LacZ och pBBR1MCS-2-LacZ. Det görs genom att klyva upp plasmiden som är en cirkulär DNA sekvens så att den blir linjär och efter det sammanfoga den amplifierade promotorsekvensen med den linjära plasmiden och återförsluta igen.

Restriktionsenzymer används då som identifierar en specifik DNA sekvens som benämns ett

restriktionssäte bestående av ett par nukleotider och klyver av DNA:t där. Plasmiden är konstruerad att innehålla ett flertal sådana sekvenser för olika restriktionsenzymer. Genom att vid

primerdesignen addera restriktionssäten på primrarna som också finns i plasmiden får produkterna från amplifieringen av promotorsekvensen dessa restriktionssäten som gör det möjligt att klyva plasmid och promtorsekvens med samma restriktionsenzym. Det medför att plasmiden och promotorsekvensen får komplementära ändar och kan binda till varandra via vätebindningar.

Eftersom enkelsträngarna i en DNA molekyl sitter ihop kovalent med fosfodiesterbindningar måste ett DNA-ligas enzym också tillsättas att slutföra sammanfogningen. Detta steget kallas ligering och innebär att ligaset syntetiserar nya fofsofdiesterbindningar. Under ligeringen i det här fallet

återförsluts DNA:t i cirkulär form, nu innehållande den möjliga promotorsekvensen framför

galaktosidas-genen.

Därefter är det dags att transformera celler med plasmiden innehållande den möjliga

promotorsekvensen. Transformering är en metod som tillåter introduktion av en DNA molekyl in i en cell. Två metoder användes i det här arbetet för att introducera plasmider med inligerade fragment av den möjliga FNR-beroende promotorn i celler. Den ena metoden var att arbeta med superkompetenta celler, något som beställs ifrån ett företag och transformeras väldigt lätt genom att följa ett protokoll. Den andra metoden var mer traditionell och kallas elektroporereing. Det är en teknik där cellerna först genomgår ett antal tvättar som gör dem elektrokompetenta och därefter utsätts dem för en kort elektrisk puls. Teorin bakom pulsningen hävdar att porer bildas i

cellmembranet som tillåter transport av DNA in i cellen. Processen består utav uppodling av celler som sedan tvättas i en mängd centrifugeringsprocessen för att avlägsna salter som annars kan leda till kortslutning under pulsningen. Cellerna blandas i nästa steg med en godtycklig mängd DNA och pulsas vilket leder till upptag av DNA ifrån omgivningen. Parameterarna som ställs in under

pulsningen är fältstyrka, motstånd och kapacitans, som beror olika faktorer som t. ex. vilken typ av celler man arbetar med.

Cellerna innehållande plasmiden med inligerad promotorregion odlas upp under aeroba och anaeroba förhållanden. Odlingen görs i ett lämpligt odlingsmedium med ett antibiotika som en selektivitetskontroll för att säkerställa att cellerna innehöll plasmiden eftersom den medför någon typ av antibiotikaresistens till bakterien. De skördas sedan under exponentiell fas och sedan tillsätts toluen som permeabiliserar cellerna och därefter ett substrat som - galaktosidas konverterar till en mätbar produkt. Naturligt hydrolyserar - galaktosidas galaktosider till monosakarider men används också för biokemiska mätningar. Substratet är o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG), som diffunderar in i cellen via proerna som bildats och katalyseras i närvaro av - galaktosidas.

Substratet är ifrån början är färglöst men bildar en färgad produkt. Produkterna som bildas är galaktos, och den färgade produkten o-nitrophenol som är gul [22]. Mängden o-nitrophenol som bildas mätas via absorbans vid 420 nm och är, om ONPG är tillsatt i överflöd proportionell mot mängden galaktosidas och reaktionstiden för hydrolyseringsreaktionen [22]. galaktosidas aktiviteten beräknas med formeln:

Beta−galaktosidas aktivitet=1000 xOD₄₂₀−1,75 OD₅₅₀ t v OD600

Där t är reaktionstiden i [min], v är volymen cellkultur [ml], OD600 är ett mått på celldensiteten innan assayen, OD420 absorbansen vid 420 nm av o-nitrophenol [-], 1,75 OD550 en korrektionsfaktor för ljusspridningen ifrån cellskräp vid 550 nm [-].

Uppnådda resultat

Efter försöken med 189 bp och 172 bp fragmentet under aerob och anaeroba förhållanden i XL1- BLUE visade resultaten att 189 bp fragmentet, innehållande den möjliga – 10 regionen gav ett uttryck aerobt och ett större inducerat uttryck anaerobt. Den anaerob induktionen för 189 bp

fragmentet bestämdes till 3,3 ggr basaluttrycket. Fragmentet med 172 bp sekvensen där möjliga -10 regionen avlägsnat gav under båda förhållanden ett uttryck nära noll och därmed inte heller någon induktion. Det jämfördes också mot uttrycket förmedlat av bakgrundsplasmiden under samma förhållanden där resultatet visade att det inte var någon skillnad mellan uttrycken. Dessa försök upprepades i RM 101 som påvisade samma sak för 189 bp fragmentet och att I. dechloratans FNR var kapabel till att inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Induktionen bestämdes till 2,8 ggr balsaluttrycket. Förutom det påvisades det också att celler med I. dechloratans FNR överlever under anaeroba förhållanden med NaNO3 respiration.

Viktigaste slutsatserna

Efter att jag utgått ifrån hypotesen om att cld-genen regleras utav en FNR-beroende klass II promotor identifierades ett möjligt – 10 element. Resultaten visade att elementet behövdes för en anaerob uppreglering vilket stärker hypotesen. När elementet avlägsnades minskade uttrycken både under aeroba och anaeroba förhållanden till noll. Slutsatsen blev att transkription utav cld med stor sannolikhet startar ifrån samma promotor, som både utgör uttryck vid aeroba och anaeroba

förhållanden. Den tidigare hypotesen om två skilda promotorer, en som står för basaluttrycket under aeroba förhållanden och en FNR-beroende som står för ett inducerat uttryck under anaeroba

förhållanden förkastas. Den andra viktiga slutsatsen är att I. dechloratans kodar för ett FNR-protein med förmågan att inducera uttrycket av cld under anaeroba förhållanden. Det har också förmågan att ersätta ett E.coli FNR under anaeroba förhållanden med NaNO3 respiration.