2.1 Tensider och fosfolipider
Både gallsalter natrium cholat (NaC) och natriumdeoxcykolat (NaDC) samt natriumklorid (NaCl) med mer än 99,0% erhölls från Sigma-Aldrich och renades inte ytterligare. Fosfolipiden, DMPG (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-glycerol] natriumsalt) inköptes från Lipoid GmbH i det fysiska tillståndet av pulver och används utan ytterligare rening. Den kemiska 2D-struktur skildringen för DMPG, NaC och NaDC ses i figurer nedan såväl som arrangemanget av polära huvudgrupper och icke-polära ringar av NaC och NaDC.
Figur7.DMPG,1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol, natriumsalt, molekylvikt:688,85 g mol-1
Figur 8. Natriumkolat (NaC), Mw: 430 g mol-1 Figur 9.Natriumdeoxikolat (NaDC), Mw: 414,55 g mol-1
2.2 Beredning av blandad micellösningar
Lösningar bestående av NaC, NaDC och DMPG framställdes med olika molförhållanden R = ([DMPG]) / ([DMPG] + [NaC]) och R = ([DMPG]) / ([DMPG] + [NaDC]) varierande från 0,10 till 0,95 med en total koncentration på 80 mM. Från dessa intervallet valdes molförhållandet 0,80, 0,85, 0,90 och 0,95 av DMPG. Fem prover av varje molförhållande gjordes med olika totalkoncentrationer: 80, 60, 40, 20 och 10 mM. Prover med olika fosfolipidkoncentrationer utarbetades genom spädning av det mer koncentrerade provet (80 mM, utspädd till 60, 40, 20 och 10 mM). Alla lösningar bereddes i 154 mM NaCl-buffert och stördes i minst 2–7 dagar för att minimera risken för att systemet inte nådde jämvikt innan experiment utfördes.
2.3 Ljusspridningsmätningar
SLS- och DLS-mätningarna gjordes med ett ALV / CGS-3 kompakt goniometersystem utrustad med en ALV-5004-korrelator och en Cobolt Samba 50-laser som ljuskälla (532 nm).
Temperatur i brytningsindex som matchar toluenbadet upprätthölls vid 21 och 37 °C. Mätningar gjordes i vinkelområdet 35° till 145° med ackumuleringstider på 30 s. 1 ml av varje prov filtrerades genom en steril och icke-pyrogen 5,0 µm polyetersulfonmembran och sedan placerades i en cylindrisk högpresterande kvartsglaskuvett. Kyvetten är nedsänkt i toluen vilket har ett liknande brytningsindex som kvartsglaskyvetten. Innan mätningar skall instrumentet kalibreras vilket görs genom att prover bestående av ren toluen och buffert användes. På grund av buffertens höga känslighet filtrerades den genom en steril och icke-pyrogen 0,22 µm polyetersulfonmembran. Det bör noteras att före mätningens början och även efter slutet av varje mätning av varje prov, placerades kyvetten först i Hellmanex -rengörnigslösning i minst 15 minuter och sedan sköljdes kyvetten med helt sterilt vatten och torkades. Kyvetten måste vara helt torr och ren innan det nya provet hälls i den. Det spridda ljuset detekterades i ett intervallområde mellan 35–145 grader med ett vinkelsteg på 5 grader och varje vinkel mättes tre gånger vid 10 sekunder. Alla proverna filtrerades innan ljusspridningsmätningar. De grumliga samt för grumliga prover, vilka som inte lämpade för ljusspridningsmätningar. För analys av SLS-data användes programmet ALV-Stat 4.51. Efter justering av både temperatur och viskositet i dataprogrammet, bestämdes Mw och RG för varje enskilt prov. dn/dc värdet beräknades också separat för varje enskilt prov.
Med Dapp-värdet känt kunde den hydrodynamiska radien RH extraheras med hjälp av Stokes-Einstein-ekvationen (ekvation 1).
2.4 Beräkningar av blandningsförhållanden
Förhållandet mellan NaC och DMPG också NaDC och DMPG i micellaggregaterna skiljer sig beroende på mängden av varje förening inuti systemet därför varje prov kommer att ha sitt eget dn/dc-värde. För att beräkna dessa blandningsförhållandet X för micellerna och beräkningar av dn/dc för varje prov användes datorprogrammet MATLAB R2020a. Funktionen bygger på Poisson-Boltzmann-teori och används cmc-värdet för Nac, NaDC och DMPG i rent lösningsmedel för sina beräkningar. Cmc-värdet för DMPG var 0,011 mM, NaC cmc-värdet var 5,4 mM och till sist ett värde på 2 mM avändes som cmc för NaDC och allt detta värderna erhölls från tidigare forskningar/ studier. dn/dc av ren Nac och NaDC i vatten tillsammans med blandningsförhållandet kunde sedan användas för att få ett individuellt dn/dc-värde för varje blandat prov. dn/dc för NaC och NaDC bestämdes genom användning av refraktometer.
2.5 Bestämning av brytningsindexinkrement av NaC och NaDC
dn/dc för NaC och NaDC erhölls med användning av BRICE-PHOENIX model BP-2000 V, en differential refraktometer optisk typ. Ljus från kvicksilverlampa kommer att passera genom det monokromatiska filtret, transparenta spegeln och sliten och sedan in i cellhuset där provet är beläget. ljusstrålen inträffar normalt på cellytan för både positionen 0 och 180. Två cellavdelningar fylldes med en milliliter vardera av lösning och lösningsmedel och cirka 15 minuter väntades för att uppnå temperaturjämvikt. Med cellen i position 0 (lösning mot slits) bestämdes d1. För detta ändamål, bör den skarpaste slitsbilden väljas genom att försiktigt finjustera mikroskopet med hjälp av bildfokaljustering. Sedan flyttades hårkorset tills det var i ståndet som halverades slitsbilden och lästes nummer för den här inställningen från filarmikrometer trumma. Detta upprepades ungefär fem gånger, förskjuts hårkorset (mitt i korset) och finjusteras varje gång. Sedan vrids cellen i position 180 och d2 bestämdes på ett liknande sätt. Medelvärdet av de fem värdena beräknades för både d1 och d2 och användes medelvärdet i senare steg. dn/dc värden för både gallsalter, NaC och NaDC i två olika koncentrationer beräknades med användning av formeln som finns i bilaga. För detta ändamål valdes två koncentrationer, 10 och 80 mM. Prover framställdes i två olika lösningar, en i rent vatten och en i buffert. Efter bestämning av värdena för d1 och d2, kunde värdet på dn/dc beräknas för båda galltsalterna. dn/dc är känslig för temperatur, koncentration och en viss våglängd. Därför innan mätningen påbörjas skall det säkerställas att båda lösningarnas temperatur i den tvådelade kyvetten är samma. Den beskrivna differentiella refraktometern har fördelar med enkelhet, relativ frihet från svårigheter med temperaturkontroll, hög precision, känslighet och noggrannhet.