Examensarbete, 15 hp Receptarieprogrammet, 180 hp
Rapporten godkänd: VT 2021
Handledare: Gerhard Gröbner, Examinator: Sofia Mattsson
Bcl-2 familjens
inblandning i resistent
prostatacancer
Hur ska forskningen fortsätta i
framtiden?
I
Sammanfattning
Inledning
Prostatacancer är en vanlig cancertyp hos män och har ett långsamt sjukdomsförlopp där symtomen oftast först uppkommer när det har bildats metastaser på andra ställen i kroppen. Behandlingen idag har oftast ett initialt bra svar men problemet uppstår när sjukdomen kommer tillbaka och då inte längre svarar på medicineringen som följd av en resistensutveckling.
Tidigare studier har visat att Bcl-2 familjen reglerar apoptos och genom detta är inblandad i denna resistensutveckling. Ett läkemedel som angriper Bcl-2 proteinet har godkänts för behandling av leukemi. Behandlingen med venetoklax som är en Bcl-2 selektiv inhibitor har testats på andra cancertyper utan effekt och detta har lett till funderingar om hur forskningen ska fortsätta.
Syfte
I denna studie är målet att kartlägga hur forskningen ska gå vidare kring Bcl-2 inhibitorer mot prostatacancer. Varför kan venetoklax, som är en Bcl-2 inhibitor inte användas för att behandla fler cancertyper är leukemi som den är godkänd för?
Metod
Syftet ska besvarades genom en litteraturstudie på originalartiklar från betrodda databaser bland annat PubMed och Scopus. Arbetet fokuserades på behandling för prostatacancer och nya läkemedel mot Bcl-2 familjen, andra artiklar valdes bort.
Resultat
Studierna visade på att anledningen till att venetoklax hade dålig effekt på prostatacancer berodde både på att den inte klarar av mutationer vilket gör den overksam samt att prostatacancer inte har ett överuttryck av Bcl-2 utan istället Mcl-1 och Bcl-XL. Därför inkluderade några studier även denna typ av behandling vilket gav en bättre effekt. Kombinationsbehandlingar visade sig ha bättre effekt på patienterna än enskilda behandlingar, en möjlighet är att behandla med enzalutamide för att göra cellerna mer mottagliga för andra behandlingar.
Slutsats
Ett bra spår att fortsätta på i framtiden är möjligheten till kombinationsbehandlingar som visat sig ha bättre effekt. venetoklax är inte verksam på prostatacancer eller andra typer där Bcl-2 inte är överuttryckt och mer forskning krävs för att utveckla en mer
anpassningsbar behandling.
II
Förkortningar och definitioner
ADP
docetaxel + prednison + AT-101
ADT
androgendeprivationsterapi
AR
androgenreceptor
BAX och BAK
Bcl-2 proteiner med flera homology domains
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
Bcl-W/ Bcl-2-L2 Bcl-2-like protein 2
Bcl-XL
B-celllymfom - extra stort
BH3
Bcl-2 homology domain 3
CNS
centrala nervsystemet
CRPC
kastreringsresistent prostatacancer
DP
docetacel + prednison
ENZ
IBS
Enzalutamide
Irritable Bowel Syndrome/känslig tarm
Mcl-1
inducerat myeloid leukemicellsdifferentieringsprotein
mCRPC
metastatisk kastreringsresistent prostatacancer
P53
transformationsrelaterat protein 53/tumörprotein
PSA
prostataspecifikt antigen
III
Innehållsförteckning
Sammanfattning
I
Förkortningar och definitioner
II
1.
Introduktion
1
1.1 Apoptos 1 1.2 Bcl-2 familjen 2 1.3 Prostatacancer 3 1.4 Prostatacancerbehandling 31.5 Syfte
4
2 Metod
4
3. Resultat
6
3.1 Studie 1. Birkinshaw M et al. Structures of BCL-2 (2) 6
3.2 Studie 2. Sonpavde M et al. Standard treatment upgrade (12) 7
3.3 Studie 3. Arai M et al. Tyrosine Kinase Inhibitors (13) 9
3.4 Studie 4. Pilling M et al. Targeting prosurvival BCL2 (14) 10 3.5 Studie 5. Greaves M et al. BH3-only proteins are dispensable (15) 11
4. Diskussion
14
4.1 Metoddiskussion 14 4.2 Resultatdiskussion 145. Slutsats
16
6. Tack
16
7. Referenser
17
1
1. Introduktion
Detta arbete ska behandla hur proteinerna som är delaktiga i apoptosen skapar problem vid behandlingen av prostatacancer. Vilka alternativ som studeras för att överkomma resistensen som uppstår när dessa protein överuttrycks och vilka resultat de kommit fram till. Det är också ett mål att kartlägga varför det läkemedel som finns idag mot dessa Bcl-2 protein inte kan användas vid behandling av metastatisk kastreringsresistent
prostatacancer.
1.1 Apoptos
Apoptos är en programmerad celldöd som rensar bort celler som är skadade eller inte längre behövs. Fel i regleringen av celldöd är en signifikant del av främst cancer, men många andra sjukdomar också. Exempelvis AIDS, autoimmuna sjukdomar och
Alzheimers. Vid cancer är det antingen en överproliferation av celler eller en minskning av borttagningen av celler. Ett sätt för tumörer att skapa en resistens mot apoptos är genom överuttryck av anti-apoptosiska B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) protein eller nedreglering av pro-apoptosiska protein (1). Detta har i sin tur lett till utvecklingen av läkemedel som angriper Bcl-2 proteinfamiljen (2).
Figur 1. Beskriver några av apoptosens viktiga funktioner. Omarbetad från (3). Apoptos har
många viktiga funktioner i kroppen, bland annat regleras antal celler, raderar- och skulpterar vävnader under utvecklingen. Viktigt i cancer är elimineringen av skadliga celler inte fungerar korrekt och detta orsakar en ökning av celler (4).
Apoptos är en process som är delaktig i flera processer, några av dessa redovisas i figur 1. Apoptos avlägsnar celler som annars skulle angripa kroppens egna friska vävnader och reglerar antal celler. Om apoptosen minskar kommer antal celler i kroppen öka och detta tros därför vara en mekanism bakom cellökningen som sker vid vissa cancerformer (4). Apoptos är en energikrävande serie av händelser som slutligen leder till celldöd. Under denna process kommer cellen krympas vilken gör att cytoplasman får högre densitet och organellerna blir tätare packade, sedan delas cellen upp i fragment som till sist
fagocyteras av makrofager. Detta är ingen inflammatorisk process till skillnad från nekrosen då den apoptosiska cellens delar inte släpps ut i omkringliggande vävnader, de släpper inte heller ut cytokiner som kan orsaka en inflammationsreaktion (1).
2
Figur 2. Beskriver hur den externa och inre vägen till apoptos skiljer sig från varandra.
Omarbetad från (5). Apoptos kan svara på faktorer som når cellen externt, ett exempel på detta är virusinfektioner. När skador uppstår i cellen är det istället den inre vägen som aktiveras. Vägarna har initialt skilda processer som till slut båda resulterar i programmerad celldöd (4).
Apoptos kan startas externt genom signaler till dödsreceptorn som sitter på cellens yta, detta är vanligt när immunförsvaret tar hand om virusinfekterade celler. Apoptos kan också startas internt som svar på skador på DNA eller andra viktiga delar av cellen (4). Hur dessa vägar ser ut redovisas i figur 2. Det har påvisats att dessa vägar samarbetar för att nå apoptos. Den interna vägen är inte receptormedierad och bygger istället på olika proteiners verkan i cellen. Det är via denna väg som läkemedel mot Bcl-2 proteinerna utvecklas. Det finns många tillstånd som kan sätta igång apoptos, dock innebär inte en stimuli att alla celler genomgår apoptos (1).
Den interna vägen kallas också den mitokondriella vägen, den påverkas av positiva och negativa signaler. De negativa signalerna är frånvarande av växtfaktorer, hormoner och andra signaler som kan leda till att celldöden avbryts, detta gör att apoptos induceras. Alltså innebär de negativa signalerna borttagna faktorer som kan inhibera apoptos. Till de positiva signalerna hör bland annat infektioner, fria radikaler och toxiner. Dessa ändrar mitokondriens inre membran vilket leder till att potentialen förloras och pro-apoptosiska proteiner släpps ut i cytosolen och aktiverar den inre vägen till apoptos (1).
Kontrollen över mitokondriens apoptosiska händelser har Bcl-2 familjens protein och dessa i sin tur kontrolleras av transformationsrelaterat protein 53 (p53) som är ett protein som dämpar tumörer. Bcl-2 familjen innehåller både pro- och anti-apoptosiska protein och tillsammans avgör de om cellen kommer fullfölja celldöden eller avbryta den (1).
1.2 Bcl-2 familjen
Namnet B cell lymphoma 2 (Bcl-2) proteinet fick de eftersom det enskilda proteinet Bcl-2 var det första upptäckta. Till denna familj hör både anti- och pro-apotosiska protein, förutom Bcl-2 så är även B-celllymfom - extra stort (Bcl-XL), Bcl-2-like protein 2 (Bcl-W) och inducerat myeloid leukemicellsdifferentieringsprotein (Mcl-1) anti-apoptosika protein. För att apoptos ska ske binder dessa protein till sin motsvarighet på den pro-apoptiska sidan av familjen, hit hör Bcl-2 homology domain 3 (BH3-only) proteinerna.
3
BH3- only proteinerna kan känna av den cellulära stressen som drabbar cellen när något är fel, exempelvis DNA skador och sedan aktivera apoptoseffektorena Bcl-2 proteiner med flera homology domains (BAX och BAK) (2).
Tanken bakom att läkemedel ska angripa Bcl-2 proteinet är för att blockera interaktionen mellan den pro- och anti-apoptosiska sidan genom att binda till bindningplatsen mellan proteinerna (2). Tre fraktioner av Bcl-2 familjen interagerar för att döma om celler ska genomgå apoptos. Processen startar när ett BH3-only protein, som uppregleras av stressignaler, interagerar med ytan på en anti-apoptosprotein och förhindrar deras begränsning av BAX och BAK, det mitokondriella membranet perforeras och apoptos aktiveras. Olika tumörer har defekter i aktiveringen av apoptos som en orsak av överuttryckning av Bcl-2 protein eller nedsatt uppreglering av BH3-only protein (6). Idag har vi ett godkänt läkemedel som angriper Bcl-2, venetoklax med preparatnamnet Venclyxto (ABT-199). Dess föregångare ABT-737 och ABT-263 var inte selektiva och angrep istället flera av Bcl-2 proteinerna. Det visade sig efter studier på dessa att
inhibition av Bcl-XL proteinet orsakar trombocytopeni (2) vilket gör att trombocytantalet minskar och risken för blödningar i hud och slemhinnor ökar (8). Detta gjorde att
utvecklingen av ett läkemedel som inte inhiberar Bcl-XL och det resulterade i venetoklax (2).
1.3 Prostatacancer
Risken att drabbas av prostatacancer stiger med åldern och det är ovanligt att diagnosticeras innan 70 års åldern. Trots detta är det den vanligaste cancerformen i Sverige och ca 5% av svenska män beräknas dö i prostatacancer (9). Prostatacancer har vanligen ett långsamt sjukdomsförlopp där tumören till en början endast växer i
prostatan. Den börjar ofta växa i de delar av prostatan som är längst ifrån urinröret, tillsammans med det långsamma sjukdomsförloppet är det inte ovanligt att det tar 10-15 år innan tumören upptäcks, då den tidigare inte gett några symtom. Vid det laget har den troligen hunnit bilda metastaser och det är inte ovanligt att symtomen upptäcks när cancern kommer från andra kroppsdelar än prostatan själv (8). Ett annat sätt att upptäcka prostatacancer är att mäta halten av prostataspecifikt antigen (PSA), detta är nästan alltid förhöjt vid prostatacancer och kan vara därför användas för att detektera cancern (10).
1.4 Prostatacancerbehandling
Vid behandling av prostatacancer grundar sig valet på ett antal faktorer- tumörstadium, malignitetsgrad, patientens ålder och allmäntillstånd. Det är inte ovanligt att avstå behandling för en patient som är äldre och där tumören ännu inte spridit sig utanför prostatan då de troligen inte kommer ge mycket besvär av deras återstående livstid (10). Om behandlingen startas i ett tidigt stadie innan tumören hunnit bilda metastaser kan hela körteln opereras bort. Denna operation är definitivt botande men kan ge risk för permanent ansträngningsinkontinens och impotens (10). Om tumören hunnit sprida sig kan strålning, detta kan bromsa sjukdomen. Ett annat sätt att bromsa sjukdomen är via hormonbehandling som kan göra det svårare för testosteron att bildas eller verka. Detta kallas androgendeprivationsterapi (ADT) och bygger på att prostatacancer är beroende av testosteron för att överleva. Dock kan denna typ av behandling ge impotens och tillväxt av bröstkörtelvävnad och du behöver fortsätta behandlingen resten av ditt liv (8,10).
Tumörer som inte kan behandlas kirurgiskt eller med radioterapi behandlas genom att sänka androgennivåerna eller genom att blockera androgenreceptorn (AR). AR binder till hormoner och reglerar en stor mängd gener som har med spridnings- och differeringssvar att göra. En prostatacancer specifik differering är (PSA) som kontrolleras av androgena steroider. Tidigare studier har visat att AR uttryck inte ensamt kontrollerar växten av hormonberoende prostatacancerceller (11).
4
Ett alternativ som snabbt reducerar testosteronet i kroppen är att operera bort testiklarna. Eftersom den största delen av testosteronet bildas här är det ett mycket effektivt sätt att minska testosteronnivåerna (10). Cytostatika kan användas som cellhämmande medel även vid prostatacancer (8).
Vid metastatisk kastreringsresistent prostatacancer (mCRPC) är standardbehandlingen docetaxel tillsammans med prednison (12,13). När denna behandling startas har
aktiviteten av androgenreceptorn AR redan minskats med kirurgisk eller medicinsk kastrering men sjukdomen har kommit tillbaka trots det initiala svaret på behandlingen (9).
1.5 Syfte
Syftet med denna studie är att genom en litteraturstudie utreda dagens Bcl-2 verksamma läkemedel och jämföra det med läkemedel som studeras för resistenta prostatatumörer idag. Belysa framtida möjligheter och problem med venetoklax vid behandling av
resistenta prostatatumörer och kartlägga Bcl-2 proteinets roll i svårigheten till behandling idag. Studien skall besvara följande frågeställningar:
- Vilka läkemedel studeras för prostatacancer idag och hur skiljer de sig från venetoklax?
- Vad är orsaken till att venetoklax inte är verksam i prostatacancer?
- Vilka nya kunskaper har erhållits sedan venetoklax godkändes och hur reflekteras det på nya läkemedel?
2 Metod
Denna litteraturstudie baserar sitt resultat på originalartiklar från databaserna PubMed, Nature Communications och Scopus. Hur sökningarna i dessa databaser gick till
redovisas nedan i tabell 1. Nedan följer vilka avgränsningar som gjorts för att arbetet skulle få en tydlig riktning.
Avgränsningar:
- Endast läkemedelsbehandling av prostatacancer är relevant, inte strålning, operation, eller symtomlindring.
- Arbetet avser endast behandling av prostatacancer, annat än hur olikheter mellan cancersorterna påverkar läkemedlen tas inte med.
- Arbetet fokuserar på behandlingar som angriper Bcl-2 proteinfamiljen, andra angreppsätt kan jämföras men är inte arbetets syfte.
5
Tabell 1. Redovisad litteratursökning.Databas Sökterm Filter Antal
träffar Referensnummer i denna litteraturstudie Nature
Communications Bcl-2 AND Venetoclax AND resistance
Research,
från 2019 1 2
PubMed AT-101 AND
”prostate cancer” Full text, 10 år, clinical trial, randimize d controlled trial 8 12
PubMed Abt-263 AND
”prostate cancer” Full text, 5år 7 13 PubMed Castration-resistent prostate cancer AND BCL2 Från 2019, full text 28 14 Scopus Mcl-1 inhibition AND prostate cancer Från 2019 20 15
6
3. Resultat
3.1 Studie 1. Birkinshaw M et al. Structures of BCL-2 (2)
För att få bättre förståelse för resistensmekanismen utfördes en studie på möss där toleransen för venetoklax inducerades i cellerna genom att ändra aminosyrafrekvensen i bindningsplatsen mellan Bcl-2 och BH3 proteinet. Detta gjorde att cellinjen blev resistent mot venetoklax och enligt författarna av studien visar underlag på att detta även sker i människoceller.
Idag är venetoklax godkänd för behandling av leukemi. Efter behandling med venetoklax har patienter fått en ny mutation G101V, som gör att patienter som tidigare svarat på behandlingen utvecklar resistens efter ca 1år. Mutationen har setts reducera affiniteten för läkemedlet kraftigt och ger då upphov till resistensutvecklingen.
Ett Bcl-2 protein med denna mutation har fortfarande affinitet för dess motsvarighet av pro-apoptosiska protein och kan därför fortfarande dämpa apoptosen.
Vid jämförelse mellan venetoklax och S55746 som är en annan selektiv Bcl-2 antagonist kunde de se att skillnaden är vilka bindningsplatser de binder till, de såg att det nya preparatet hade sämre affinitet till Bcl-2 proteinet än venetoklax kunde de avgöra vilken av bindningsplatserna som är viktig i protein-proteinbindningen som avgör cellernas öde.
7
3.2 Studie 2. Sonpavde M et al. Standard treatment upgrade (12)
Docetaxel och prednison (DP) är förstahandsbehandlingen av mCRPC.
Studien hade primärutfallet överlevnad och de sekundära utfallen var utvecklingsfri överlevnad, respons på PSA, mätbar sjukdom, smärta och biverkningar. Män med metastatisk adrenokarcinom i prostatan med sjukdomsutveckling trots ADT valdes ut att delta i studien, inklusionskriterier var utvecklande sjukdom eller stigande PSA.
Exklusionskriterier var metastaser i CNS, tidigare strålningsbehandling till mer än 30% av benmärgen, känslig tarm ”IBS” (Irritable Bowel Syndrome) eller hjärtsjukdom. Studien omfattade 220 deltagare jämnt fördelat mellan Ryssland och USA. Deltagarna hade liknande fysik, ålder och sjukdomsbild. Vid starten av studien hade deltagarna en PSA median på 81-91,4ng/mL och det var vanligast med benmetastaser.
AT-101 är en icke-selektiv Bcl-2 antagonist som utvärderas för en gynnsam effekt tillsammans med docetaxel och prednison. En maximal behandling på 1 år/ 17 cyklar kunde ges enligt doseringsanvisningen i tabell 2. Dosmodifikationer pga. toxicitet var tillåtna. Vid sänkning av AT-101 dosen var togs 10mg bort för varje sänkning och då sänktes dosen docetaxel med 15mg/m² för varje dossänkning. Mer än 2 dossänkningar eller uppskjutning av behandlingen mer än 2 veckor ansågs vara oacceptabel toxicitet.
Tabell 2. Doseringsregim för studien. Omarbetad från studie (12). Behandlingsregimen såg ut på
samma sätt som standardbehandling vanligen gör för prostatacancerpatienter, detta för att kunna avläsa om AT-101 hade en gynnsam effekt. Deltagarna delades upp i en kontrollgrupp (DP) som fick placebo, docetaxel och prednison och en testgrupp (ADP) som fick AT-101, docetaxel och prednison enligt ett schema som redovisas i tabellen (12).
Doseringsdag på 21 dagars cykel DP ADP Dag 1-3 Prednison 5mg 2 gånger/dag Prednison 5mg 2 gånger/dag Dag 1 Docetaxel 75mg/m² iv under 1 timme Docetaxel 75mg/m² iv under 1 timme Dag 1-3 Placebo 2 gånger/dag AT-101 40mg 2 gånger/dag
Det primära utfallet som var överlevnad visade sig inte skilja signifikant mellan
grupperna, testgruppen fick AT-101, prednision och docetaxel (ADP) och placebogruppen fick prednison och docetaxel (AD). I en ”intention to treat” visade de 18,1 månader för testgruppen och 17,8 månader för placebogruppen gruppen, detta med ett
konfidensintervall på 95%. De sågs inte heller någon signifikant skillnad mellan grupperna gällande de sekundära utfallen.
Resultatet visade att kombinationen med ADP inte gav en signifikant ökning i överlevnad jämfört med DP. Samtliga mätningar var jämna bland grupperna, en aning högre
frekvens av biverkningar kunde ses i ADP gruppen.
I en subgrupp med högriskpatienter sågs ett statistiskt signifikant bättre svar till ADP, vilket föreslår att Bcl-2 är mer aktivt i dessa personer och därför har den behandlingen bättre resultat. Uppdelning av deltagarna utifrån risk samt hur utfallen skiljer sig mellan
8
grupperna redovisas i tabell 3. Dock är dessa resultat tagna från en grupp på 34 personer och kan därför vara svårt att applicera resultaten på en större population.
Tabell 3. Resultatanalys uppdelat på riskgrupper. Omarbetad från artikeln (9). Kategorierna risk,
intermediär risk och hög risk bedömdes utifrån en skala där patienter fick svara hur många av följande som gällde dem: smärta, anemi, inre metastaser och benskanningsprogression, för varje faktor som stämde in på dem fick de 1 poäng. För riskgruppen gällde 0-1 poäng, intermediär risk med 2 poäng eller högrisk med 3-4 poäng. Här nedan redovisas hur många av deltagarna som tillhörde varje grupp samt hur stor andel som nådde mer än 50% minskning i prostataspecifikt antigen (PSA) och hur stor andel som nådde medianen för överlevnad i de båda grupperna. Medianöverlevnad hos AT-101 gruppen var ca 18 månader och för placebogruppen mellan 10-11 månader. NA är en förkortning för inte tillämpbar och innebär att siffror saknas för den gruppen.
Risk N=93 Intermediär Risk N=76 Hög risk N=34 Utfall (%) ADP=52 DP=41 ADP=32 DP=44 ADP=16 DP=18
Överlevnad
(månader) 21 NA (not (available) 13 15 19 14
≥ 50% minskning i PSA
9
3.3 Studie 3. Arai M et al. Tyrosine Kinase Inhibitors (13)
Denna studie ville avgöra om ABT-737 en Bcl-2 och Bcl-XL selektiv antagonist eller Navitoclax (ABT-263) en ickeselektiv antagonist kan sänka den apoptosiska tröskeln i prostatacancerceller och göra cellerna mer känsliga mot andra behandlingar. Den utfördes på olika typer av cancerceller och i resultatet kunde de se att en Bcl-2 reduktion tillsammans med ABT-737 eller Navitoclax inducerade ett snabbt apoptosiskt svar vilket indikerar att Bcl-2 skyddar redan apoptosmärkta celler från att genomgå apoptosen. Det sågs också att en kombination av receptortyrosinkinas (RTK) inhibitor och ABT-737/Navitoclax kunde förstärka nedbrytningen av Mcl-1, ett annat protein i Bcl-2 familjen som tros vara delaktig i resistensutvecklingen, genom att bryta ner detta inducerades apoptos.
Den initiala frågan var om prostatacancercellerna var märkta för apoptos men skyddade av de anti-apoptosiska proteinerna i Bcl-2 familjen. I studien användes ABT-737 och Navitoclax som båda är olika typer av Bcl-2 inhibitorer, de kunde inte inducera apoptos i de celler som testade. De testade också den ensamma effekten av Mcl-1 reduktion och inte heller den kunde inducera apoptos på egen hand. Men en kombination av Mcl-1
reduktion och ABT-737/Navitoclax var fördelaktig då celler som behandlades på detta sätt försattes i apoptos.
En förklaring till detta tros vara att i prostatacancerceller finns det en ökning av Mcl-1 och Bcl-XL men inte av Bcl-2 protein vilket förklarar varför venetoklax och andra liknande preparat inte hade någon verkan. Försöket indikerar även att det finns en synergisk effekt mellan Mcl-1 reduktion och Bcl-2 inhibition då de tillsammans kunde uppnå ett svar från cellerna där ingen av dem enskilt hade effekt. Slutsatsen från denna studie är att en kombinationsbehandling krävs för att uppnå önskvärda resultat.
10
3.4 Studie 4. Pilling M et al. Targeting prosurvival BCL2 (14)
I denna studie identifierades de protein från Bcl-2 familjen som blockerar apoptosen och hur de reagerar på enzalutamid (ENZ) i kastreringsresistent prostatacancer (CRPC) celler. ENZ är en AR inhibitor och för att kunna fastställa sambandet mellan apoptos och känsligheten för AR antagonism har de mätt livskraft, överlevnad och apoptos som svar till ENZ. Hur strukturerna för ENZ och venetoklax ser ut redovisas nedan figur 3. Den apoptosiska celldöden var omvänt proportionellt till livskraft och överlevnad i cellerna. Testerna utfördes på prostatacancerceller för att ta reda på om de var beroende av anti-apoptosiskt protein. För att ta reda på detta testades venetoklax (ABT-199), navitoclax och Mcl-1 inhibitorn A-1210477. venetoklax hade låg effekt vilket tyder på att Bcl-2 inte är viktigt för prostatacancercellen, eftersom den är en selektiv Bcl-2 inhibitor. Mcl-1 hade inte heller den någon effekt på cellen, det hade dock navitoclax vilket tyder på att cancercellerna är känsliga för Bcl-XL.
Då ensamma BH3 imitatörer inte gav det svar de önskade testade de att förbereda cellen för apoptos i bröstcancerceller, där ökade kemoterapin nivån av Bcl-2 och också
känsligheten till venetoklax. ENZ används för detta och i testerna som utfördes kunde ett signifikant ökat Bcl-2 uttryck ses i vissa celler som svar på ENZ. Detta föreslår att med hjälp av ENZ kan reglera den apoptosiska tröskeln och förbereda celler som redan är märkta för apoptos.
Hypotesen att känsligheten för ENZ reflekterar den apoptosiska tröskeln som bestäms av Bcl-2 proteinerna. De testade återigen venetoklax effekt på cellerna, men denna gång tillsammans med ENZ och kunde se en minskad livskraft hos cellerna. Detta beror på att Bcl-2 nivån nu är större vilket gör att venetoklax har effekt. Samma positiva effekt sågs inte mellan Mcl-1 inhibitorn och ENZ, detta tyder på att Bcl-XL och Mcl-1 protein blockerar apoptos i CRPC celler när de kombineras med en AR antagonism. Dessa proteiner kan angripas med BH3 imitatörer för att öka känsligheten mot ENZ. Slutligen visar inhibering av Bcl-2 och ENZ en lovande framtid när det kommer till att överkomma resistensutvecklingen.
Figur 3. Jämförelse mellan venetoklax till vänster och till höger enzalutamids strukturformler. Strukturformler skapade av författaren.
11
3.5 Studie 5. Greaves M et al. BH3-only proteins are dispensable (15)
Nyligen har selektiva BH3 imitatörer som angriper Bcl-XL och Mcl-1 utvecklats. A-1331852 är en Bcl-XL inhibitor och A-1210477 och S63845 är Mcl-1 inhibitorer. I denna studie demonstrerade forskarna att S63845 är en högpotent och Mcl-1 selektiv inhibitor som vid interaktion med andra BH3 imitatörer kan skapa synergi. Detta inkluderar venetoklax och A-1331852 som är selektiva för Bcl-2 respektive Bcl-XL, som tillsammans kan inducera apoptos i en stor mängd av cancersorter. De kom fram till att BH3-only protein behövs för att inducera apoptos tillsammans med Bcl-XL inhibition men att en kombination av Bcl-XL och Mcl-1 inhibition kan inducera en BH3-only protein oberoende celldöd.
Överensstämmande med tidigare uppgifter är att S63845 är mer potent än A-1210477. Enligt denna studie 100 gånger högre potens.
För att bedöma selektiviteten av S63845 att inducera apoptos i Mcl-1 selektivt sätt utsatte de Bcl-XL och Bcl-2 beroende celler för en ökad koncentration av Mcl-1 inhibitorn. Som väntat misslyckades den med att inducera apoptos i Bcl-XL celler men en
koncentrationsberoende apoptos i Bcl-2 cellerna- detta föreslår att S63845 antingen inducerar generell celldöd eller att det är en svag inhibitor av Bcl-2. För att testa detta gavs ökande koncentrationer till olika celler vilket demonstrerade att den inducerade apoptos selektivt och att den inte inducerar en generell celldöd.
För att identifiera om S63845 förutom att binda till och inhibera Mcl-1 också kan inhibera och binda till Bcl-2 utsattes celler som exklusivt beror på Bcl-2 för överlevnad med
ökande koncentrationer av S63845. I jämförelse gav venetoklax apoptos i dessa celler gav även S63845 en signifikant inducering av apoptos i samma dos som de gör i Mcl-1
beroende celler. Deras slutsats är ändå att S63845 inte binder till Bcl-2.
De undersökte även om S63845 ensamt eller i kombination med venetoklax kan inducera apoptos i leukemiceller, då vissa var mer resistenta än andra kunde de se att det generellt var mer känsliga mot en kombination av dessa preparat.
Många cancertumörer beror på både Bcl-XL och Mcl-1 för överlevnad. Hos testade tumörer var av några var prostatacancer sågs en signifikant ökning i induceringen vid kombination a Bcl-XL och Mcl-1 inhibitor vilket bekräftar att de beror av båda för överlevnad.
12
Tabell 4. Sammanställning av resultatet från samtliga artiklar.Vad undersöktes Resultat Slutsats
Studie
1 1. Resistensmekanismen i prostatacancer 2. Mutation som uppstår
efter lyckad behandling med venetoklax
En resistens liknande den som uppstår vid mutation av Bcl-2 kunde ses efter en behandling med venetoklax. Förändring i bindningsplatserna verkar vara avgörande för läkemedlets affinitet till proteinet Bindningsplatserna mellan Bcl-2 proteinerna och läkemedlet är avgörande för läkemedlets effekt Studie
2 Om tillägg av en icke selektiv Bcl-2 antagonist (AT-101) kunde göra standardbehandlingen bättre Ingen statistisk signifikant skillnad mellan placebogruppen och AT-101
gruppen kunde ses på någon av de mätta utfallen. Närmare undersökning på en högriskgrupp bland deltagarna kunde visa på en gynnsam effekt men tros dessvärre inte kunna
appliceras på totalpopulationen
Tillägget gav inte önskad effekt
Intressant att fortsätta forskningen kring varför högriskpatienterna visade på en bättre effekt än den generella populationen
Studie
3 1. Om den apoptosiska tröskeln kan sänkas 2. Kan en kombination med receptortyrosinkinas (RTK) inhibitor användas för att behandla prostatacancer Bcl-2 proteinerna skyddar celler som redan är märkta för apoptos från celldöd Kombination mellan BH3-imitatörer eller med RTK inhibitor inducerade apoptos som enkilda preparat inte kunde Kombinationsbehandlingar är mer lyckade än de med enskilda preparat
Mcl-1 och Bcl-XL är överuttryckt i
prostatacancerceller, inte Bcl-2 som tidigare troddes
13
Studie
4 1. Identifiera de protein i Bcl-2 familjen som blockerar apoptos 2. Se hur dessa reagerar
på enzalutamid (ENZ) 3. Om prostatacancerceller är beroende av anti-apoptosiskt protein Navitoclax som är en ickeselektiv Bcl-2 antagonist kunde inducera apoptos men det kunde inte de selektiva
preparaten venetoklax som inte hade någon enskild effekt kunde inducera apoptos tillsammans med ENZ till följd av ökningen av Bcl-2 protein som ENZ skapar
ENZ tillsammans med en Bcl-2 antagonist kan inducera apoptos i celler som egentligen inte är beroende av Bcl-2 proteinet Bcl-XL är viktigt för prostatacancercellens överlevnad Studie
5 1. Undersöker den nya Mcl-1 selektiva antagonisten S63845 2. En kombination
mellan venetoklax och S63845 för behandling av leukemipatienter Trots att S63845 kunde inducera apoptos på Bcl-2 beroende celler i flera tester valde forskarna att säga att den är Mcl-1 selektiv En kombination mellan venetoklax och Mcl-1 antagonisten kunde ge ett effektivare svar på leukemipatienterna Prostatacancerceller beror på Mcl-1 och Bcl-XL Det finns en synergisk effekt mellan BH3 imitatörer som gör
kombinationsbehandlingar intressanta för framtida forskning
14
4. Diskussion
4.1 Metoddiskussion
Denna studie ville utreda dagens verksamma Bcl-2 verksamma läkemedel och jämföra dem med läkemedel som studeras för resistent prostatacancer idag. Målet var även att utvärdera om venetoklax i framtiden kan vara verksam vid behandling av andra cancertyper än leukemi samt att se hur Bcl-2 proteinet är inblandat i svårigheten till behandling av cancer. Genom dessa frågeställningar hoppas detta kunna besvaras.
- Vilka läkemedel studeras för prostatacancer idag och hur skiljer de sig från venetoklax?
- Vad är orsaken till att venetoklax inte är verksam i prostatacancer?
- Vilka nya kunskaper har erhållits sedan venetoklax godkändes och hur reflekteras det på nya läkemedel?
Denna studie baseras på ett noggrant urval av artiklar med mål att besvara
frågeställningarna. För att hålla arbetet fokuserat valdes endast artiklar som behandlade prostatacancer, studier där flera cancersorter inkluderat prostatacancer kunde också inkluderas. Dessutom gällde behandling endast läkemedel som angrep något av Bcl-2 proteinerna.
En litteraturstudie passade ämnet väl eftersom det är en relativt ny typ av behandling och tillgången på studier som passade valda kriterier var begränsade. Att välja att göra en litteraturstudie gav mig möjligheten att bredda informationskällorna.
Nackdelen med att välja litteraturstudie för denna rapport var att antalet studier på samma ämne var begränsat och det var därför svårt att jämföra resultatet artiklar emellan. Från detta följer svårigheter att bedöma resultatet då det inte finns så mycket som kan bekräfta det, lyckligtvis överlappade studierna i denna rapport varandra relativt mycket vilket gjorde att resultatet ändå delvis kunde bekräftas. Att göra en experimentell studie hade varit för omfattande och kostsamt för den utsatta tiden och resurserna.
4.2 Resultatdiskussion
Eftersom det fanns svårigheter att hitta material till denna rapport är en stor felkälla omfattningen, de få studier som passade avgränsningarna var relativt små och gör därför överförbarheten på den generella populationen mindre tillförlitlig. Även om resultaten till viss mån bekräftade informationen i de andra finns det inga studier i denna rapport som studerar samma saker på samma sätt och kan därför inte bekräfta varandras resultat helt ut. Trots det ser jag potentialen i rapporten att lägga en grund för framtidens forskning inom ämnet, den ger också en övergripande blick över ämnet och kan bidra till ökad förståelse innan vidare fördjupning.
Studierna som denna rapport bygger på har olika metoder, studie 2 utfördes på människor, studie 1 på möss och resterande på celler in vitro. Detta kan ses som en svaghet då metoderna är spretiga och kanske därför inte lika tillförlitliga, jag valde att se det främst som en styrka då de ger ett vidare perspektiv. Studierna anser jag hade rätt tillvägagångssätt, exempelvis studie 2 som utfördes på prostatacancerpatienter hade inte gett samma givande svar om det utfördes in vitro.
En mutation gör venetoklax funktionslös, venetoklax efterföljare behöver vara mer anpassningsbara och de behöver hitta ett sätt att skapa ett läkemedel som fungerar även vid mutationer. De pratar också om att venetoklax har bättre affinitet till Bcl-2 än ett annat Bcl-2 selektivt preparat som har en annan bindning plats till proteinet, detta föreslår att genom att reglera bindningsplatser finns en chans till utveckling (2). Jämförelsen om en Bcl-2 antagonist gav en bättre effekt för den standardiserade behandlingen för metastatisk kastreringsresistent prostatacancer visade inte på någon signifikant skillnad i någon av utfallen de studerade (12).
15
Dock kunde de se ett bättre svar hos en riskgrupp, vilket förslagsvis kan tyda på att dessa personer uttrycker mer Bcl-2 än övriga deltagare. Genom studie 3,4 och 5 har det
fastställts att prostatacancer har ett överuttryck av Bcl-XL och Mcl-1 vilket förklarar varför en Bcl-2 selektiv antagonist inte har någon signifikant effekt, men att personerna i riskgruppen kanske hade en större andel metastaser som kunde bidragit till ökat Bcl-2 uttryck (12).
Forskarna för studie 2 tror att resultatet kunde påverkats av doseringen som var lägre och med ett längre doseringsintervall än tidigare studier. Trots att detta gjordes som följd av de tidigare studierna där de höga doserna visade på problem med toxicitet kan detta ändå ha bidragit till den dåliga effekten av ADP behandlingen jämfört med om de hade valt att använda sig av en högre dos (12).
Bcl-2 inhibitorerna testades för att se om de kunde sänka den apoptosiska tröskeln för att göra dem mer känsliga mot andra behandlingar. Eftersom Bcl-2 proteinet inte är
överuttryckt i prostatacancer fokuserar diskussionen istället mer på Mcl-1 proteinet som är det. I studien kunde en kombination av en receptortyrokinas inhibitor och Bcl-2 antagonist förstärka nedbrytningen av Mcl-1 och inducera apoptos (13).
Avvikande var att i studie 3 var inte en Mcl-1 reduktion tillräckligt för att försätta cellen i apoptos, som väntat kunde inte heller Bcl-2 antagonisten orsaka apoptos på egen hand i prostatacancerceller. Tillsammans kunde de se att apoptos inducerades, detta tyder på att även om Bcl-2 inte är överuttryckt i prostatacancerceller så har det ändå en givande effekt som kombinationsterapi. Troligen finns det en synergisk effekt mellan Mcl-1 reduktion och Bcl-2 inhibition som förklarar detta resultat. En kombinationsterapi är enligt dessa resultat bäst (13).
I studie 3 fastslår de även att det är just Mcl-1 och Bcl-Xl som är överuttryckt i prostatacancer och förklarar då varför venetoklax inte har haft någon effekt på dessa celler (13).
Enzalutamid (ENZ) är en androgenreceptorinhibitor vilket innebär att den dämpar uttrycket av testosteron som är den androgen som prostatacancer är beroende av. I studien ville de studera hur Bcl-2 proteinerna reagerar på detta preparat. ENZ används för att förbereda cellerna för andra behandlingar, i testerna som utfördes ökade Bcl-2 uttrycket i de celler som var känsliga för ENZ. Detta föreslår en möjlighet att reglera den apoptosiska tröskeln med hjälp av preparat som ENZ (14).
En annan del av studie 4 var att ta reda på om cancercellerna är beroende av anti-apoptosiskt protein. De visade sig att navitoclax som är icke selektiv Bcl-2 antagonist hade effekt och kunde inducera apoptos, men inte de preparat som är selektiva för Bcl-2 och Mcl-1. Detta stödjer studierna 3,4 och 5 som anger att Bcl-XL är viktigt för cellerna. Kombination av ENZ med venetoklax gav effekt på cellerna då uttrycket av Bcl-2 kunde ses i celler som reagerade på ENZ. Dock tros Mcl-1 och Bcl-XL blockera apoptos vid kombination till ENZ, vilket bekräftas genom tester. En kombination av ENZ och venetoklax visar därför en möjlighet till ett steg i rätt riktning till att överkomma resistensen mot cancerterapi (14).
Här bekräftas de andra studiernas (studie 3 och 5) resultat om att Mcl-1 antagonism kan vara synergisk med andra BH3 imitatörer, här anser jag att det finns en god möjlighet till behandling då en möjlighet att fritt kombinera olika antagonister för att angripa de protein som överuttrycks i en specifik cancer kan vara en framtida möjlighet (15).
Som det finns beskrivet i inledningen sker vanligen apoptos genom en interaktion mellan anti- och pro-apoptosiska protein, men i denna studie har de visat att en kombination av Bcl-XL och Mcl-1 i prostatacancer celler kan inducera apoptos utan närvarandet av BH3-only protein. Här bekräftas också poängen om att kombinationsterapier ger bättre
16
resultat än preparaten var för sig samt att prostatacancer är beroende av Bcl-XL och Mcl-1 (Mcl-15).
Gemensamt för studierna är att kombinationsterapier är ett bättre tillvägagångssätt än enskild behandling. De bekräftar tillsammans att prostatacancerceller överuttrycker Bcl-XL och Mcl-1 och att detta är anledningen till venetoklax inte är verksamt mot
prostatacancer. Detta är då troligt att andra cancertyper kanske uttrycker samma protein som prostatacancer eller andra och att detta förklarar varför venetoklax har begränsad användning.
Att det finns en synergisk effekt mellan preparaten är också bekräftad och ses som en bra möjlighet till framtida behandling. Jag anser att vidare forskning på vilka protein som uttrycks i olika cancer är en viktig pusselbit i kampen mot resistensen. Att utveckla läkemedel som är kombinationer av olika antagonister och även i kombination med ENZ är också en klok satsning.
5. Slutsats
Idag vet man att prostatacancerceller inte överuttrycker Bcl-2. Prostatacancerceller har visat sig vara beroende av Mcl-1 och Bcl-XL, detta gör att läkemedel som utvecklas för att angripa prostatacancerceller inte längre fokuserar på att vara Bcl-2 selektiva. Det skiljer dem från venetoklax och svarar även på frågeställningen om varför inte venetoklax fungerar på prostatacancer. Den nya kunskapen föreslår vidare forskning efter läkemedel som kan anpassa sig bättre till förhållandet i cellen samt kombinationsterapier, bland annat med Mcl-1 antagonister som vi sett i denna rapport har visat sig ha den bästa effekten.
6. Tack
Tack till Gerhard Gröbner som varit en mycket engagerad och påläst handledare. Uppskattade alla knuffar i rätt riktning och hjälpsamma tips.
17
7. Referenser
1. Elmore S. ”Apoptosis: a review of programmed cell death”. Toxicol Pathol. 2007 Jun;35(4):495-516.
2. Birkinshaw, R.W., Gong, Jn., Luo, C.S. et al. ”Structures of BCL-2 in complex with venetoclax reveal the molecular basis of resistance mutations”. Nat Commun 10, 2385 (2019).
3. Shlevkov E. ”Nuevos mecanismos de la regulacion de la apoptosis en Drosophila melanogaster”. Researchgate.net. Madisch L, Hofmayer SFickenscher H.
[uppdaterad: 2011-01, citerad: 2021-03-03]. Hämad från:
https://www.researchgate.net/publication/273134373_Nuevos_mecanismos_de _la_regulacion_de_la_apoptosis_en_Drosophila_melanogaster_Tesis_doctoral
_presentada_en_la_Universidad_Autonoma_de_Madrid
4. Malmquist J, Pontén J. ”Apoptos”. NE.se. NE Nationalencyklopedin AB. [citerad 2021-02-17] Hämtad från:
https://www.ne.se/uppslagsverk/encyklopedi/l%C3%A5ng/apoptos
5. Loreto C, La Rocca G, Anzalone R, Caltabiano R, Vespasiani G, Castorina S, Ralph D, Cellek S, Musumeci G, Giunta S, Djinovic R, Basic D, Sansalone S, "The Role of Intrinsic Pathway in Apoptosis Activation and Progression in Peyronie’s Disease", BioMed Research International, vol. 201.
6. Adams JM, Cory S. ”The BCL-2 arbiters of apoptosis and their growing role as cancer targets”. Cell Death Differ. 2018 Jan;25(1):27-36.
7. Fiskesund R. ”Trombocytopeni”. Internetmedicin.se. Hanssen K. [Uppdaterad 2020-08-11, citerad 2021-02-15]. Hämtad från:
https://www.internetmedicin.se/behandlingsoversikter/hematologi/trombocytop eni/
8. Schultz S. ”Prostatacancer”. 1177.se. Inera AB, Sveriges landsting och regioner. [Uppdaterad: 2019-10-17, citerad: 2021-01-18]. Hämtad från:
https://www.1177.se/Vastra-Gotaland/om-1177-vardguiden/om-1177-vardguiden/
9. Bratt O. ”Prostatacancer”. Internetmedicin.se. Hanssen K. [Uppdaterad 2020-03-30, citerad 2021-02-22] Hämtad från:
https://www.internetmedicin.se/behandlingsoversikter/kirurgi/prostatacancer/ 10. Malmquist J. ”Prostatacancer”. NE.se. NE Nationalencyklopedin AB. [citerad
2021-02-17] Hämtad från:
https://www.ne.se/uppslagsverk/encyklopedi/l%C3%A5ng/prostatacancer
11. Culig Z, Santer FR. ”Androgen receptor signaling in prostate cancer”. Cancer Metastasis Rev. 2014 Sep;33(2-3):413-27.
12. Sonpavde G, Matveev V, Burke JM, Caton JR, Fleming MT, Hutson TE, Galsky MD, Berry WR, Karlov P, Holmlund JT, Wood BA, Brookes M, Leopold L. ”Randomized phase II trial of docetaxel plus prednisone in combination with placebo or AT-101, an oral small molecule Bcl-2 family antagonist, as first-line therapy for metastatic castration-resistant prostate cancer”. Ann Oncol. 2012 Jul;23(7):1803-8.
13. Arai S, Jonas O, Whitman MA, Corey E, Balk SP, Chen S. ”Tyrosine Kinase Inhibitors Increase MCL1 Degradation and in Combination with BCLXL/BCL2 Inhibitors Drive Prostate Cancer Apoptosis”. Clin Cancer Res. 2018 Nov 1;24(21):5458-5470.
14. Pilling AB, Hwang C. ”Targeting prosurvival BCL2 signaling through Akt blockade sensitizes castration-resistant prostate cancer cells to enzalutamide”. Prostate. 2019 Aug;79(11):1347-1359.
15. Greaves G, Milani M, Butterworth M, Carter R.J, Byrne D.P, Eyers P.A, Luo X, Cohen G.M, Varadarajan S. ”BH3-only proteins are dispensable for apoptosis induced by pharmacological inhibition of both MCL-1 and BCL-XL. Cell death differ. 2019 June;26(6):1037-1047.
Institutionen för Integrativ Medicinsk Biologi Umeå Universitet
901 87 Umeå www.umu.se
