Självaggregering i blandningar av gallsalter. och fosfolipid undersöktes med statisk. och dynamisk ljusspridning vid 21 C och 37 C

Självaggregering i blandningar av gallsalter och fosfolipid undersöktes med statisk

och dynamisk ljusspridning vid 21 ̊ C och 37 ̊ C ---

Robabeh Kheirkhah Abkenar

Examensarbete i farmaceutisk fysikalisk kemi, 30 hp, höstterminen 2020

Handledare: Lars Magnus Bergström Examinator: Per Hansson

Institutionen för läkemedelskemi Farmaceutiska fakulteten

Uppsala universitet

Förkortningar (Lista över symboler):

DLS dynamiskt ljusspridning DDS drug delivery systems NaCl natriumklorid

NaC natrium cholat NaDC natriumdeocykolat

DMPG (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-glycerol] natriumsalt) DMPG anjonic lipid dimyristoyl fosfatidylglycerol

DMPC dimyristoyl fosfatidylkolin

DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phosphocholine]) RG radie av gyration

RH hydrodynamisk radie

RI brytningsindex (Refractiv index) SAXS liten vinkel röntgenspridning SLS statisk ljusspridning

η absolut viskositet NP nanopartikel LM läkemedel GS gallsalt

BB blod-hjärnbarriär (BB)

Abstract

Introduction: Phospholipids amphiphilic structure gives them special properties such as self- aggregation, emulsifying and wetting properties. Among the various structures resulting from the dissolution of phospholipids in water are the liposome, which acts as a drug carrier. They also act as surfactants for wetting by adsorbing on the crystal surface to increase the

hydrophilicity of hydrophobic drugs. Surfactants, such as bile salts, have been shown to have a good ability to solubilize and dissolve non-polar lipids. By mixing with bile salts,

phospholipids can easily dissolve and form mixed micelles. For the breakdown of fats in the gastrointestinal tract, mixed micelles formed from bile salts and phospholipid play an important role as well as in solubilizing water-insoluble drugs and other drug delivery applications.

Aim: Theaim of this project is to study mixtures of the bile salts sodium deoxycholate

(NaDC) and sodium cholate (NaC) with the anionic phospholipid DMPG and to determine the mole fraction (composition) in the aggregates at the transition from micelles to bicolts in bile salt / phospholipid mixtures. In addition, we want to determine the average size and structure of the colloidal particles formed in the solutions near the transition. The phospholipid DMPG has a charge and our results will be compared with previous corresponding studies where the zwitterionic phospholipid DMPC was investigated.

Methods: The structure and size of micelles and bilayers formed will be determined by Dynamic Light Scattering (DLS) and Static Light Scattering (SLS) and Determination of refractive index increment of NaC and NaDC. Complementary techniques such as surface tension, small angle X-ray scattering (SAXS) and cryo-TEM may be used.

Results and Discussion: This study was able to show that aggregates for systems with a molar ratio of 0.05 to 0.20 of both NaC and NaDC at 21 degrees (°C), have an approximate size range between 3 and 10 nm. At 21 ° C the concentration range studied for both NaC and NaDC shows that the particles are larger in size at lower concentrations. Also, increasing the molar ratio of both bile salts, NaC and NaDC in the samples leads to a reduction in the particle size of the system. At 37 °C the system shows a significant increase in the size of the particles for both the bile salts, NaC and NaDC in a size range between 10 and 400 nm.

However, at 37 ° C and for both NaC and NaDC in molar ratios of 0.05 and 0.10, the particle size increases with increasing sample concentration but in molar ratios of 0.15 and 0.20, the

particle size decreases with increasing sample concentration. At 21 ° C the light scattering experiments for the systems in NaDC and DMPC showed that the size of the micelles

decreased with increasing concentrations while the increasing molar ratio led to increased size corresponding to mixed systems of bile salts and DMPG but not at 37 ° C. This difference may be mainly due to the fact that DMPG is an anionic phospholipid that has a charge and the altered conical shape of the bile salts as well as spontaneous curvature at a higher

temperature. At 21 ° C the light scattering experiments for the systems in NaDC and DMPC showed that the size of the micelles decreased with increasing concentrations while the increasing molar ratio led to increased size corresponding to mixed systems of bile salts and DMPG but not at 37 ° C. This difference may be mainly due to the fact that DMPG is an anionic phospholipid that has a charge and the altered conical shape of the bile salts as well as spontaneous curvature at a higher temperature.

Conclusion:

At 37 °C for NaC and NaDC in molar ratios of 0.05 and 0.10 other cmc are obtained,

indicating the presence of large structures in the system. Where these large worm-like or rod- like structures are formed by micelles. Accurate prediction of what structures may be present in the system requires more detailed and more appropriate research methods which in turn also need more time to achieve the result. Due to the project's time constraints, it became impossible to use these methods. This difference may be mainly due to the fact that DMPG is an anionic phospholipid that has a charge. The bile salts' end conformation form as well as spontaneous curvature at higher temperatures.

Innehållsförteckning 1. Introduktion

1.1 Bakgrund 6

1.2 Självmonteringsbeteende för gallsalt och fosfolipider 7

1.3 Ljusspridning 10

1.3.1 Dynamisk ljusspridning 11

1.3.2 Statisk ljusspridning 12

1.4 Syfte med studien 14

2. Material och metod 2.1 Tensider och fosfolipid. 14

2.2 Beredning av blandad micellösningar. 15

2.3 Ljusspridningsmätningar 15

2.4 Beräkningar av blandningsförhållanden 16

2.5 Bestämning av ökning av brytningsindex för NaC och NaDC 17

3. Resultat och diskussion 3.1 Brytningsindexinkrement av NaC och NaDC 17

3.2 Ljusspridning 18

3.2.1 Dynamisk ljusspridning 19

3.2.2 Statisk ljusspridning 22

3.3 Felkällor 26

4. Slutsatser 26

5. Referenser 28

6. Bilaga I. Matlab-funktion för att bestämma blandningsförhållande 31

II. Bestämning av dn/dc värdet för NaC och NaDC 31

III. Tabeller och figurer 33

1. Introduktion

1.1 Bakgrund

Betydande framsteg inom läkemedelsutveckling har en avgörande roll för att kunna erbjuda en bättre behandling till människor som lider av olika sjukdomar, såsom cancer, diabetes mellitus, kranskärlssjukdom, kronisk smärta Alzheimers och Parkinsons sjukdom [1]. Utan tvekan är administreringssättet som är smärtfri och lätt att hantera det första idealiska valet och därför oral administrering är det vanligaste och enklaste sättet att medicinera läkemedel (LM). Även om vissa läkemedel, såsom proteiner, cancerframkallande ämnen, peptider och nukleinsyror inte administreras oralt måste administreras parenteralt på grund av sin stora storlek, korta halveringstid eller begränsade stabilitet [1]. Nackdelarna med parenteral administrering inkluderar smärta, ökad risk för biverkningar, högre kostnader för vården och patienten, behovet av specialutrustning, tid och expertis som krävs under administrering. Det inneboende problemet med oral administrering är att läkemedel effektivitet har en signifikant minskning genom / efter enzymatisk matsmältning i magen och först passerar metabolismen i levern vilket i sin tur resulterar dålig biotillgänglighet i tunntarmen [2].

Bland avgörande egenskaper i formulering av läkemedel, särskilt för orala läkemedel, kan nämnas vattenlöslighet och cellpermeabilitet samt snabb clearance och toxicitet [1,2].

Egenskaper som är direkt associerade med läkemedel oacceptabel terapeutisk biotillgänglighet [1]. Därför står tekniker som förbättrar läkemedlets begränsade vattenlöslighet och membranpermeabilitet i fokus av intresse för mycket forskning. Förbättring av den begränsade lösligheten i vatten kan ske genom att tillsätta lämpliga hjälpämnen som ytaktiva medel, hydrotropiska medel, polymer miceller, komplexbildande medel, lipidformuleringar och samlösningsmedel [1].

Befintliga strategier för att förbättra dålig membranpermeabilitet inkluderar följande:

strukturell modifiering av läkemedel molekylen, samtidigt användning av penetreringsförstärkare och läkemedel, såsom jonparningsmedel, fettsyror, gallsalter, salicylater som spelar roll för att underlätta passage genom cellmembranet.[4] Nanopartiklar kan fungera som läkemedelsbärarsystem [3] och deras fördelar, påverkar biofördelningen, vilket i sin tur resulterar i förändringar i toxicitet och biverkningar för samma läkemedel. Doxil, en PEGylerad liposomformulering, är ett typiskt exempel [1]. Formuleringens leveranssystem är ett effektivt sätt att leverera läkemedel som i princip kommer att förbättra läkemedlets effekt samt biotillgänglighet eller kan minska läkemedlets toxicitet.[1,3] Fosfolipidbaserade

läkemedelsleveranssystem (DDS) har nyligen fått stor betydelse på grund av fosfolipidernas utmärka biokompatibilitet och detta förväntas leda till en effektivare samt säkrare systematisk läkemedelsleverans.[5] Doxilc ®, Cleviprex ® och Valium ® är exempel på fosfolipidrelaterade formuleringar som har uppvisat förbättrande resultat.[5]

1.2 Självaggregerande beteende hos gallsalter och fosfolipider

Fosfolipidmolekyler uppvisar amfifila egenskaper och är de viktigaste komponenterna i cellmembran. [6] Figur (1) visar att fosfolipider innehåller ett litet hydrofilt huvud som vanligtvis består av en negativt laddad fosfatgrupp, en funktionell grupp som fäster vid fosfatet, en diglycerid som länkar med två alkylkedjor och en flexibel hydrofob del som innehåller två kolvätekedjor.[6,7] Skillnaden och mångfalden av fosfolipider beror på att de har olika huvudgrupper och alifatiska kedjor, de fosfolipider som har glycerol som alkoholstommen nämns glycerofosfolipider.[7] Variation i huvudgruppen leder till olika glycerofosfolipider, såsom fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS), fosfatidinsyra (PA), fosfatidylinositol (PI).[6] Glycerofosfolipider är de viktigaste fosfolipiderna i eukaryota celler.[7] Amfifila strukturen ger fosfolipiderna självaggregering, emulgerings- och vätningsegenskaper. [7] Idag fosfolipider från marina källor på grund av de hälsofördelar de ger har fångat ett storintresse av LM industri. Bland dem kan man nämna förbättring av immunfunktion och förebyggande av hjärtsjukdomar samt vissa cancerformer.[8]

Figur 1. Struktur av fosfolipid [29]

Med avseende på de amfifila egenskaperna hos fosfolipiderna, har de förmågan att aggregera antingen i sina kristallina tillstånd eller i polära lösningsmedel som vatten kan över CMC bilda olika ordnade molekylära strukturer.[8] Till exempel lamellära faser förhärskar vid höga lipidkoncentrationer i vatten medan i vattenlösningar normalt kommer de att bilda sfäriska eller ovala strukturer. Storleken och formen på den bildade aggregaten beror på faktorer såsom kemisk sammansättning, pH och temperatur.[7] Transformationer (omvandling) mellan aggregaterna antingen monoskikt- eller tvåskiktsmembrantopologier är intressant och viktigt ämne, eftersom de innebär grundprocesser till biologiska system till exempel vesikelbildning, membranrekonstitution, matsmältning eller läkemedelsavgivning.[9] Micelle-till- vesikelövergången är ett typiskt exempel på strukturell övergång.[9] Fasövergången sker vid Tc (Fasövergångstemperaturen för fosfolipider) och de faktorer som påverkar Tc är: arten av polära huvudgruppen, kolvätekedjornas längd, graden av mättnad av kolvätekedjorna och fosfolipidens renhet.[7]

Den andra gruppen av intressanta molekyler i den här studien är gallsyror. Gallsyrorna / Gallsalter (GS) är inblandade i olika biologiska funktioner såsom, emulgering av hydrofoba föreningar, signalering, metabolisk och inflammatorisk reglering och antibakteriell aktivitet.[13] GS tillhör en specifik grupp av bio-tensider som kan användas såsom solubiliseringsmedel för lipider, emulgeringsmedel och dispersionsmedel i kosmetika, läkemedel och kemikalier.[10] GS är styva, platta molekyler med svagt uppdelade hydrofoba och hydrofila ansikten. [8] GS omfattar två anslutande enheter, en styv steroidryggrad med en hydrofoba och ett hydrofilt ansikte som en flexibel alifatisk svans är bundet. Den steroidkärnan av gallsyror består av en fem-medlem ring och tre sex-medlem ringar.[11] Som det kan ses på bilden nedan den konvexa delen (β) har hydrofoba egenskaper med vinkelmetylgrupper. I den motsatta siden, det vill säga den konkava sidan (α), befinner två eller tre hydroxylgrupper och en aminogrupp som den kan i sin tur konjugeras med andra aminosyror.

Figur 2. a) Deoxicholsyra och b schematisk återgivning av den amfifila strukturen i ansiktet av gallsalter. Den konvexa sidan är hydrofoba och hydroxylgrupperna är orienterade till den konkava sidan.[32]

Figur 3. Kemisk struktur hos de två gallsalterna:( A) natriumcholat (NaC) och( B) natriumdeoxycholat (NaDC).

Under fysiologiska förhållanden (300 mOsmol, pH 7) är gallsalter negativt laddade. C)Strukturformel av natriumcholat som visar molekylens hydrofoba yta (indicerad i rött) och de hydrofila delarna (indicerade i blått).[33]

Gallsyror delas i två grupper, primära (cholsyra) och sekundära gallsyror (deoxycholsyra).

Primära gallsyror omvandlar till de sekundära gallsyrorna genom hydrolysen. [12] Miceller bildas efter upplösning av gallsalter i vatten och bildandet av vätebildningar som härrör från växelverkan mellan hydrofoba komponenter. Dessa miceller kan lösa upp låglösliga

molekyler, det är därför de används i stor utsträckning inom farmaceutiska beredningar.[10]

Gallsalter fungerar som permeabilitetsförstärkare, detta sker när gallsalter interagerar med fosfolipider i cellmembranet vilket att i sin tur leder till läkemedelsgenomträngning ökning genom olika biologiska membran. [10]

GS amfifila karaktären har två konsekvenser å ena sidan, deras yttersta yta visar affinitet för hydrofoba faser såsom oljor/ lipider och för det andra, de självaggregertas i lösningar och bildar miceller.[11] Därför ett system som består av gallsyra, lipid och vattenlösning kan innehålla olika strukturer (miceller, vesiklar, lamellära, stavliknande miceller maskliknande miceller och globulära) beroende på andelen av varje komponent i systemet (4). Vid låga koncentration av gallsalter primära miceller kommer att hålla samman av den hydrofoba interaktioner, medan när gallsalternas koncentration ökas bildandet av den sekundära stora miceller främjas via väte- bindning interaktioner.[13]

De strukturella optiska egenskaperna gör att de kan studeras med mikroskopi och spektroskopitekniker.3,9 Två spektroskopitekniker som kan användas effektivt i micellstudier är statisk ljusspridning (SLS) och dynamisk ljusspridning (DLS). [3,10]

Figur 4. Skalrepresentation av liposomer, niosomer och miceller.[30]

1.3 Ljusspridning

Ljusspridning är en väletablerad teknik för att undersöka partiklars beteende och fysikalisk- kemiska egenskaper i lösningar [14]. När en ljusstråle träffar ett ämne och

elektronsvängningarna i det ämnet plötsligt ökar, fungerar det ämnet i sig som en sekundär ljuskälla. Ljuset som sprids från sekundärkällan har samma våglängd som den infallande våglängden. Optiska konstanter, storlek, form och elektriska laddningen på det ljusspridande materialet är de avgörande faktorerna för intensiteten och spridningsvinkeln för det utsända ljuset.[15] Ljusspridning är vanligtvis uppdelad i två olika metoder, statisk ljusspridning (SLS) och dynamisk ljusspridning (DLS). I grund och botten används i ljusspridning monokromatiskt och icke-invasivt ljus vid både ljusspridning metoderna och olika resultat kommer dock att uppnås beroende på hur ljuset mäts dynamisk eller statisk. Utvärderingen av fluktuationer i ljusspridnings intensiteten i en mikrosekundstidsskala namnges gemensamt som dynamisk ljusspridning (DLS) medan utvärderingen av medelintensiteten av överskottspridning kallas för statisk ljusspridning (SLS) eller klassisk ljusspridning.

1.3.1 Dynamisk ljusspridning

I DLS härrör resultaten från den karakteristiska tiden för fluktuationerna i spridd ljusintensitet.

Genom att undersöka utspridda ljuset över tiden, kan man förutsäga deras geometriska struktur och deras rörelsetillstånd. [17]. Resultat som erhålls av denna teknik härrör från den karakteristiska tiden för fluktuationerna i spridd ljusintensitet. Partiklar i en lösning är ständigt i Brownsk rörelse vilken kan definieras som svängningarna av partiklarna i ett prov [19].

Browniska rörelsen storlek beror på partiklarnas storlek, lösningens viskositet och temperaturen. [20] I början är intensiteten mellan tidpunkterna korrelerad men denna korrelation kommer att minska över tiden på grund av partiklarnas Browniska-rörelse.

Intensitetsvariation av den sprida ljuset har omvänt förhållande med partiklar storlek eftersom små Makro Molekyler (MM) flyttar snabbt och stora MM flyttar långsamt [19].

Med hjälp av Stokes-Einstein ekvation (ekvation 1) kan storleksfördelningen av partiklarna i systemet utvinnas för att ekvationen visar att den hydrodynamiska radien RH är relaterad till partiklarnas diffusionskoefficient Dh (m²/s). kB är Boltzmann-konstanten (J/K= kg.m²/s².k), T är lösningens temperatur (K), RH är hydrodynamiska diameter (m) och η är mediumets viskositet (kg/m.s). När provet temperaturen och viskositeten är kända, då kommer Stokes- Einsteins ekvationen att kunna bestämma den hydrodynamiska radien samt storlek på partiklarna i mediet. [21, 22,16 och 14]

D

=

6πηR_𝐻

I DLS mäts partiklarnas diffusionskonstanter. [18] Storleken på kolloiderna spelar en avgörande roll i deras ljusspridningsbeteende, detta beror på att miceller (sfäriska) och vesiklar visar två helt olika ljusspridningsbeteenden. Miceller <5–10 nm i diameter framställer klara vattenlösningar medan vesiklar> 100 nm i diameter bildar grumliga dispersioner i vatten vilket tyder på att systemet uppnått annan cmc värde och i jämförelse med sfäriska miceller en ny struktur som är liknande makaronformade eller stavformade formades.[23] RH, den hydrodynamiska diameter som erhålls från DLS-mätningar, är bara en uppskattning på partikelstorleken och definieras som partikels effektiva radie när partikel rör sig i en lösning.

[14] Den hydrodynamiska diametern beror inte bara på storleken på partikelns" kärna "utan också på vilken ytstruktur som helst, samt typen och koncentrationen av alla joner i mediet.

1.3.2 Statisk ljusspridning

Utvecklingen och billigheten hos laserstrålningskällor har kraftigt utvidgat användningen av SLS för att bestämma RG-storleken på kolloidala partiklar och makromolekyler [24, 14]. SLS är en snabb, icke-invasiv, enkel och billig metod. Användning av SLS gör det möjligt att extrahera en mängd olika textinformation som storlek, form, form av flerskiktspartiklar, yttre ytgeometri och porositet och densitet. Först riktas en laserstråle med en våglängd på 653 nm till mitten av kyvetten som innehåller provet och spridd ljusintensitet detekteras sedan av flera detektorer i specifika vinklar. Intensitet kan definieras med hjälp av ekvation 2. [24, 25]

(𝐼) = 𝑁 ∗ (𝛥𝜌) ∗ (𝑉)²∗ 𝑃(𝑞) ∗ 𝑆(𝑞) (2)

Faktorer som kan påverka mängden och intensiteten av spridda ljuset är: skillnaden i spridningslängdstäthet mellan partikeln och lösningsmedlet, volymen av kolloiden, partikelsformen och strukturfaktorn. I ekvationen N representeras antalet partiklar i spridningsvolymen.

Spridningsvinkeln Q, som är spridningsvektorn definieras med hjälp av ekvation (3) där n är brytningsindex för det rena lösningsmedlet, λ är laserns våglängd och θ är spridningsvinkel.

𝑞 = |𝑞| = (

λ

) sin(

2

)

Figur 5. Principen för spridningstekniker. Incidentstrålning I0 sprids av molekyler i provet.

Enligt bilden nedan när partiklarnas storlek är mindre än <1/10 (λ/10) våglängd av primär stråle (infallande ljuset) sker en elastisk spridning vilket innebär att den sekundär strålen (spridda ljuset) har samma energi som den primär stråle och är oberoende av vinkel (Rayleigh spridning). I händelse av att när partikelstorleken blir större än λ/10 sker en oelastisk spridning och detta betyder att Rayleigh spridning ersätts Mie spridning och detta leder till att primär ljuset och sekundär ljusets energi är inte samma och det spridda ljuset är vinkel-beroende.

Figur 6. Schematisk visar skillnaderna mellan Rayleigh och Mie spridning.[34]

För partiklar med en storlek mindre än λ / 10 också infallande ljuset och spridda ljusets har lika mängd energi och mängden energi beror inte på strålningsvinkel. SAXS är den lämpliga metoden för att mäta RG för partiklar som är mindre än λ / 10. [26]. Radien av gyration (RG) är en av de fundamentala parametrarna och särskilt användbart för att beskriva molekylstrukturen vilket definieras som det genomsnittliga kvadratavståndet från molekylens centrum. [21] RG

kan beräknas / bestämmas från följande ekvation 4.

𝑅_𝑔² = Nat-1∗ (𝑟_1,𝑐.𝑚.² + 𝑟_2,𝑐.𝑚.² + … + 𝑟_{𝑛,𝑐.𝑚.}² ) (4)

Natvisar antal atomer och r² atomernas avstånd till molekylens geometriska centrum.

1.4 Syftet

Syftet med detta projekt är att studera blandningar av gallsalterna natriumdeoxicholat (NaDC) och natrium cholat (NaC) med den anjoniska fosfolipiden DMPG och bestämma molbråket (sammansättningen) i aggregaten vid övergången från miceller till biskikt i gallsalt /fosfolipidblandningar. Dessutom ska medelstorleken och struktur för de kolloidala partiklar som bildas i lösningarna nära övergången bestämmas. Fosfolipiden DMPG har en laddning och våra resultat kommer att jämföras med tidigare motsvarande studier där den zwitterjoniska fosfolipiden DMPC undersökts.

2. Material och metod

2.1 Tensider och fosfolipider

Både gallsalter natrium cholat (NaC) och natriumdeoxcykolat (NaDC) samt natriumklorid (NaCl) med mer än 99,0% erhölls från Sigma-Aldrich och renades inte ytterligare. Fosfolipiden, DMPG (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-glycerol] natriumsalt) inköptes från Lipoid GmbH i det fysiska tillståndet av pulver och används utan ytterligare rening. Den kemiska 2D- struktur skildringen för DMPG, NaC och NaDC ses i figurer nedan såväl som arrangemanget av polära huvudgrupper och icke-polära ringar av NaC och NaDC.

Figur7.DMPG,1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol, natriumsalt, molekylvikt:688,85 g mol^-1

Figur 8. Natriumkolat (NaC), Mw: 430 g mol^-1 Figur 9.Natriumdeoxikolat (NaDC), Mw: 414,55 g mol^-1

2.2 Beredning av blandad micellösningar

Lösningar bestående av NaC, NaDC och DMPG framställdes med olika molförhållanden R = ([DMPG]) / ([DMPG] + [NaC]) och R = ([DMPG]) / ([DMPG] + [NaDC]) varierande från 0,10 till 0,95 med en total koncentration på 80 mM. Från dessa intervallet valdes molförhållandet 0,80, 0,85, 0,90 och 0,95 av DMPG. Fem prover av varje molförhållande gjordes med olika totalkoncentrationer: 80, 60, 40, 20 och 10 mM. Prover med olika fosfolipidkoncentrationer utarbetades genom spädning av det mer koncentrerade provet (80 mM, utspädd till 60, 40, 20 och 10 mM). Alla lösningar bereddes i 154 mM NaCl-buffert och stördes i minst 2–7 dagar för att minimera risken för att systemet inte nådde jämvikt innan experiment utfördes.

2.3 Ljusspridningsmätningar

SLS- och DLS-mätningarna gjordes med ett ALV / CGS-3 kompakt goniometersystem utrustad med en ALV-5004-korrelator och en Cobolt Samba 50-laser som ljuskälla (532 nm).

Temperatur i brytningsindex som matchar toluenbadet upprätthölls vid 21 och 37 °C. Mätningar gjordes i vinkelområdet 35° till 145° med ackumuleringstider på 30 s. 1 ml av varje prov filtrerades genom en steril och icke-pyrogen 5,0 µm polyetersulfonmembran och sedan placerades i en cylindrisk högpresterande kvartsglaskuvett. Kyvetten är nedsänkt i toluen vilket har ett liknande brytningsindex som kvartsglaskyvetten. Innan mätningar skall instrumentet kalibreras vilket görs genom att prover bestående av ren toluen och buffert användes. På grund av buffertens höga känslighet filtrerades den genom en steril och icke-pyrogen 0,22 µm polyetersulfonmembran. Det bör noteras att före mätningens början och även efter slutet av varje mätning av varje prov, placerades kyvetten först i Hellmanex -rengörnigslösning i minst 15 minuter och sedan sköljdes kyvetten med helt sterilt vatten och torkades. Kyvetten måste vara helt torr och ren innan det nya provet hälls i den. Det spridda ljuset detekterades i ett intervallområde mellan 35–145 grader med ett vinkelsteg på 5 grader och varje vinkel mättes tre gånger vid 10 sekunder. Alla proverna filtrerades innan ljusspridningsmätningar. De grumliga samt för grumliga prover, vilka som inte lämpade för ljusspridningsmätningar. För analys av SLS-data användes programmet ALV-Stat 4.51. Efter justering av både temperatur och viskositet i dataprogrammet, bestämdes Mw och RG för varje enskilt prov. dn/dc värdet beräknades också separat för varje enskilt prov.

Med Dapp-värdet känt kunde den hydrodynamiska radien RH extraheras med hjälp av Stokes- Einstein-ekvationen (ekvation 1).

2.4 Beräkningar av blandningsförhållanden

Förhållandet mellan NaC och DMPG också NaDC och DMPG i micellaggregaterna skiljer sig beroende på mängden av varje förening inuti systemet därför varje prov kommer att ha sitt eget dn/dc-värde. För att beräkna dessa blandningsförhållandet X för micellerna och beräkningar av dn/dc för varje prov användes datorprogrammet MATLAB R2020a. Funktionen bygger på Poisson-Boltzmann-teori och används cmc-värdet för Nac, NaDC och DMPG i rent lösningsmedel för sina beräkningar. Cmc-värdet för DMPG var 0,011 mM, NaC cmc-värdet var 5,4 mM och till sist ett värde på 2 mM avändes som cmc för NaDC och allt detta värderna erhölls från tidigare forskningar/ studier. dn/dc av ren Nac och NaDC i vatten tillsammans med blandningsförhållandet kunde sedan användas för att få ett individuellt dn/dc-värde för varje blandat prov. dn/dc för NaC och NaDC bestämdes genom användning av refraktometer.

2.5 Bestämning av brytningsindexinkrement av NaC och NaDC

dn/dc för NaC och NaDC erhölls med användning av BRICE-PHOENIX model BP-2000 V, en differential refraktometer optisk typ. Ljus från kvicksilverlampa kommer att passera genom det monokromatiska filtret, transparenta spegeln och sliten och sedan in i cellhuset där provet är beläget. ljusstrålen inträffar normalt på cellytan för både positionen 0 och 180. Två cellavdelningar fylldes med en milliliter vardera av lösning och lösningsmedel och cirka 15 minuter väntades för att uppnå temperaturjämvikt. Med cellen i position 0 (lösning mot slits) bestämdes d1. För detta ändamål, bör den skarpaste slitsbilden väljas genom att försiktigt finjustera mikroskopet med hjälp av bildfokaljustering. Sedan flyttades hårkorset tills det var i ståndet som halverades slitsbilden och lästes nummer för den här inställningen från filarmikrometer trumma. Detta upprepades ungefär fem gånger, förskjuts hårkorset (mitt i korset) och finjusteras varje gång. Sedan vrids cellen i position 180 och d2 bestämdes på ett liknande sätt. Medelvärdet av de fem värdena beräknades för både d1 och d2 och användes medelvärdet i senare steg. dn/dc värden för både gallsalter, NaC och NaDC i två olika koncentrationer beräknades med användning av formeln som finns i bilaga. För detta ändamål valdes två koncentrationer, 10 och 80 mM. Prover framställdes i två olika lösningar, en i rent vatten och en i buffert. Efter bestämning av värdena för d1 och d2, kunde värdet på dn/dc beräknas för båda galltsalterna. dn/dc är känslig för temperatur, koncentration och en viss våglängd. Därför innan mätningen påbörjas skall det säkerställas att båda lösningarnas temperatur i den tvådelade kyvetten är samma. Den beskrivna differentiella refraktometern har fördelar med enkelhet, relativ frihet från svårigheter med temperaturkontroll, hög precision, känslighet och noggrannhet.

3. Resultat och diskussion

3.1 Brytningsindexinkrement av NaC och NaDC

För båda gallsalterna i en koncentration av 10 mM och i rent vattenlösningsmedel var det erhållna värdet för d2 mindre än d1. Detta fick dn/dc att bli negativ och orsaken till det negativa värdet på dn/dc kan relateras till den låga koncentrationen av gallsalter. Ett dn/dc-värdet på 0,148 ml/g för NaDC och ett dn/dc-värdet på 0,129 ml/g bestämdes för NaC. som ligger inom det förväntade intervallet för gallsalter och är i överensstämmelse med tidigare studier om NaDC. Resultaten finns i två tabeller i bilagan.

3.2 Ljusspridning

Både DLS och SLS mätningar utfördes för att bestämma storleken på miceller/aggregat i prover av gallsalter NaC och NaDC. För att kunna mäta och få tillförlitliga resultat med hjälp av båda metoderna måste proverna vara helt transparenta. När jämvikt nåddes i proverna, identifierades de molniga och ogenomskinliga proverna för att uteslutas från mätningsprocessen. Vid 21 ̊ C observerades grumliga /molniga exemplar endast i NaDC prover, men vid 37 ̊ C observerades grumliga prover i båda gallsalterna. NaDC prover i ett molförhållande på Xf = 0,90 och en totalkoncentration av 80 också i molförhållandet Xf = 0,85 respektive vid totalkoncentrationerna 40, 60 och 80 mM var grumliga vid både 21 och 37 ̊ C. Hos NaC prover identifierades de grumliga prover i molförhållande Xf = 0,95, 0,90 och 0,85 samt hos NaDC prover observerades de grumliga exemplar i alla molförhållande. Även viskositeten hos prover visade signifikanta förändringar med temperaturförändringen. Vid 21 ̊ C var viskositeten vanligtvis låg, men med ökande temperatur blev viskositeten hos proverna högre. Vissa av proverna visade också fasseparation samt tydliga utfällningar exempelvis NaDC prov med molförhållande Xf = 0,85. Grumligheten indikerar att systemet i dessa prover har nått en övergång från miceller till stora biskiktsstrukturer. [23]

Figur 10. NaC/DMPG vid T=21 ̊C och T= 37 ̊C

Figur 11. NaDC/DMPG vid T=21 ̊C och T= 37 ̊C

3.2.1 Dynamisk ljusspridning

RH-värdet för varje enskilt prov för båda gallsalterna beräknades vid 21 och 37 grader baserat på data från DLS. Vid 21̊ C de flesta proverna med olika molförhållande och i olika total koncentration visade kolloidstorlekar i intervallet 3–10 nm (se tabellen nedan) vilket bekräftar närvaron av miceller av varierande storlek i systemet. Resultaten visade att micellernas storlek minskades när Xf ökade. Den förändringen hos blandmicellerna förklaras av en minskning i den genomsnittliga spontana krökningen. På grund av minskningen av andelen gallsalter i aggregaten reduceras den spontana krökningen för blandmicellerna vilket ökar packningsparametern och partikelstorleken. (22) Från modellberäkningar kan bestämma att aggregaten kommer att förändras från att bestå av mestadels NaC i höga molförhållanden och höga totala koncentrationer till högre förhållanden av DMPG när både totala koncentrationerna och molförhållandena minskar. Dessa två parametrarna skall ha en liknande inverkan/effekt i NaC prover, där syns en tydlig nedåtgående trend i proverna vid ökning av dessa parameter.

Tabell 3: Hydrodynamisk radie för olika NaC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer vid 21 ̊ C

NaC

Molförhållande

RH (nm) Konc 10 mM

RH (nm) Konc 20 mM

RH (nm) Konc 40

mM

RH (nm) Konc 60 mM

RH (nm) Konc 80 mM

0,05 11 10 10 9,0 8,1

0,10 9,3 9,3 8,0 7,0 7,0

0,15 7,7 6,9 5,6 4,8 4,3

0,20 6,5 5,2 4,7 4,2 4,4

Tabell 4: Hydrodynamisk radie för olika NaC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer vid 37 ̊C.

NaC

Molförhållande

RH (nm) Konc 10 mM

RH (nm) Konc 20 mM

RH (nm) Konc 40

mM

RH (nm) Konc 60 mM

RH (nm) Konc 80 mM

0,05 17 20 27 94

0,10 32 238

0,15 76 99 35 16

0,20 37 15 13 10 8,7

Observerade resultaten vid 37 ̊ C visar en signifikant ökning av RH för både gallsalterna, NaC och NaDC i allmänhet. Enligt resultaten i tabellen nedan kan det ses att vid samma molförhållande ökar RH i allmänhet med ökande total provkoncentration. Detta var inte oväntat eftersom miceller växer med ökande koncentration. En plötslig ökning av RH indikerar närvaron av en andra cmc, där micellerna växer genom att känna igen varandra och kommer närmare varandra och bildar stora maskliknande eller stavliknade miceller som kan trassla in sig med varandra. Trådmiceller kan vara upp till 200 nm stora. När micellerna närmar sig varandra och större partiklar bildas, kommer den nettorepulsionkraften mellan partiklarna också att bli starkare. Repulsionskraften avlägsnar micellerna från varandra och som ett resultat observeras en plötslig minskning på RH värdet, i vissa koncentrationer i varje målförhållande.

Vid 21 ̊ C, följer NaDC prover också efter samma mönster som NaC prover, om än med en liten avvikelse i prover med målförhållande 0,05 och 0,20. Vid 37 ° C var det beräknade RH- värdet för NaDC signifikant högre än beräknade RH-värdet för NaC (se tabellen nedan).

Tabell 5: Hydrodynamisk radie för olika NaDC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer vid 21 ̊C.

NaDC Molförhållande

RH (nm) Konc 10 mM

RH (nm) Konc 20 mM

RH (nm) Konc 40

mM

RH (nm) Konc 60 mM

RH (nm) Konc 80 mM

0,05 12 10 6,3 19 8,5

0,10 8,8 7,7 6,6 5,5

0,15 7,6 6,8

0,20 5,0 4,7 9,3 6,0 4,0

Tabell 6: Hydrodynamisk radie för olika NaDC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer vid 37 ̊C.

NaDC Molförhållande

RH (nm) Konc 10 mM

RH (nm) Konc 20 mM

RH (nm) Konc 40

mM

RH (nm) Konc 60 mM

RH (nm) Konc 80 mM

5% (0,05) 16 15,6 32 93

10% (0,10) 95 152 424 368

15% (0,15) 183 219

20% (0,20) 68 22 23

3.2.2 Statisk ljusspridning

Baserat på resultaten som erhållits i SLS, kan två parametrar bestämmas, radien för gyration (RG) och molekylär massa (Mapp). Eftersom dn/dc inte beräknades vid 37 grader utfördes inga beräkningar för RG och Mapp vid denna temperatur. Från dessa två erhållna parametrar, värdena för RG är inte säkerställas, och istället är den erhållna molekylvikten tillförlitlig.

Tabell 7: Gyrationsradie för olika NaC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer.

Konc (mM) Rg(nm)

NaC 5%

Rg(nm)

NaC 10%

Rg(nm)

NaC 15%

Rg(nm)

NaC 20%

10,00 77 22

20,00 40 56 33

40,00 56 85 29 35

60,00 61 94 54 37

80,00 71 79 106 93

Erhållna värden för RG indikerar att RG följt en minskande trend när den totala koncentrationen av prover ökades. De uppmätta värdena för NaDC prover visas närvaron av miceller av varierande storlek i systemet.

Tabell 8: Gyrationsradie för olika NaDC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer.

Konc(mM) RG(nm)

NaDC 5%

RG (nm)

NaDC 10%

RG(nm)

NaDC15%

RG(nm)

NaDC20%

10,00 99 39 76

20,00 77 33 39

40,00 41 36

60,00

80,00 202

Mapp för både NaC och NaDC prover visas i följande tabeller. Det verkar att både molförhållande och total koncentration har inverkan på partiklarnas Mapp i båda gallsalternas prover. Enligt värden i tabeller observeras att partiklarnas Mapp (för prover som har lika totalkoncentration) minskar när molförhållandet ökar. Med andra ord bevittnas en tydlig nedåtgående trend. Mapp (för prover som har lika målförhållande) minskar också när den totala koncentrationen ökar. Denna trend ses för båda gallsalterna, förutom att trenden är mer tydlig i NaDC-prover. Avvikelser i trenden kan vara kopplad till ökade repulsion kraften mellan micellerna. Ofullständiga SLS-data gjorde det svårt att uppnå tillförlitliga resultat för NaDC.

Men det syns en tydlig trend i molförhållandet 10%, där ökande total koncentrationen leder till att Mapp minskar.

Tabell 9: Mapp för olika NaC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer.

NaC

Molförhållande

Mapp(g/mol) Konc 10 mM

Mapp(g/mol) Konc 20 mM

Mapp(g/mol) Konc 40

mM

Mapp(g/mol) Konc 60 mM

Mapp(g/mol) Konc 80 mM

5% (0,05) 6,3 *10⁵ 8,2 *10⁵ 10 *10⁵ 7,8 *10⁵ 8,2 *10⁵

10% (0,10) 5,1 *10⁵ 6,8 *10⁵ 6,3 *10⁵ 3,8 *10⁵

15% (0,15) 5,9 *10⁵ 4,1 *10⁵ 1,9 *10⁵ 1,9 *10⁵ 3,9 *10⁵

20% (0,20) 1,9 *10⁵ 1,6 *10⁵ 1,4 *10⁵ 1,1 *10⁵ 2,2 *10⁵

Tabell 10: Mapp för olika NaDC prover bestående av olika molförhållanden och koncentrationer.

NaDC Molförhålland e

Mapp(g/mol ) Konc 10 mM

Mapp(g/mol ) Konc 20 mM

Mapp(g/mol ) Konc 40

mM

Mapp(g/mol ) Konc 60 mM

Mapp(g/mol ) Konc 80 mM

0,05 23 *10⁵ 20 *10⁵ 28 *10⁵

0,10 98 *10⁵ 5,6 *10⁵ 4,0 *10⁵ 2,0 *10⁵

0,15 5,6 *10⁵ 4,4 *10⁵

0,20 1,7 *10⁵ 1,3 *10⁵ 7,9 *10⁵

3.3 Felkällor

En av de mest grundläggande felkällorna som kan påpekas är det fel som uppstod under vägning av NaC, NaDC och DMPG för beredning av stamlösningar i början av arbetet. Särskild att vägningen av de önskade materialen gjordes med användning av två vågar med olika känslighet och noggrannhet. Den låga vikten av det önskade materialen var en stark anledning till att den teoretiska vikten och den praktiska vikten inte var desamma. Vilket i sin tur orsakar felaktigt mol förhållande i de beredda proven. Förberedning av prover innan ljusspridningsmättning gjordes inte i handsk-boxen. Filtrerings och överföringsprocessen i den cylindrisk högpresterande kvartsglaskyvett gjordes i rummet vilket innebär en ökade risk för kontaminering med dammpartiklar. Mänskliga fel såsom otillräcklig rengöring av kyvetten mellan proverna är också obestridligt. Jag vågar påstå, att inte ge tillräcklig med tid till vissa processer i detta projekt var en av de främsta anledningarna till att inte uppnå korrekta resultat vid ljusspridning. Prover behöver mer tid för att nå jämvikt på grund av joniska laddning och polariteten hos fosfolipiden. Innan ljusspridningsmätning vid 37 ° C, hölls proverna i ett 37 ° C varmt bad i endast 3 dagar. Efter att ha placerat i ljusspridning instrumenten startades mätningen efter 10 minuter. Anledningen för detta var för att kompensera den värmeförluster samt för att säkerställa provens räta temperatur men proverna bör dock förvaras i ett varmt bad under en längre tid, och mätningen bör börja en timme efter att provet placerats i ljusspridnings instrumenten. Anledningen till detta förslag är att proverna visade rätt olika beteenden under en längre tidsperiod, även under samma termiska förhållande.

4. Slutsatser

Denna studie visade att aggregat för blandade lösningar (system) som består av NaC, NaDC och DMPG med ett molförhållande på 0,05, 0,10, 0,15 och 0,20 av både NaC och NaDC vid 21 grader, har ett ungefärligt storleksintervall mellan 3 och 10 nm vilket är ren bekräftelse på närvaron av miceller i systemet. Vid 37°C visar systemet en signifikant ökning på partikelstorleken (RH) för både gallsalterna, NaC och NaDC i ett storleksintervall mellan 10 och 400 nm vilket antyder bildning av stora biskiktsaggregat.

Vid 21°C koncentrationsområdet som studerats för både NaC och NaDC visar att partiklarna har större storlek vid lägre koncentrationer. Att öka molförhållandet för både gallsalterna NaC

och NaDC leder till minskning av partikelstorleken i systemet. Vid 37 °C både NaC och NaDC i molförhållanden Xf värden 0,95 och 0,90, ökar partikelstorleken med ökande provkoncentration men i molförhållanden Xf -värden 0,85 och 0,80, minska partikelstorleken med ökande provkoncentration. Även vid 37 °C för NaC och NaDC i molförhållanden Xf

värden 0,95 och 0,90 observerades en micell-biskiktsövergång, vilket indikerar på närvaron av stora strukturer i systemet. Noggrann förutsägelse av vilka strukturer kan finnas i systemet kräver mer detaljerade och lämpligare experimentella tekniker till exempel ektronmikroskopi.

På grund av projektets tidsbegränsningar blev det omöjligt att använda dessa metoder.

Vid 21 °C ljusspridningsexperimenten för blandade system av NaDC och DMPC visade att micellernas storlek minskade med ökande koncentrationer medan ökande Xf ledde till ökad storlek vilket stämmer överens med resultaten från denna studie av blandsystem av gallsalter och DMPG. Vid en temperatur på 37 °C följde systemet inte detta mönster och modell utan micellernas storlek ökade med ökande koncentrationer och denna skillnad kan främst beror på det faktum att DMPG är en anjonisk fosfolipid som har laddning och gallsalternas ändrade konformation samt spontana krökning vid högre temperatur.

Referenser

1) Yun Y H, Lee B K, Park K. Controlled Drug Delivery: Historical perspective for the next generation. J Control Release. 2015 Dec.10;219:2-7.

2) Reinholz J, Landfester K, Mailänder V. The challenges of oral drug delivery via nanocarriers. Drug Deliv. 2018;25(1):1694-1705.

3) Tiwari G, Tiwari R, Sriwastawa B, Bhati L, Pandey S, et al. Drug delivery system: An updated review. Int J Pharm Investig. 2012 Jan;2(1):2-11.

4) Ross BP,Braddy A C, McGeaRy R P, Blanchfield J T, Prokai L,Toth I. Micellar Aggregation and Membrane Partitioning of Bile Salts, Fatty Acids, Sodium Dodecyl Sulfate, and Sugar-Conjugated Fatty Acids: Correlation with Hemolytic Potency and Implications for Drug Delivery. Mol Pharm. 2004;1: 233–245.

5) Li J, Wang X, Zhang S, Wang C, Huang Z, Luo X, et al. A review of phospholipids and their main applications in drug delivery systems. Asian J Pharm Sci.2015;10:81–98.

6) Tian C, Chiu C. The importance of hydrophilic groups on modulating structural, mechanical and interfacial properties of bilayers: A comparative molecular dynamics study of phosphatidylcholine and the ion pair amphiphilic membrane. Int J Mol Sci.

2018;19(6):1552.

7) Li J, Wang X, Zhang S,Wang C, Huang Z, Luo X, et al. A review of phospholipids and their main applications in drug delivery.Asian.J.Pharm.Sci. 2015;10(2):81-98.

8) Azad shah E, Nagao T,Kurihara H, Takahashi K. Production of a healthy food emulsifier by enzymatic partial hydrolysis of phospholipids is obtained from the head of the autumn Chum Lax. J Oleo Sci. 2017;13.66(2):147-155.

9) Egelhaaf, S. U. & Schurtenberger, P. Micelle-to-Vesicle Transition : A Time-Resolved Structural Study. (1999).

10) Azum N, Rub M A, Asiri A M. Aggregation Behavior of antipsychotic drugs under the influence of Bile salt in aqueous / Urea Solution. J Oleo Sci. 2020;69(4):327-335.

11) Valderrama J M, Wilde P, Macierzanka A, Mackie A. The role of bile salts in digestion.

Advances in Colloid and Interface Science. 2011;165(1):36-46.

12) Moghimipour E, Ameri A, Handali S. Absorption-enhancing effects of bile salts.

Molecules. 2015;20(8):14451-14473.

13) Neves M C, Filipe H A L, Reis R L, Prates Ramalho J P, Coreta-Gomes F, Moreno M J, et al. Interaction of bile salts with Lipid bilayers: An atomistic molecular dynamics study.

Front Physiol. 2019;10:390.

14) Kronberg B, Wall S. Yt och kolloidkemi.1 ed.Lund: Studentlitteratur; 2019./ Boken 15) Oster, G. The scattering of light and its applications to chemistry. Chem Rev. 1948 okt;

43(2):319-65.

16) Hiroi T, Shibayama M. Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy. J Vis Exp. 2017 Jan; (119):54885.

17) Goldburg.WI. Dynamic light scattering. AJP. 1999;67(12):1152-1160.

18) Eiser E. Multi Length-Scale Characterization.USA. Wiley&Sons Ltd; 2013.5, Dynamic Light Scattering; s. 235-236.

19) Fankhauser F. Application of static and dynamic light scattering--a review. Klin Monbl Augenheilkd. 2010;227(3):194-8.

20) Stetefeld J, McKenna S A, Patel T R. Dynamic light scattering: A practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 2016;8(4):409–427.

21) Tanner JJ. Empirically drive laws for the radii of the gyration of protein oligomers. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2016 okt 1; 72(Pt 10):1119–1129.

22) Carvalho P M, Felício M R, Santos N C, Gonçalves S, Domingues MM. Application of Light Scattering Techniques to Nanoparticle Characterization and Development. Front.

Chem. 2018;6:237.

23) Bergström L M, Tehrani-Bagha A, Nagy G. Growth Behavior, Geometrical Shape, and Second CMC of Micelles Formed by Cationic Gemini Esterquat Surfactants. Langmuir.

2015;31: 4644–4653.

24) Kolokolnikov I, Nepomnyashchaya E, Velichko E. Static light scattering for determination of physical parameters of macro- and nanoparticles. J. Phys.: Conf. Ser.

2019 dec; 1410:012168

25) Egelhaaf SU, Schurtenberger P. Shape Transformations in the Lecithin-Bile Salt System:

From Cylinders to Vesicles. J. Phys. Chem. 1994;98: 8560–8573.

26) Bhattacharjee S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not? J.

Controlled Release. 2016; 235, 337–351.

27) Wrobel D, Appelhans D, Signorelli M, Wiesner B, Fessas D, Scheler U, et al. Interaction study between maltose-modified PPI dendrimers and lipid model membranes. BBA- Biomembranes. 2015;1848(7):1490-1501.

28) Arleth L, Bauer R, Ogendal L, Egelhaaf SU, Schurtenberger P, Pedersen JS. Growth Behavior of Mixed Wormlike Micelles: a Small-Angle Scattering Study of the Lecithin−Bile Salt System. Langmuir. 2003;19: 4096-4104.

29) Chegg Prep. Fosfolipid struktur. 2010[citerad 9 januari 2021] Hämtad från:

30) EXAM III: Lipids and Cell Membranes Flashcards | Chegg.com. (CP BY 3.0) https://www.chegg.com/org/licenses/by/3.0/

31) DeLuca M, Loele G, Rango G. 1,4-Dihydropyridine Antihypertensive Drug: Recent Advences in Photostabilization Strategies. Pharmaceutics. 2019;11(2):85. Figure 2.

Scale repersentation of the central part of liposomes, niosomes & micelles; s.6.

32) Valderrama J M, Wilde P, Macierzanka A, Mackie A. The role of bile salts in digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 2011;165(1):36-46. Fig1.

33) Garidel P, Hildebrand A, Knauf K, Blume A. Membranolytic activity of bile salts:

Effects on biological membrane properties and composition.

Molecules.2007;12(10):2292-2326. Figur 1.

34) Bhattacharjee S.DLS och zeta potential – Vad de är och vad de inte. 2016;235:337- 351. Fig. 1.

Bilaga

• Matlab-funktion för att bestämma blandningsförhållandet

function f = f(x) y=0.80

ct=80.

cmc1=1.1e-2;

cmc2=2;

p=cmc1+cmc2-ct;

q=y.*ct.*(cmc1-cmc2)+cmc1.*cmc2-ct.*cmc1;

cmic=-p./2+sqrt(p.^2./4-q) f=y.*ct./(cmc1+cmic)-x cfree1=x.*cmc1

cfree2=(1-x).*cmc2

cmic=ct-cfree1-cfree2 xs=1-x

Och följande kommando för att lösa funktionen för x:

x=fsolv(@fx1,y värdet)

- Y totala molförhållandet för provet

- Ct totala koncentrationen ([DMPC] + [ytaktivt ämne]) - Cmc1 lipidens cmc

- Cmc2 cmc för tensid

- Cmic koncentrationen av miceller - X förhållandet lipid i micellen

- Xs molförhållandet ytaktivt medel i micellen

• Bestämning av dn/dc värdet för NaC och NaDC

Δn=K*Δd

⁼

^*

Det bästa kalibreringsvärdet valdes med hjälp av tabellen nedan.

Δd K

0,122 786,885

0,494 781,376

0,919 889,010

1,6 918,125

2,204 917,423

4,259 937,779

5,595 949,777

6,316 938,252

8,257 948,044

8,875 953,803

Table 1: Dn/dc-värdet för NaC i koncentrationer 10 & 80 mM.

Koncentration mM Dn/dc vid 21̊ c ml/g Acceptabelt dn/dc ml/g

NaC 10

-0,184

NaC 80 0,129 0,129

Table 2: Dn/dc-värdet för NaDC i koncentrationer 10 & 80 mM.

Koncentration mM Dn/dc vid 21̊ c ml/g Acceptabelt dn/dc ml/g

NaDC 10 - 0,156

NaDC 80 0,148 0,148

• Tabeller och figurer:

0 2 4 6 8 10 12

0 20 40 60 80 100

Rh(nm)

Koncentration (Mm)

Jämföreles av Rh-förändringar vid olika konc av NaC vid T=21 ̊ C

NaC 5%

NaC 10%

NaC15%

NaC 20%

Figur 12. Rh som en funktion av koncentrationen för koncentrationerna 10, 20, 40, 60 och 80 mM i molförhållanden 5, 10, 15 0ch för NaC

Figur 13. visar minskning av RH med ökning av total konc för NaC prov (0,20)

Figur 14. Rh som en funktion av koncentrationen för koncentrationerna 10, 20, 40, 60 och 80 mM i molförhållandet 5, 10, 15 0ch för NaDC.

36,98

15,02 13,29

10,06 8,69

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Rh(nm)

Koncentration (mM)

NaC 20%, T=37

NaC 20%, T=37

0 5 10 15 20

0 20 40 60 80 100

Rh(nm)

Koncentration (mM)

Jämföreles av Rh-förändringar vid olika konc av NaDC vid 21 ̊ c

NaDC 5%

NaDC 10%

NaDC15%

NaDC 20%

Figur15. visar ökning av RH med ökning av total konc för NaDC prov (0,05) 15,86 15,66

31,78

93,15

0 20 40 60 80 100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Rh(nm)

Koncentration (mM)

NaDC 5%, T=37

NaDC 5%, T=37