Örebro Universitet Läkarprogrammet
Självständigt arbete, 15 högskolepoäng Januari 2020
En jämförelse av trombocyter av olika storlek
och deras prokoagulanta aktivitet
Är stora trombocyter bättre?
Författare: Simon Söderberg Handledare: Sofia Ramström
2
Sammanfattning
Bakgrund: Trombocyter av olika storlek kan förväntas ha olika reaktivitet då de aktiveras. Det hävdas ibland att större trombocyter har bättre prokoagulant aktivitet, men datan kring detta är inte helt klarlagd, och bygger till del på observationer i sjukdomstillstånd med forcerad
trombocytproduktion, vilket rimligen kan påverka fynden.
Syfte: Undersöka om trombocyter med olika storlek (mätt som mean platelet volume (MPV)) i friska donatorer har olika prokoagulant aktivitet.
Metod: Vi har här bearbetat data från en egen studie där man separerade större och mindre trombocyter från samma individ och undersökte skillnaden mellan dessas prokoagulanta aktivitet (mätt som exponering av fosfatidylserin (PS), vilket detekteras med annexin V). Man jämförde även densiteten av receptorer och markörer som speglar olika andra processer i trombocytens aktivering samt hur mycket av dessa som uttrycktes efter att trombocyter hade aktiverats. Venöst blod från sex stycken friska, frivilliga donatorer sepererades med centrifugering. Från
trombocytskiktet som bildades togs trombocyter som därefter aktiverades med olika stimulatorer. Man kan då med hjälp av flödescytometri se hur trombocyterna reagerar avseende olika markörer och jämföra detta med deras MPV. En för syftet särskilt relevant markör är PS.
Resultat: Uttrycket av PS minskar med ökande MPV när man tittar på trombocyter av olika storlek från enskilda individer. En positiv korrelation mellan uttryck av P-selektin samt aktiverade GPIIb/IIIa-receptorer och högre MPV sågs.
Slutsats: Stora trombocyter är inte mer prokoagulanta än små, däremot uttrycker stora trombocyter mer P-selektin och aktiv GPIIb/IIIa-receptor, vilket delvis kan förklara det som observeras kliniskt. Försöken som gjordes i studien skulle dock behövas upprepas för säkrare iakttagelser och slutsatser.
3
Innehållsförteckning
Förkortningar ... 4
Bakgrund ... 5
Tidigare forskning och kliniska observationer ... 6
Hur aktiverades trombocyterna? ... 6
Vilka ämnen/markörer/molekyler undersöktes? ... 7
Syfte ... 8
Metod och Material ... 8
Material ... 8
Datan redan insamlad ... 8
Donatorerna ... 8
Blodinsamling ... 9
Separering ... 9
Flödescytometri ... 9
Analys och figurskapande ... 10
Resultat... 10
Subpopulationer ... 10
Aktiverades trombocyterna av de olika substanserna? ... 10
Uttrycket av PS korrelerar med MPV olika mycket beroende på aktiverande substans ... 11
Stora trombocyter är mer proaggregatoriska ... 12
Högre uttryck av P-selektin hos stora trombocyter och en mindre interindividuell spridning ... 13
Diskussion ... 15
Stora trombocyter har större prohemostatisk potential, trots att de ej är mer prokoagulanta ... 15
Är centrifugering en bra metod för uppdelning av trombocyter? ... 16
Donatorerna är få till antal men sina egna kontroller ... 16
Maximal aktivering av fibrinogenreceptorn GPIIb/IIIa verkar nås tidigare ... 17
Vad har låg respektive hög prokoagulant aktivitet för fysiologisk betydelse? ... 17
Vad har slutsatsen för klinisk relevans?... 17
Icke-signifikanta korrelationer och deras påverkan ... 17
Slutsats ... 18
4
Förkortningar
ADP Adenosindifosfat ATP Adenosintrifosfat
Ca2+ Kalciumjon
CRP-XL Cross-linked collagen related peptide
DilC1(5) 1,1’,3,3,3’,3’-hexametylindodikarbocyaninjodid ER Endoplasmatisk retikulum FSC Forward scatter GP Glykoprotein GPRP Gly-Pro-Arg-Pro GTP Guanosin-5’-trifosfat
ITAM Immunoreceptor tyrosine-based activation motif LAMP-1 Lysosomal-associated-membrane protein
MFI Median Fluorescence intensity
MPV Mean Platelet Volume, mätt i femtoliter (fL) P2Y Purinerga G-proteinreceptorer
PAR Protease activated receptor
PAR-AP Protease activated receptor activating peptide PRP Platelet-rich plasma
5
Bakgrund
Trombocyter är små cellfragment som bildas från megakaryocyter när de knoppar av delar av sin cytoplasma, och de har en avgörande roll för hemostasen genom att adherera till exponerat extracellulärt matrix, aggregera och rekrytera andra trombocyter i försök att stoppa blödning. Trombocyter är anukleära men innehåller flera organeller såsom endoplasmatiskt retikulum (ER), golgiapparat och mitokondrier vilka gör dem metabolt aktiva. Utöver cellorganeller finns i
cytoplasman flertalet granuler innehållande ämnen som bidrar till hemostasen på olika vis[1]. Trombocyter uttrycker flera receptorer som medierar deras bidrag i hemostasen. Viktiga receptorer är glykoproteinreceptorerna GPIb-V-IX, GPIIb/IIIa och GPVI, trombinreceptorn PAR1 samt receptorer för ADP, kollagen och tromboxan. Cirkulerande trombocyter i vila har en diskoid form och varierar i storlek med en diametervariation från 2 till 4 µm.
Aktiverade trombocyter har trotts kunna utföra alla uppgifter trombocyter kan utföra, men den tron har under de senaste decennierna förändras då idén om flera olika trombocytsubpopulationer med olika funktioner uppstått. Nya studier beskriver subpopulationer av trombocyter som kan anta olika roller i hemostasen, antingen genom att främst mediera aggregationen
(proaggregatoriska) eller underlätta koagulationskaskaden (prokoagulanta)[2][3].
Proaggregatoriska trombocyter är bra på att aggregera (bilda tromb). Dessa kommer beröras ytligt i denna uppsats men nämns ändå för förståelsens skull.
Prokoagulanta trombocyter uttrycker fosfatidylserin (PS) och binder koagulationsfaktorer och andra plasmaprotein för bildning av coated platelets[4], en typ av prokoagulanta trombocyter[5]. PS skapar ett negativt laddat yttre plasmamembran som möjliggör bildning av tenas- och
protrombinaskomplex så att koagulationsfaktorer och trombin kan bildas. PS-exponering kan detekteras in vitro genom användning av Annexin V, och trombocyter som binder Annexin V anses vara prokoagulanta.
Trombocyter innehåller sekretoriska α-granuler som förvarar bl.a. fibrinogen, von Willebrand-faktorn, trombospondin och fibronektin[6]. Trombocyter frisätter det α-granulära innehållet när de aktiveras, och en markör som används för att mäta degranuleringen är hur stor exponeringen av P-selektin är, då denna molekyl sitter på insidan av membranet till granule. Antalet α-granule som en trombocyter innehåller beror på dess storlek, men är ungefär tiofaldigt fler än
6
En annan typ av granulae som trombocyter har är ”dense granulae” Dessa granulae finns i trombocyter i antalet 3-8 per trombocyt och innehåller ADP, ATP, GTP, serotonin och 60-70% av trombocytens totala kalcium[7], vilka är viktiga vid sekundär aktvering av trombocyter[5]. Vid aktivering kommer dessa dense granulae att frisättas, och innehållande ADP kommer att aktivera trombocyten auto- och parakrint.
Tidigare forskning och kliniska observationer
Flertalet in vitro-studier har visat att stora trombocyter, som genererats under ett steady state-förhållande, har större prohemostatisk potential jämfört med små trombocyter, och som inte kan förklaras av deras större storlek[8]. Prohemostatisk potential beskrivs som förmågan att stoppa blödning. Trombocyternas subpopulationers olika funktioner är dåligt förstådda. Man vet inte varför stora trombocyter överproportionellt har en större prohemostatisk potential.
Det är flera funktioner hos trombocyter och egenskaper hos dem som resulterar i deras förmåga att stoppa blödning. En sådan är deras prokoagulanta aktivitet. Det hävdas ibland att stora trombocyter har bättre prokoagulant aktivitet, men datan kring detta är inte klarlagd, och bygger till del på kliniska observationer i olika sjukdomstillstånd där trombocytproduktionen påverkas av sjukdomen. Vid exempelvis idiopatisk trombocytopen purpura (ITP) har trombocyterna en kortare livstid[9], är yngre[10] och ett minskat antal som korrelerar med en större MPV[11]. ITP-drabbade har trots en lägre plateletcrit[12] en ökad arteriell och venös trombosrisk[13][14] jämfört med friska kontroller. Samtidigt beskrivs i en annan artikel[15] att bleeding score (allvarlighetsgraden av blödningar) ökar när trombocyters FSC ökar, som i sin tur är positivt korrelerad med deras MPV. Således, motstridiga resultat gällande storlekens korrelation med förmågan att stoppa blödning.
Hur aktiverades trombocyterna?
För att undersöka detta behöver man aktivera trombocyter, och i denna uppsats storlekssepareras vilande trombocyter från friska personer med normal trombocytproduktion som sedan utsätts för olika aktiverande substanser. De aktiverande substanserna är:
∙PAR1-AP (protease activated receptor 1-activating peptide) – Efterliknar trombins effekt på receptorn då denna peptid har den sekvens som normalt sett exponeras efter att trombin klyvt PAR1-receptorn och som då orsakar trombocytaktivering. Trombin är den mest potenta lösliga trombocytaktiveraren. PAR1-AP binder till receptorn PAR1, som tillhör den G-proteinkopplade
7
receptorfamiljen. Ligandbindning leder till trombocyternas formförändring[16] och en Ca2+ -frisättning från ER nödvändig för trombocytaktivering.
∙CRP-XL (cross linked collagen related peptide) – Efterliknar kollagens effekt och binder till receptorn GPVI, som är en medlem i immunoglobulinfamiljen. Kollagen är den potentaste olösliga liganden för trombocytaktivering. Ligandbindning är väldigt viktig för exponeringen av PS. Receptorn är ihopkopplad med immunreceptorn FcR med γ-kedjor med ITAMs.
Ligandbindning leder till en intracellulär koncentrationsökning av kalcium[17].
∙ADP (adenosindifosfat) – Binder huvudsakligen till receptorerna P2Y1 och P2Y12. Båda dessa är
G-proteinkopplade receptorer som främst förstärker effekten av andra aktiverande substanser. P2Y1-receptorn ger en formförändring av trombocyten och Ca2+-mobilisering[18]. Aktivering av
P2Y12-receptorn sänker nivåerna av cAMP i cytoplasman vilket inducerar
trombocytaggregation[19].
Olika koncentrationer av CRP-XL (0.5 respektive 5 µg/mL) användes för att se om vissa
trombocyter var extra känsliga mot substansen. Kombination av CRP-XL och PAR1 användes för att prokoagulanta trombocyter kräver stark stimulering för fullständig aktivering, och just den kombinationen är en av de effektivaste för PS-uttryck[20].
Vilka ämnen/markörer/molekyler undersöktes?
När trombocyterna aktiveras genomgår de en rad förändringar, och de börjar uttrycka flera olika molekyler som kan användas som markörer eller som receptor för markörer för subpopulationer eller i vilket stadium av aktivering de är i. Sådana molekyler som nämns i denna uppsats är: ∙LAMP-1 (lysosomal-associated-membrane protein-1) – Ett transmembranellt protein som uttrycks i lysosomala membran. Markör för lysosomfrisättning. Lysosomers funktion är okänd, men har föreslagits spela roll för exempelvis vävnadsremodellering och kan användas som en alternativ markör för trombocytaktivering[20].
∙P-selektin – Sitter på insidan av α-granule och uttrycks ej på trombocyter i vila, utan exponeras på trombocyternas membran i samband med aktivering och efterföljande α-granulefrisättning[5]. Markör för α-granulefrisättning och för aktivering av trombocyter[20].
8
∙PAC-1 – Monoklonal antikropp som känner igen och binder till aktiv konformation av fibrinogenreceptorn GPIIb/IIIa[21]. GPIIb/IIIa är huvudreceptorn för mediering av
trombocytaggregation. Trombocyter som binder PAC-1 men inte Annexin V kan anses vara proaggregatoriska[20].
Syfte
Syftet med denna studie är att undersöka om trombocyter med olika MPV från friska donatorer har olika prokoagulant aktivitet. Mer specifikt innebär detta att trombocyters uttryck av PS och dess korrelation med MPV undersöks.
Handledaren till uppsatsförfattaren var delaktig i en studie[20] som gav upphov till en uppföljningsstudie som ännu inte har publicerats. Det är dessa data som nu bearbetas i denna uppsats.
Metod och Material
Material
Materialet och metoden som användes var samma som i Södergrens och Ramströms studie[20], med undantag för trombin, GPRP och convulxin. PAR1-AP användes istället för trombin. GPRP behövdes ej då trombin ej användes. GPRP är en peptid som förhindrar polymerisering av fibrinmonomerer och därigenom gör att trombin kan användas även i närvaro av plasma utan att riskera bildning av fibrintrådar som omöjliggör analys med flödescytometri[22]. Convulxin är en GPVI-agonist, och CRP-XL användes istället för denna.
Koncentrationer av aktiverande substanser som använts; PAR1-AP (30µM), CRP-XL (0.5 µg/mL och 5 µg/mL), ADP (5 µM).
Datan redan insamlad
Datan som har använts i denna uppsats inhämtades juni 2016 vid sex olika tillfällen under månadens gång från sex olika donatorer. Hur datan insamlades beskrivs nedan.
Donatorerna
Personer med känd nedsatt eller avvikande trombocytfunktion eller koagulation, beroende på läkemedel eller andra avvikelser exkluderades från denna studie. Huruvida en person kunde
9
inkluderas med avseende på ovanstående bedömdes genom samtal innan blodprov togs. Donatorerna var studenter vid någon vårdutbildning eller anställda på forskningslabbet som anmält sig som frivilliga för medverkan som bloddonatorer.
Blodinsamling
Donatorerna fick ett informationsblad och lämnade efter att ha läst igenom det ett godkännande om att medverka i studien, varefter blodprov lämnades. Venöst blod (maximalt 45 ml) från sex stycken friska donatorer insamlades vid sex olika tillfällen av erfaren personal och provet fick vila i rumstemperatur i en timme innan centrifugering påbörjades. Blodprovet avidentifierades genast efter blodprovtagning. Information om bloddonatorns kön och ålder samt tid för
provtagning noterades. Separering
MPV mättes på helblodet innan centrifugering med hjälp av en cellräknare (SweLab Alfa, SweLab). Därefter centrifugerades blodet 150g i 15min i rumstemperatur. Centrifugerat blod är nu uppdelat i olika lager, varav ett lager är PRP (platelet rich plasma). Från detta lager togs 250µl från toppen, mitten och botten och fördes över till ett eppendorfrör. Det översta lagret från PRP antas utgöras av små trombocyter, det mellersta lagret av mellanstora trombocyter och det
nedersta lagret av stora trombocyter. Därefter mättes MPV på respektive fraktion med hjälp av en cellräknare.
Flödescytometri
Se metoden i Södergrens och Ramströms studie[20] för fullständig beskrivning av hur
flödescytometriavändningen utfördes. Trombin och GPRP användes dock ej i denna studie, till skillnad från nyss nämnd studie. En förenklad beskrivning följer:
Insamlade trombocyter tillsattes till ett rör med en mastermix av följande beståndsdelar; Ca2+ (för att bevara nära fysiologisk Ca2+-koncentration), agonister (PAR-1-AP, CRP-XL, ADP)/buffer (för kontroll) och detektionsantikroppar/-prober (GPIIb/IIIa, PAC-1, P-selektin, anti-LAMP-1, Annexin V). Trombocyterna inkuberades i 10 minuter, varefter provet späddes för att stoppa reaktionen. Direkt därefter analyserades proverna i en flödescytometer med tre lasrar, och hela analysen slutfördes inom en timme efter blodprovtagning.
10 Analys och figurskapande
För graden av uttryck av olika markörer som undersökts användes enheterna MFI (median fluorescenceintensity) eller andel trombocyter som uttryckte markören (%PS+trc eller %LAMP-1+trc).
För uttryck av P-selektin och aktiv GPIIb/IIIa användes MFI eftersom näst intill 100% av alla trombocyter uttryckte P-selektin respektive aktiv GPIIb/IIIa för samtliga aktivatorer som använts. MFI illustrerar tydligare hur uttryck av P-selektin och aktiv GPIIb/IIIa korrelerar med MPV. För uttryck av PS och LAMP-1 användes istället %PS+trc respektive %LAMP-1+trc eftersom inte alla trombocyter uttryckte markörerna.
För analys av insamlad data och skapande av figurer har GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) använts. Studiens tabeller gjordes med Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA).
Resultat
Subpopulationer
Från sex stycken donatorer insamlades blod som man centrifugerade. Blodet skiktades i olika lager och från det trombocytrika lagret (PRP) togs tre populationer av trombocyter som man med en cellräknare mätte MPV på. MPV:n är beskriven i tabell 1 nedan och indelad i fraktionerna ”Stora”, ”Medelstora” och ”Små” trombocyter.
Aktiverades trombocyterna av de olika substanserna?
Trombocyterna aktiverades av alla testade aktiverande substanser, bestämt utifrån uttryck av P-selektin och jämfört med en kontrollpopulation trombocyter som ej fick aktivator, se figur 1A.
Tabell 1. Aktiverade trombocyter indelades i fraktioner efter MPV.
Stora Medelstora Små Donator 1 10,1 8,7 7,3 Donator 2 7 6,7 6 Donator 3 8,6 7,8 7,5 Donator 4 9,6 8,8 8 Donator 5 9,8 9,1 9,2 Donator 6 10,2 9,2 8,6
11
Figuren visar medelvärdet av alla donatorers MPV-fraktioners (totalt 18 stycken) uttryck av P-selektin (som MFI) respektive LAMP (som % av trombocyter som uttrycker LAMP-1). Högst grad av aktivering observerades när man kombinerade aktivatorerna PAR1-AP 30 µM och CRP-XL 5 µg/mL. Lägre grad av aktivering erhölls med ADP 5 µM.
Används LAMP-1 istället för P-selektin som aktiveringsmarkör erhålls figuren i figur 1B, som även här visar att högst uttryck av LAMP-1 erhölls när man kombinerade PAR1-AP och CRP-XL som aktiverande substanser. Graden av LAMP-1-uttryck bestämdes genom att titta på andelen trombocyter som uttryckte markören (som är LAMP-1-positiva).
Kon trol l CR P-X L0.5 CR P-X L5 PA R 1-AP +CR P-X L0.5 PA R 1-AP + CR P-X L5 AD P PA R 1-AP 0 5 10 15 M F I P -s e le k ti n Kon trol l CR P-X L0.5 CR P-X L5 PA R 1-AP +CR P-X L0.5 PAR 1-A P + CR P-X L5 AD P PA R 1-AP 0 20 40 60 80 100 % L A M P -1 + t rc
Figur 1. A visar medelvärdet av alla donatorers trombocyters uttryck av P-selektin efter aktivering med aktivatorerna på X-axeln. B visar medelvärdet av alla donatorers trombocyters uttryck av LAMP-1 efter att ha aktiverats med aktivatorerna på X-axeln. Kontroll har ej aktiverats. Talet efter "CRP-XL"
betecknar koncentrationen i µg/mL.
A
B
Uttrycket av PS korrelerar med MPV olika mycket beroende på aktiverande substans
∙Aktivering med CRP-XL0.5, CRP-XL5, CRP0.5-XL+PAR1-AP och CRP-XL5+PAR1-AP: En statistiskt icke-signifikant korrelation mellan PS-uttryck och MPV erhölls från alla de olika aktiverande substanserna, se figur 2. Uttryck av PS är mätt som andelen aktiverade trombocyter
12
som uttrycker PS jämfört med andelen som inte gör det. Andelen trombocyter som uttrycker PS ökar när MPV ökar.
Korrelationslinjen mellan PS-uttryck och MPV har som figur 2 visar en positiv lutning för A-D, detta för att spridningen är större mellan individer än den är mellan MPV-fraktionerna.Följer man hur en och samma donators uttryck av PS förändras när MPV ökar, vilket är mer relevant för frågeställningen egentligen, ser man dock en korrelationslinje som inte är positiv (ibland negativ). 5 6 7 8 9 10 11 0 10 20 30 40 50 MPV
P
S
-u
tt
ry
c
k
(a
n
d
e
l
tr
o
m
b
o
c
y
te
r)
R square 0.01939 P value 0.5816 Kollagen (lågkonc.) 5 6 7 8 9 10 11 0 10 20 30 40 50 MPVP
S
-u
tt
ry
c
k
(a
n
d
e
l
tr
o
m
b
o
c
y
te
r)
R square 0.04023 P value 0.4248Trombin + kollagen (lågkonc.)
5 6 7 8 9 10 11 0 10 20 30 40 50 MPV
P
S
-u
tt
ry
c
k
(a
n
d
e
l
tr
o
m
b
o
c
y
te
r)
R square 0.07052 P value 0.2869Trombin + kollagen (högkonc.)
Figur 2. Figurerna visar sambandet mellan andelen trombocyter som uttrycker PS och MPV efter att ha aktiverats med olika aktivatorer eller kombinationer av aktivatorerna. Varje unik form är en individs trombocyters MPV-fraktion ("Liten", "Medelstor" och "Stor"). Talet efter "CRP-XL" betecknar koncentrationen i µg/mL. PAR1-AP har använts i koncentrationen 30µM.
5 6 7 8 9 10 11 0 10 20 30 40 50 MPV
P
S
-u
tt
ry
c
k
(a
n
d
e
l
tr
o
m
b
o
c
y
te
r)
Kollagen (högkonc.) R square 0.05910 P value 0.3310Stora trombocyter är mer proaggregatoriska
Utöver PS-uttryck undersöktes även andra markörer hos aktiverade trombocyter. Figur 3 visar både signifikanta (figur 3A) och icke-signifikanta (figur 3B-D) samband mellan trombocyternas
13
MPV och hur mycket PAC-1 som bundit till aktiv konformation av fibrinogenreceptorn
GPIIb/IIIa, en receptor som används som markör för aggregatorisk potential[5]. Figurerna visar en positiv korrelation med MPV.
5 6 7 8 9 10 11 0 1 2 3 4 5
A
(CRP-XL0.5) MPV M F I P A C -1 R square 0.2415 P value 0.0384 5 6 7 8 9 10 11 0 1 2 3 4 5B
(CRP-XL5) MPV M F I P A C -1 R square 0.09005 P value 0.2263 5 6 7 8 9 10 11 0 1 2 3 4 5C
(PAR1-AP+CRP-XL0.5) MPV M F I P A C -1 R square 0.08712 P value 0.2344 5 6 7 8 9 10 11 0 1 2 3 4 5D
(PAR1-AP+CRP-XL5) MPV M F I P A C -1 R square 0.01611 P value 0.6158Figur 3. Figurerna visar sambandet mellan uttrycket av aktiv GPIIb/IIIa (denna fibrinogenreceptor binder PAC-1) och MPV efter att ha aktiverats med olika aktivatorer eller kombinationer av aktivatorerna. Varje unik form är en individs trombocyters MPV-fraktion ("Liten", "Medelstor" och "Stor"). Talet efter "CRP-XL" betecknar koncentrationen i µg/mL. PAR1-AP har använts i koncentrationen 30µM.
Figur 3. Figurerna visar sambandet mellan uttrycket av aktiv GPIIb/IIIa (denna fibrinogenreceptor binder PAC-1) och MPV efter att ha aktiverats med olika aktivatorer eller kombinationer av aktivatorerna. Varje unik form är en individs trombocyters MPV-fraktion ("Liten", "Medelstor" och "Stor"). Talet efter "CRP-XL" betecknar koncentrationen i µg/mL. PAR1-AP har använts i
koncentrationen 30µM.
Högre uttryck av P-selektin hos stora trombocyter och en mindre interindividuell spridning Figur 4 illustrerar att uttrycket av P-selektin signifikant korrelerar med ökande MPV för de flesta donatorernas trombocyter. Samma figur visar även att den interindividuella spridningen av P-uttrycket är mindre än den interindividuella spridningen av PS- samt GPIIb/IIIa-uttrycken. Uttryck av P-selektin är alltså mer konstant mellan individer.
14 5 6 7 8 9 10 11 0 5 10 15
A
(CRP-XL0.5) MPV M F I P -s e le k ti n R square 0.3851 P value 0.0060 5 6 7 8 9 10 11 0 5 10 15B
(CRP-XL5) MPV R square 0.5864 P value 0.0002 M F I P -s e le k ti n 5 6 7 8 9 10 11 0 5 10 15C
(PAR1-AP+CRP-XL0.5) MPV M F I P -s e le k ti n R square 0.5700 P value 0.0003 5 6 7 8 9 10 11 0 5 10 15D
(PAR1-AP+CRP-XL5) MPV M F I P -s e le k ti n R square 0.4715 P value 0.0016Figur 4. Figurerna visar sambandet mellan uttrycket av P-selektin och MPV efter att ha aktiverats med olika aktivatorer eller kombinationer av aktivatorerna. Varje unik form är en individs trombocyters MPV-grupp ("Liten", "Medelstor" och "Stor"). Talet efter "CRP-XL" betecknar koncentrationen i µg/mL. PAR1-AP har använts i koncentrationen 30µM.
Figur 4. Figurerna visar sambandet mellan uttrycket av P-selektin och MPV efter att ha aktiverats med olika aktivatorer eller kombinationer av aktivatorerna. Varje unik form är en individs trombocyters MPV-grupp ("Liten", "Medelstor" och "Stor"). Talet efter "CRP-XL" betecknar koncentrationen i µg/mL. PAR1-AP har använts i koncentrationen 30µM.
15
Diskussion
Stora trombocyter har större prohemostatisk potential, trots att de ej är mer prokoagulanta Slutsatsen från denna studie är alltså att större trombocyter inte är mer prokoagulanta än mindre trombocyter från samma individ, kanske till och med tvärt om, att mindre är mer prokoagulanta. Dock bör man beakta att resultatet bygger på data från en liten grupp individer samt att de flesta resultaten är icke-signifikanta, vilket gör resultatet mindre pålitligt. I bakgrunden nämndes
publikationen av Prudent m.fl.[8] som sammanställde flertalet artiklar som undersökt funktionella skillnader hos stora och små trombocyter. Artiklarna som sammanställdes undersökte exempelvis enzymer i metabolismen, aggregationsförmåga (uttryck av aktiv GPIIb/IIIa), ATP-innehåll, fibrinogen och von Willebrand-faktor bundet på ytan efter aktivering, uttryck av P-selektin, etc. och från detta drog man slutsatsen att stora trombocyter jämfört med små hade en större
prohemostatisk potential. Slutsatsen från Prudent m.fl. kanske vid första anblick talar mot
slutsatsen från denna studie, men med prohemostatisk potential menas blodets förmåga att stoppa en blödning, och det är inte bara trombocyternas prokoagulanta aktivitet som bestämmer denna potential. Exempelvis så spelar trombocyternas proaggregatoriska aktivitet in. Av våra donatorers trombocyter undersöktes ju även uttrycket av aktiv fibrinogenreceptor GPIIb/IIIa med hjälp av den monoklonala antikroppen PAC-1 och hur denna receptor korrelerar med MPV. Receptorn är en viktig komponent för att få trombocyter att aggregera. Figur 3 visar att uttryck av aktiv
GPIIb/IIIa ökar när MPV ökar, till skillnad från PS. Även när man tittar på individer för sig själva ser man en uppåtgående trend. Detta skulle kunna vara en av förklaringarna till det man
observerat kliniskt. Denna uppsats slutsats avseende hur degranuleringsförmågan och proaggregatorisk aktivitet korrelerar med MPV går alltså i linje med det Prudent et al fann. Tyvärr undersökte de ej hur PS korrelerar med MPV, vilket få studier har gjort.
Khaspekova et al[23] och Kunicki et al[24] fann båda en positiv korrelation mellan GPIIb/IIIa-uttryck och MPV hos både friska och AKS-drabbade (akut koronart syndrom), vilket går i linje med denna uppsats fynd.
En annan markör som undersöktes var P-selektin. P-selektin är som sagt delvis en indikator på trombocytaktivering, men även på exocytos av α-granulae, som ju innehåller en rad ämnen som bidrar till att stoppa blödning. Rimligt att anta är att ju bättre förmåga till α-granulfrisättning, desto större prohemostatisk potential. Figur 4 illustrerar sambandet mellan uttryck av P-selektin
16
och MPV hos aktiverade trombocyter, och visar att mer P-selektin uttrycks på större trombocyter, om än bara lite mer. Detta är möjligtvis ännu en av antagligen flera förklaringar till varför man sett att stora trombocyter haft en större prohemostatisk potential jämfört med små trombocyter. Stora trombocyter har ju som nämnt även fler α-granulae än vad små har, vilket rimligtvis bidrar bör bidra till deras större prohemostatiska potential.
Min slutsats behöver alltså inte nödvändigtvis gå emot det Prudent m.fl. fann, men innebär följaktligen att stora trombocyter är mer prohemostatiska trots att deras prokoagulanta aktivitet avtar eller i alla fall inte ökar med ökande storlek.
Är centrifugering en bra metod för uppdelning av trombocyter?
När man centrifugerar så hamnar de tyngsta ämnena av de man centrifugerar i botten. Detta har utnyttjats för att separera trombocyterna från varandra. Det vi då gör är att anta att de största trombocyterna är tyngst och därför hamnar längst ned i PRP (platelet rich plasma), vilket är rimligt att anta om man utgår från att olika trombocyter har ungefärligen samma densitet.
Trombocyter har som nämnt olika funktioner och därmed/pga att de uttrycker olika proteiner och har olika antal granule, vilka rimligtvis även påverkar densiteten. Detta faktum kan innebära problem för använd separationsmetod ifall små trombocyter har en högre densitet jämfört med stora trombocyter, eftersom separeringen inte blir lika pålitlig vilket påverkar resultatet. Dessa studier[25][26] visar dock att densiteten mellan trombocyter med olika MPV skiljer sig endast lite, och då att stora trombocyter har en aning högre densitet. De största trombocyterna hamnar alltså i botten av PRP, medan de minsta hamnar högst upp, vilket således inte bör försämra
separationsmetoden. Ser man på donatorernas MPV i tabell 1 ser man dessutom att det för alla individer uppmättes skillnad i MPV i de olika fraktionerna.
Donatorerna är få till antal men sina egna kontroller
En styrka med studien är att dess design gör att donatorerna är sina egna kontroller. Ifall någon av donatorerna skulle ha defekta trombocyter, vilket får betraktas som osannolikt (den vanligaste blödningsrelaterade sjukdomen i världen är von Willebrands sjukdom med en prevalens på 1-2%[27]), ger detta mindre avspegling på resultatet då den generella frågan rör hur trombocyternas prokoagulanta aktivitet korrelerar med storlek inom samma individ. Om defekta trombocyter provtogs från någon donator så jämfördes dessa inom samma defekta trombocytpopulation, och resultatet blev i så fall fortfarande relevant för frågeställningen.
17
Maximal aktivering av fibrinogenreceptorn GPIIb/IIIa verkar nås tidigare
En intressant iakttagelse är den att om man jämför uttrycken av hur aktiv GPIIb/IIIa samt hur P-selektin korrelerar med ökande MPV (om man jämför figur 3 med figur 4), ser man i figur 3 att korrelationslinjerna avflackas när stimuleringen blir starkare. Alltså, I figur 3A (där aktivering gjorts med CRP-XL av koncentrationen 0.5 µg/mL, alltså svagare stimulus) är korrelationslinjen brantare jämfört med korrelationslinjen i figur 3D. Storleken spelar större roll för uttryck av aktiv GPIIb/IIIa vid lägre grad stimulering jämfört med högre grad stimulering. Detta kan tolkas som att fibrinogenreceptorn aktiveras närmare sin maximala aktiveringsgrad tidigare, alltså att den receptorn inte kräver lika stark stimulus för maximal aktivering.
I figur 4 avflackas inte korrelationslinjerna då stimuleringen blir starkare i samma utsträckning som i figur 3. I figur 4 ökar uttrycket av P-selektin med ökande MPV även i figur 4D, där
stimuleringen är starkast. Vissa α-granulae tycks alltså endast exocyteras vid hög aktivering. Vad har låg respektive hög prokoagulant aktivitet för fysiologisk betydelse?
Den prokoagulanta aktiviteten är en av trombocyters vapen i uppgiften att upprätthålla hemostasen. Hög prokoagulant aktivitet hos trombocyter innebär att de i hög grad medierar koagulationskaskaden, förenklat beskrivet. Låg prokoagulanta aktivitet innebär, logiskt nog, att trombocyter i låg grad medierar koagulationskaskaden.
Vad har slutsatsen för klinisk relevans?
Slutsatsen från denna uppsats skulla kunna bidra till en förbättrad bedömning av eventuell blödnings- och trombosrisk hos patienter, förutsatt att man vet patientens MPV, när syftet är att behandla någon typ av trombocytrelaterad sjukdom. Slutsatsen ger en indikation för att högre MPV hos en frisk individ möjligen skulle kunna indikera en bättre prohemostatisk kapacitet, vilket kan vara värt att beakta. Resultatet och slutsatsen är dock baserade på friska trombocyter, och att applicera denna information på sjuka trombocyter är kanske helt ogörligt, men de talar ändå för hur sjuka trombocyter möjligtvis fungerar. Om fallet verkligen är så kan inte denna studie utröna, utan det får vidare forskning undersöka.
Icke-signifikanta korrelationer och deras påverkan
Sambanden och korrelationerna som presenterats i resultatdelen av uppsatsen visar både
signifikanta (figur 3A samt 4) och icke-signifikanta (figur 2 samt figur 3B-D) resultat. Slutsatsen att stora trombocyter inte är mer prokoagulanta än små baseras på icke-signifikant data. Det finns
18
en möjlighet att signifikans skulle ha uppstått om datamaterialet varit större, men vår observation att korrelationen hos enskilda individers trombocyter i lejonparten av fallen snarast visade en omvänd trend med något högre värden hos små trombocyter (figur 2) gör att vi inte bedömer det som sannolikt att ett större material skulle leda till någon signifikant positiv korrelation mellan stora trombocyter och prokoagulant aktivitet.
Slutsats
∙Resultaten visar att donatorernas trombocyters uttryck av fosfatidylserin inte korrelerar med ökande storlek. Stora trombocyter är alltså inte mer prokoagulanta än små.
∙Positiv korrelation mellan uttryck av P-selektin samt aktiv konformation av GPIIb/IIIa och ökande storlek sågs.
19
Referenser
1. Yun S-H, Sim E-H, Goh R-Y, Park J-I, Han J-Y. Platelet Activation: The Mechanisms and Potential Biomarkers. BioMed Res Int [Internet]. 2016 [citerad 05 december 2019];2016. Tillgänglig vid: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4925965/
2. Mazepa M, Hoffman M, Monroe D. Superactivated platelets: thrombus regulators, thrombin generators, and potential clinical targets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. augusti
2013;33(8):1747–52.
3. Heemskerk JWM, Mattheij NJA, Cosemans JMEM. Platelet-based coagulation: different populations, different functions. J Thromb Haemost JTH. januari 2013;11(1):2–16. 4. Agbani EO, Poole AW. Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic
targeting in thrombosis. Blood. 16 2017;130(20):2171–9.
5. Södergren A. Formation and Relevance of Platelet Subpopulations. 2018 [citerad 25 november 2019]; Tillgänglig vid: http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:liu:diva-152280 6. Lancé MD, Sloep M, Henskens YMC, Marcus MAE. Mean Platelet Volume as a Diagnostic
Marker for Cardiovascular Disease: Drawbacks of Preanalytical Conditions and Measuring Techniques. Clin Appl Thromb. november 2012;18(6):561–8.
7. McNicol A, Israels SJ. Platelet dense granules: structure, function and implications for haemostasis. Thromb Res. 01 juli 1999;95(1):1–18.
8. Prudent M, Tissot J-D, Fontana S, Niederhauser C, redaktörer. Transfusion Medicine and Blood [Internet]. Frontiers Media SA; 2019 [citerad 04 januari 2020]. (Frontiers Research Topics). Tillgänglig vid: https://www.frontiersin.org/research-topics/5686/transfusion-medicine-and-blood
9. Buchanan GR, Scher CS, Button LN, Nathan DG. Use of homologous platelet survival in differential diagnoses of chronic thrombocytopenia in childhood. Pediatrics. januari 1977;59(1):45–54.
10. Saxon BR, Blanchette VS, Butchart S, Lim-Yin J, Poon AO. Reticulated platelet counts in the diagnosis of acute immune thrombocytopenic purpura. J Pediatr Hematol Oncol. februari 1998;20(1):44–8.
11. Lee E, Kim M, Jeon K, Lee J, Lee J-S, Kim H-S, m.fl. Mean Platelet Volume, Platelet Distribution Width, and Platelet Count, in Connection with Immune Thrombocytopenic Purpura and Essential Thrombocytopenia. Lab Med. 16 juli 2019;50(3):279–85. 12. Adly AAM, Ragab IA, Ismail EAR, Farahat MM. Evaluation of the immature platelet
fraction in the diagnosis and prognosis of childhood immune thrombocytopenia. Platelets. 2015;26(7):645–50.
20
13. Machin N, Ragni MV, Comer DM, Yabes JG. Prevalence and correlates of thrombosis in adults with immune thrombocytopenia: An NIS study. Thromb Res. 2018;172:80–5. 14. McMillan R, Durette C. Long-term outcomes in adults with chronic ITP after splenectomy
failure. Blood. 15 augusti 2004;104(4):956–60.
15. Frelinger AL, Grace RF, Gerrits AJ, Berny-Lang MA, Brown T, Carmichael SL, m.fl. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in ITP. Blood. 13 augusti 2015;126(7):873–9.
16. Wu C-C, Wu S-Y, Liao C-Y, Teng C-M, Wu Y-C, Kuo S-C. The roles and mechanisms of PAR4 and P2Y12/phosphatidylinositol 3-kinase pathway in maintaining thrombin-induced platelet aggregation. Br J Pharmacol. oktober 2010;161(3):643–58.
17. Nieswandt B, Watson SP. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor? Blood. 15 juli 2003;102(2):449–61.
18. Woulfe D, Yang J, Brass L. ADP and platelets: the end of the beginning. J Clin Invest. 15 juni 2001;107(12):1503–5.
19. Zhang Y, Zhang S, Ding Z. Role of P2Y12 Receptor in Thrombosis. Adv Exp Med Biol. 2017;906:307–24.
20. Södergren AL, Ramström S. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol. Sci Rep. december 2018;8(1):1441.
21. Shattil SJ, Hoxie JA, Cunningham M, Brass LF. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. J Biol Chem. 15 september 1985;260(20):11107–14.
22. Michelson AD. Platelet activation by thrombin can be directly measured in whole blood through the use of the peptide GPRP and flow cytometry: methods and clinical applications. Blood Coagul Fibrinolysis Int J Haemost Thromb. februari 1994;5(1):121–31.
23. Khaspekova SG, Zyuryaev IT, Yakushkin VV, Sirotkina OV, Zaytseva NO, Ruda MY, m.fl. Relationships of glycoproteins IIb-IIIa and Ib content with mean platelet volume and their genetic polymorphisms. Blood Coagul Fibrinolysis Int J Haemost Thromb. mars
2014;25(2):128–34.
24. Kunicki TJ, Williams SA, Nugent DJ, Yeager M. Mean platelet volume and integrin alleles correlate with levels of integrins α(IIb)β(3) and α(2)β(1) in acute coronary syndrome patients and normal subjects. Arterioscler Thromb Vasc Biol. januari 2012;32(1):147–52. 25. Thompson CB, Eaton KA, Princiotta SM, Rushin CA, Valeri CR. Size dependent platelet
subpopulations: relationship of platelet volume to ultrastructure, enzymatic activity, and function. Br J Haematol. mars 1982;50(3):509–19.
21
26. Polanowska-Grabowska R, Raha S, Gear AR. Adhesion efficiency, platelet density and size. Br J Haematol. december 1992;82(4):715–20.
27. Bradley LD, Falcone T. Hysteroscopy: Office Evaluation and Management of the Uterine Cavity. Elsevier Health Sciences; 2008. 289 s.
