Fenotypning med Phene Plate system av koagulas-negativa stafylokocker isolerade från centrala venkatetrar

Örebro universitet Hälsoakademin

Biomedicinska analytikerprogrammet BMLV C, Examensarbete 15 hp Vårterminen 2010

Fenotypning med Phene Plate system av

koagulas-negativa stafylokocker isolerade

från centrala venkatetrar

Författare: Sanna Reinholm Handledare: Bo Söderquist, Docent, klinisk mikrobiolog och infektionsläkare

Bihandledare: Anna Önnberg, Biomedicinsk analytiker

Sammanfattning

Koagulas-negativa stafylokocker (KNS) klassas som en viktig del av hudens normalflora. Vid skador på hudens barriär som en inläggning av centrala venkatetrar (CVK) innebär kan dock KNS få tillträde till normalt sterila lokaler där de kan orsaka infektion. Vid utodling av borttagna CVK från patienter resistensbestäms bara några enstaka kolonier vilket gör det lätt att missa förekomst av flera olika stafylokock-kloner. Syftet med studien var att undersöka hur ofta en eller flera olika KNS-kloner förekommer på CVK från patienter, samt om det förekommer gemensamma kloner av KNS på CVK från olika patienter. Kolonier från CVK prov analyserades med den biokemiska fingerprintingmetoden Phene Plate-system (PhP). Resultatet visade 37 stycken CVK prov innehållande en klon, 23 stycken prov där det fanns 2 separata kloner, samt 6 prov med 3 kloner. Jämförelsen av kolonier ur prov från olika

patienter resulterade i kluster med många gemensamma PhP-typer. I de 3 största klustren fanns 31, 15, respektive 8 kolonier representerande olika patienter. Den betydande andelen polyklonala CVK prov leder till risken att missa en mer resistent klon vilket då kan få konsekvensen felaktig antibiotikabehandling av patient. Att många patientprov hade en gemensam KNS-klon tyder på spridning av speciellt virulenta stammar inom sjukhus. Nyckelord: Koagulas-negativa stafylokocker, Centrala venkatetrar, Phene Plate-system, Fenotypning, Biokemisk fingerprinting.

Innehållsförteckning

Introduktion……….4

Central venkateter (CVK)………..6

Typning av bakterier………..7

Phene Plate system (PhP) ………..8

Syfte.…..………10

Material och metod………10

Odlingsmetodik……….10

Provberedning och inkubering i PhP-plattor……….10

Absorbansmätning och databearbetning………....11

Resultat………..11

Jämförelse av gemensamma kloner mellan olika CVK-prov..………..12

Intra- och inter-assay variation för RP62A .………...14

Diskussion………...15

Slutsatser………17

Omnämnanden………..18

Introduktion

Stafylokocker är grampositiva kocker tillhörande familjen Micrococcaceae. De kännetecknas som fakultativt anaeroba bakterier och är orörliga, icke-sporbildande, ej näringsmässigt krävande, värmetåliga, samt tolererar en saltkoncentration upp till 10% (1-3). Stafylokocker kan delas in i två grupper beroende på förmågan till syntes av enzymet koagulas; koagulas-positiva dit framförallt Staphylococcus aureus (S. aureus) räknas, och de övriga som saknar förmågan att bilda koagulas benämns koagulas-negativa stafylokocker (KNS). Av ett 40-tal KNS koloniserar cirka hälften frekvent hud och slemhinnor hos människan och klassas där som en viktig del av hudens normalflora. Vid skador på hudens barriär kan dock KNS få tillträde till normalt sterila lokaler där de kan orsaka infektion (1).

KNS ansågs tidigare sällan orsaka infektioner, men med den ökade användningen av

främmande material i kroppen har de blivit en viktig orsak till sjukvårdsrelaterade infektioner (3-5). Detta faktum gynnas av KNS förmåga att fästa till implanterade eller insatta främmande material såsom katetrar, ledproteser samt hjärtklaffar (4). Den KNS som vanligast påträffas vid kateterrelaterade infektioner är Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) (4,5). Det finns två huvudsakliga uppkomstmekanismer för kateterrelaterade infektioner (6). Den vanligaste anses vara kolonisation och migration av mikroorganismer längs kateterns utsida till spetsen, antingen vid tidpunkten för insättning eller efteråt (6,7). Migration kan också ske längs insidan av katetern då bakterier härrörande från patientens hud eller från

sjukvårdspersonal förorenat de yttre delarna på katetern (6). En riskfaktor för infektion är kraftig kolonisation av huden runt insticksstället. Infektionerna som uppkommer härrör oftast från patientens egen normalflora. Vid sjukhusvård kan dock huden hos en patient snabbt koloniseras av omgivningens ”sjukhus”-flora. Mer sällan kan också katetern koloniseras på grund av kontaminerade infusioner (7).

KNS har ofta förmågan att bilda ett polysackarid slem eller biofilm på syntetiska polymerer vilka katetrar består av. Detta hjälper bakterierna att fästa till materialet och skyddar dessa genom att utgöra ett penetrationshinder mot antibiotikabehandling samt mot kroppens immunförsvar (4,5,8). Bildningen av biofilm sker i två steg. Den initiala vidhäftningen till katetern underlättas av dess hydrofoba karaktär som delas av många KNS, samt av bildningen av adhesiva cellyteproteiner på bakterien (4,5). På en kateter som ligger i blodbanan bildas snabbt en beläggning bestående av olika plasma- och extracellulära proteiner som t ex fibrin och fibronektin, vilket bakterierna kan dra fördel av genom uttryck av specifika

cellytereceptorer i syfte att kunna fästa bättre (5-7). Processen är dock komplex och mycket är fortfarande okänt om dessa adhesiner hos S. epidermidis (5). Den initiala adhesionen följs av ackumulering av bakterien till ett multilager av celler och produktion av en extracellulär polysackarid substans (PIA, polysaccharide intercellular adhesin) delaktig i

biofilmproduktionen (figur 1) (4,5,8-10).

Figur 1. Förenklad princip för bakteriekolonisation och biofilmproduktion på ytan av en intravasal kateter. Figuren är modifierad från (11).

Förutom förmågan till vidhäftning och bildning av biofilm uppvisar KNS ofta multipel antibiotikaresistens vilket försvårar antibiotikabehandlingen (4,5). Spridningen av resistenta hudflorebakterier i sjukhusmiljön anses vara en bidragande orsak till detta (9,12). Bakterier i en biofilm är heterogena avseende tillväxt och en del av dess population befinner sig i en långsamt växande eller inaktiv stationär fas, i vilken de är mindre känsliga för till exempel cellväggsantibiotika och detta försvårar ytterligare antibiotikabehandlingen (13). S.

epidermidis har dessutom en komplex förmåga till fenotypisk förändring avseende vidhäftning, biofilmsproduktion, antibiotikaresistens och tillväxthastighet, vilket gynnar bakteriens överlevnad och vidare etablering under förändrande omgivningsförhållanden (9,10,12).

Det är framför allt hos immunsupprimerade patienter som en KNS-orsakad infektion kan få allvarliga följder. Till skillnad från S. aureus har S. epidermidis få cytotoxiner varför infektioner med dessa ofta är subakuta eller kroniska, och kan ha ett stillsamt förlopp med endast måttlig feber och diskreta allmänna symtom (5). Detta faktum tillsammans med att KNS finns rikligt i hudens normalflora gör att kontaminering kan vara svår att skilja från en

riktig infektion när odlingar från till exempel en kateter skall bedömmas. Infektionerna kan därför vara svårvärderade samt ibland också svårbehandlade (1,5,14).

Central venkateter (CVK)

Inom modern sjukvård har behovet av centrala venkatetrar (CVK) blivit oumbärligt. De största användningsområdena för CVK inkluderar anestesi- samt intensivvården. Indikationer för inläggning av CVK är bland annat behovet av snabba, stora eller långvariga

infusionsbehandlingar. Det finns många olika varianter av CVK avsedda för kort-, intermediär-, eller långtidsbruk. Indikation för insättning avgör valet av variant (15,16). Inläggningen av CVK är en invasiv åtgärd som likställs med operativt ingrepp. Detta

innefattar därför också behovet av steril handläggning under ingreppet. För att minska risken för infektion bör katetersystemet också hanteras så sällan som möjligt samt med aseptisk teknik (15).

Vårdrelaterade infektioner är den vanligaste komplikationen som drabbar sjukhusvårdade patienter. CVK tenderar dessvärre till att fungera som en ingångsport för hudens normala flora varför inläggning av dessa ger en ökad risk för att drabbas av vårdrelaterade infektioner. Infektionsrisken med CVK ökar för varje kateterdag samt för varje manipulationstillfälle. Risken för att en patient ska drabbas av kateterrelaterade infektioner i blodet påverkas dessutom av typ av kateter, samt på patientens underliggande sjukdomar (16).

Förekomst av antalet infektioner som uppstår under en viss tidsperiod benämns incidens. Inom intensivvården är incidensen för kateterrelaterade infektioner högre än i övrig vård. Detta beror bland annat på det faktum att dessa patienter ofta har katetrarna en längre tid, på frekventare manipulering av dessa, samt på att patienterna koloniseras med resistenta

bakterier från sjukhusmiljön där antibiotikatrycket är stort (16). Incidensen för bakteriemi på olika intensivvårdsavdelningar vid användandet av CVK ligger mellan 2,3–16,8 fall per 1000 kateterdygn (7).

En lokal infektion på utsidan av katetern karakteriseras av rodnad, svullnad och ömmande hud, samt ibland även var eller vätskebildning vid insticksstället (15). Förutom lokal infektion på utsidan kan även lokal infektion runt katetern inuti kroppen uppstå (6). Bakteriemi

definieras som förekomst av bakterier i blodomloppet oavsett symtombild eller kliniska konsekvenser. Ibland leder bakteriemin till en systemisk infektion via blodet, vilket karakteriseras av feber och frossa (15). Förutom risken för allvarliga följder för patienten

såsom septiska nedslag på hjärtklaffar eller i leder och skelett, förlänger infektionerna vårdtiden och är kostsamma för vården (7).

Definitionen av kateterrelaterad infektion i blodet kräver förutom kliniska symtom påvisning av samma mikroorganism från blodet och kateterspetsen, samt att infektionen inte förklaras av någon annan källa (6). Identifikationen sker oftast genom artpåvisning samt antibiogram (14). En korrekt ställd diagnos är viktigt då patienter riskerar onödig antibiotikabehandling och borttagande av kateter på felaktiga grunder. Detta kompliceras av att KNS fynd är

svårvärderade eftersom dessa även kan indikera kontamination från hud eller kateterkolonisation utan betydelse för infektion (14).

Vid utodling av borttagna CVK från patienter resistensbestäms bara några enstaka kolonier. Detta gör det lätt att missa en eventuell förekomst av flera olika stafylokock-kloner (14). Förekomst av flera olika kloner kan indikera fenotypisk variation, polyklonal infektion eller kontamination (17). Med anledning av detta är det av intresse att undersöka om CVK koloniseras av en eller flera olika KNS-kloner.

Typning av bakterier

Typning av bakterier innebär undersökning om likhet eller skillnad föreligger under artnivå. Den förutsätter därmed oftast att en korrekt artidentifikation redan skett. Typning kan behövas vid epidemiologiska, ekologiska och nosokomiala undersökningar, samt vid diagnostik av specifika patogena kloner och vid olika forskningsprojekt. Önskvärda egenskaper för en typningsmetod är hög reproducerbarhet och god diskrimineringsförmåga. Även

materialtillgängligheten, kostnaden, samt behovet av speciellt inköpt apparatur och utbildning av personal är av betydelse (18).

Bakterietypning kan utföras på olika sätt. Genotypning innebär en jämförelse på DNA nivå. Den mest använda metoden för detta i samband med analys av bakterier är

pulsfältgelelektrofores (PFGE) i vilken DNA klyvs med restriktionsenzymer och separeras i ett elektroforesfält där strömriktningen ändras med små pulsationer. Likheten i bandmönstret hjälper till att avgöra samhörighet (1). PFGE anses vara en väldiskriminerande typningsmetod för KNS (14). Metoden är dock arbetssam och dyr (1).

Vid fenotypning av bakterier analyseras istället uttrycket från bakteriecellen. Detta kan ske på olika sätt såsom jämförelse av koloniutseende, antibiotikaresistensmönster, eller genom

biotypning med biokemiska reaktioner. Jämfört med PFGE fungerar dock dessa typningsmetoder sämre diskriminerande för KNS (14).

Phene Plate system (PhP)

Phene Plate system (PhP) är en automatiserad biokemisk fingerprinting metod som fenotypiskt diskriminerar mellan olika kloner inom en art beroende på deras metabola förmåga. Metoden utvecklades 1985 av R. Möllby och I. Kühn vid Karolinska institutet, Stockholm. Från början var metoden utarbetad för typning av Escherichia coli, men den anpassades senare även för typning av andra bakteriearter (18).

Viktiga användningsområden för PhP är epidemiologiska, nosokomiala eller ekologiska undersökningar. Metoden är användbar för många metabolt aktiva bakteriegrupper (18). Då bakterieisolat med samma genotyp har liknande metabol förmåga och därav fenotyp

överensstämmer typning utförd med PhP till stor del med genotypning med PFGE (19). Utöver gener påverkas också den biokemiska fenotypen av genregulatoriska mekanismer samt skillnader i substrattransport. Till skillnad från biotypning med exempelvis API Staph-ident system som enbart ger positiva och negativa resultat, analyseras den metabola förmågan vid typning med PhP både kvantitativt samt dynamiskt genom avläsning vid flera tillfällen i en rad olika biokemiska reaktioner. Detta ger förmågan till diskriminering inom arter att jämföra med biotyping som används till att skilja mellan olika arter. PhP kan även användas som en första screening för vidare analys med andra metoder (18).

Gemensamt, oavsett vilken bakteriegrupp som avses att undersökas, är att analysen sker i suspensionsmedium i prefabricerade 96-håls mikroplattor med dehydrerade reagenser, och att testresultaten avläses 3 till 4 gånger under inkubationstiden vid specifika intervall.

Inkubationstider och reagenser som valts ut från ett reagensbibliotek innehållande 96 stycken olika reagenser är noga anpassade efter tilltänkt bakteriegrupp för maximal diskriminering (18). För typning av KNS används 22 olika reagenser samt 2 negativa brunnar (20).

Inför analys odlas tilltänkta bakterier på näringsrik agar. Därefter slammas bakterierna upp i suspensionsmedium med något varierande innehåll beroende på bakteriesort. För KNS innebär detta pepton och jästextrakt som näringskälla i fosfatbuffrad natriumklorid (20). Till mediet tillsätts en indikator, oftast bromtymolblått (BTB), som gör att det vid

Koncentrationen av BTB som bör vara 0,11% mäts som absorbans med hjälp av en spektrofotometer och justeras vid behov med vatten alternativt mera BTB (20).

En bestämd volym bakteriesuspension tillsätts till varje brunn. Därefter inkuberas plattorna och absorbansen för reaktionerna mäts vid 620 nm vid för minst 3 tillfällen med hjälp av en mikrotiterplattläsare (18). För mätning av KNS innebär detta mätning efter 16, 40 samt efter 64 timmar (20).

Absorbansen från mätningarna överförs till en dator och med hjälp av dataprogrammet PhP software bearbetas data. Reaktionsresultaten fås som heltal i en skala från 0 vid sura

reaktioner (gula), till 25 vid basiska reaktioner (blå). De individuella absorbansmätningarna multipliceras med en faktor på 10 varefter medeltalen för resultaten för de individuella isolaten vid de olika tidpunkterna räknas ut. Därefter jämförs resultaten för de olika isolaten med varandra parvis och graden av likhet mäts med hjälp av korrelationskoefficienten (r). Jämförelse mellan N isolat ger N(N-1)/2 korrelationskoefficienter. Utifrån detta skapas ett dendrogram. Isolat med samma eller nära relaterade biokemiska profiler bedöms vara av samma PhP-typ, det vill säga betraktas tillhöra ett gemensamt kluster. Gränsen för detta sätts genom en korrelationskoefficient på ≥0,975 (figur 2) (18).

Figur 2. Princip för databearbetningen med Phene Plate system. a) Absorbans mätt vid 3 tillfällen för ett isolat testat med 12 olika reagenser. b) Biokemiska profiler för 10 isolat testade med 12 reagenser var. c) Visar likheten för isolaten uppnått efter parvisa jämförelser genom korrelationskoefficient x 100. * indikerar samma PhP-typ. d) Ett dendrogram skapas genom att klustra data. e) Biokemiska fenotyper identifierade bland de 10 testade isolaten. Figuren är modifierad från (18).

Syfte

Syftet med denna studie var att undersöka hur ofta en eller flera olika KNS-kloner

förekommer på CVK från patienter, samt om det förekommer gemensamma kloner av KNS på CVK från olika patienter.

Material och metod

Material

Till studien användes utodlingsvätskor från positiva rutin CVK odlingar med växt av KNS tagna mellan åren 2004-2009 som fanns sparade i -70oC frys på Laboratoriemedicin, Klinisk mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro (USÖ). Av 108 utodlade prov visade det sig inte finnas någon eller otillräcklig bakterieväxt i 42 av proverna. Totalt kunde således 66 stycken CVK prov analyseras. I samtliga fall, med ett undantag då två prov kom från en patient taget med 4 dagars mellanrum, kom proven från olika patienter. Dessutom användes en

referensstam, S. epidermidis RP62A (ATCC 35984) med syfte att fungera som en intern kontroll för säkerställning av god reproducerbarhet. Denna stam är ursprungligen ett kliniskt isolat från en patient med CVK relaterad sepsis.

Odlingsmetodik

Proverna tinades och odlades ut på blodagarplattor (Columbia Blood Agar Base (4,3% Acumedia Neogen Corporation, Lansing, MI, USA) supplementerat med 6% defibrinerat hästblod (SVA, Uppsala, Sverige)). Referensstammen odlades om från föregående agarplatta inför varje analystillfälle. Agarplattorna inkuberades aerobt i 37°C över natten.

Provberedning och inkubering i PhP-plattor

Då olika utseenden på kolonier fanns togs sådana, i övrigt valdes slumpmässigt kolonier, sammanlagt 7 till 8 stycken ut från varje agarplatta för vidare analys. Vid varje provtillfälle analyserades även referensstammen före samt efter övriga prov. Kolonierna suspenderades i separata sterila rör innehållande 8 ml suspensionsmedium (0,2% pepton, 0,05% jästextrakt, 0,5% NaCl, 0,011% BTB, 0,004M fosfatbuffert, absorbansvärde mellan 1,9-2,2). Efter 30 minuter vortexades rören för homogenisering och från varje rör tillsattes 150µl

bakteriesuspension var till de 24 brunnarna avsedda för ett KNS prov i prefabricerade 96-håls PhP-plattor innehållande frystorkade reagenser (PhP-CS: fruktos, galaktos, mannos, D-xylos, L-arabinos, D-ribos, maltos, laktos, sukros, trehalos, turanos, melezitos, mannitol, xylitol,

D-arabinos, glycerol, deoxyribos, β-meglukosid, arbutin, urea, ornithin, och arginin, PhPlate AB, Stockholm, Sverige). Plattorna inkuberades med lock i fuktig kammare i 37°C.

Absorbansmätning och databearbetning

Absorbansen mättes vid våglängden 620 nm efter 16, 40 samt efter 64 timmars inkubation med en spektrofotometer (Labsystems Multiscan MCC/340, Helsingfors, Finland) avsedd för mikrotiterplattor. Datan överfördes automatiskt till en dator och bearbetades med hjälp av PhP software (PhPlate AB, Stockholm, Sverige) genom parvisa jämförelser av likhet och skapande av dendrogram. Jämförelsen gällde kolonier analyserade från CVK för patienter var för sig samt mellan CVK prov från olika patienter. Dessutom studerades reproducerbarheten med intra-assay variationen för RP62A genom beräkning av dess korrelationskoefficienter för varje enskilt analystillfälle (10 st.), samt beräkning av medelvärdet och standardavvikelsen för dessa, och inter-assay variationen genom jämförelse av den totala

korrelationskoefficientvariationen för RP62A mellan samtliga analystillfällen.

Resultat

Klonalitet hos KNS isolerade från CVK

Totalt analyserades 512 kolonier från 66 stycken CVK-prov för undersökning av antalet KNS-kloner per prov. Då en korrelationskoefficient på ≥ 0,975 användes som strikt gräns för att bedömmas tillhöra en gemensam PhP-typ eller klon resulterade detta i 37 stycken CVK prov innehållande en klon, 23 stycken prov där det fanns 2 separata kloner, samt 6 prov med 3 kloner. Figur 3 visar ett representativt exempel på ett prov där alla analyserade kolonier klustrar tillsammans och representerar en gemensam klon.

Figur 3. Exempel på prov med ett kluster representerande en KNS-klon. Streckad linje

markerar korrelationskoefficient 0,975. De första två siffrorna i provnumret anger

Av de 23 prov innehållande 2 separata kluster var fördelningen av antalet kolonier mellan klustren oftast ojämn (se tabell 1 för fördelning).

Tabell 1. Visar kolonifördelningen för 23 st. prov innehållande 2 separata kluster var

Antal analyserade kolonier/prov Kolonifördelning i klustrena Prov (n) 8 st. 7 st.

1+7 / 1+6 13 10 3

2+6 / 2+5 7 4 3

3+5 / 3+4 2 2 −

4+4 1 1 −

avisasmed 2 separata alternativ / rad då antalet analyserade kolonier i prov var 7 eller 8 st.

För de 6 prov som innehöll 3 kluster var, utgjordes kolonifördelningen av 3 prov med 1+2+5 kolonier samt 1 prov vardera innehållande 2+2+3, 2+3+3 och 1+3+4 kolonier i separata kluster.

Jämförelse av gemensamma kloner mellan olika CVK-prov

Jämförelsen av kolonier ur prov från olika patienter resulterade i kluster med många gemensamma PhP-typer, vilket kan ses i figur 4. I de 3 största klustren fanns 31, 15,

respektive 8 kolonier representerande olika patienter. Utöver dessa fanns även några mindre kluster. Även RP62A klustrade med vissa kolonier från dessa patientprov. I fallet där två prov kom från samma patient klustrade kolonierna från dessa prov med varandra (se figur 5).

Figur 5. Dendrogram i vilket två prov (050112 och 050126) som kom från samma patient taget med 4 dagars mellanrum utgör ett kluster. Streckad linje

markerar korrelationskoefficient 0,975.

Figur 4. Dendrogram med en representant ur varje kluster från varje patientprov, samt referensstammen RP62A från alla analystillfällen. De första två siffrorna i provnumren anger

provtagningsår. Streckade linjen markerar korrelationskoefficient 0,975. markerar representant från monoklonala prov. markerar kolonier som ensamt särskijlt sig från resten av kolonierna i sina respektive prov (innefattar både prov med 2 och 3 separata kluster).

Intra- och inter-assay variation för RP62A

Intra-assay variation: korrelationskoefficienten för RP62A låg vid de 10 analystillfällena mellan 0,957-0,994, med medelvärdet 0,980 och standardavvikelsen 0,011. Vid 8 av 10 tillfällen var korrelationskoefficienten ≥ 0,975. Vid de två övriga tillfällena var

korrelationskoefficienten 0,973 samt 0,957.

Inter-assay variation: korrelationskoefficientvariationen för RP62A för samtliga analystillfällen visas med figur 6.

Figur 6. Dendrogram som visar den totala korrelationskoefficientvariationen

för referensstammen RP62A mellan de samtliga 10 analystillfällena (för

förståelse: exempelvis är RP62A 1 och 2 från första analystillfället där RP62A 1 analyserades först och RP62A 2 sist efter patientproverna). Några exempel på korrelationskoefficienter: mellan RP62A 1 och 2 = 0,978, RP62A 15 och 16 = 0,973, RP62A 13 och 17 = 0,988, och mellan RP62A 17 och 18 = 0,980. Streckad linje markerar korrelationskoefficient 0,975.

Diskussion

Med den ökade medicinska användningen av främmande material i kroppen såsom CVK har KNS blivit en viktig orsak till sjukvårdsrelaterade infektioner (3-5). Denna studie syftade till att undersöka hur ofta en eller flera olika KNS-kloner förekommer på en CVK från patienter, samt om det förekommer gemensamma kloner av KNS på CVKer från olika patienter.

Studiens resultat tyder på att de flesta CVK-kolonisationer med KNS är monoklonala (56% av studiens prov klassades som monoklonala). Studien visar dock också en betydande andel, 44%, av polyklonal kolonisation. Då fynd av KNS i CVK i grunden är svårvärderade ökar en polyklonalitet denna svårighet eftersom den ju kan indikera kontamination (14,17). Detta kan dock också innebära att en sann polyklonal infektion föreligger, eller tyda på fenotypisk variation hos klon som selekterats fram av förändringar i omgivningen, resulterande i olika PhP-typer (17).

Polyklonaliteten kan få en klinisk betydelse då det föreligger risk att missa detta vid en undersökning av enstaka kolonier (14). Detta leder till risken att endast en mindre resistent klon resistensbestäms slumpmässigt, vilket då i slutändan kan få konsekvensen att felaktig antibiotikabehandling av patienten sker. Hur ofta olika kloner i denna studies patientprov har från varandra skilda resistensmönster är inte undersökt, men risken för detta finns. Resultatet tyder också på att de flesta analyserade kolonier i denna studie utgjordes av S. epidermidis då de har stor fenotypisk likhet avseende metabolismen med referensstammen RP62A. I denna studie utfördes ej artbestämning men valida fenotypiska och genotypiska metoder för detta finns, såsom API respektive rpoB sekvensering (21).

PhP-systemet är en enkel metod att utföra som möjliggör jämförelser av ett stort antal prov. Då det är en fenotypisk metod finns dock alltid en liten risk för felaktiga avvikelser i resultat. Detta kan ses av resultatet för RP62A vid ett analystillfälle. Vad som orsakade denna

avvikelse är svårt att veta. Det kan till exempel ha berott på den mänskliga faktorn vid pipettering, eller på kontamination av brunnar. Dock visar analysresultaten för RP62A att metoden fungerat bra för denna vid övriga tillfällen.

I figur 6 ser referensstammen, förutom att särskilja sig mot övriga med koloni RP62A 1, ut att ha grupperats ihop i två separata kluster. Korrelationskoefficienten för RP62A 17 och 18 visar dock att det mellan dessa kluster kan finnas kolonier som korrelerar väl med varandra (dvs. har en korrelationskoefficient >0,975), likaså korrelationskoefficienten mellan RP62A 1 och 2, medan exemplet med RP62A 15 och 16 visar motsatsen då dessa kolonier som klustrats

ihop inom samma kluster inte korrelerar lika väl med varandra. Detta lite missvisande mönster kan uppkomma då det statistiska programmet i PhP software jämför alla kolonier med varandra och försöker finna vissa grupper av kolonier som är mera lika varandra än andra. Dock visar en direkt jämförelse mellan parvisa kolonier alltid samma

korrelationskoefficient.

Då en strikt korrelationskoefficientgräns används för bestämning av klustertillhörighet finns en risk för felaktiga resultat i fall där kolonier hamnar strax innanför eller utanför gränsen. Figur 7 visar ett exempel på detta med ett prov från denna studie som klassades monoklonalt, och figur 8 med ett prov som resulterade i två separata kloner. För att verifiera relevansen av dessa resultat skulle genotypning med en DNA-baserad metod som exempelvis PFGE behöva utföras. Detta är möjligt då kolonier från denna studie är nedfrysta men det ligger dock

utanför ramen för detta arbete.

I fallet där kolonierna från två prov som kom från samma patient klustrade ihop, visar PhP-systemet att dessa prov utgjordes av samma bakterieklon. Intressant är dock att det vid en granskning av resistensmönstren gjorda vid analys i samband med provtagningstillfällena för

Figur 7. Exempel på ett

monoklonalt klassat prov med ett kluster där

korrelationskoefficienten mellan två grupper av kolonier i ett prov hamnat på gränsen, dvs. ≥ 0,975 (streckade linjen markerar 0,975) .

Figur 8. Exempel på ett prov som klassats ha två separata kluster, där det mindre klustret hamnat strax utanför

korrelationskoefficientgräns ≥0,975(streckade linjen markerar 0,975).

dessa prov ser ut att vara två olika bakteriestammar, då de skiljer sig i mönstret för ett antibiotikum.

Orsaken till att det i många fall fanns en koloni som särskiljde sig från resten är svår att peka ut. Det kan bero på att mängden bakterier av den avvikande klonen var underrepresenterad i provet vilket ledde till att enbart en av dessa kolonier analyserades. En jämförelse mellan dessa kolonier från samtliga olika CVK prover visar låg korrelation, vilket talar emot en kontamination från en gemensam källa. En granskning av figur 4 tyder på att många av dessa kolonier kan utgöras av en annan stafylokockart än S. epidermidis då de visar stor skillnad i korrelation jämfört med det stora klustret som kan antas utgöras av S. epidermidis. Då PhP-systemet inte fungerar artbestämmande finns också en risk att kolonierna i vissa av dessa fall inte representeras av KNS. För minimering av denna risk undersöktes dock vid behov

morfologiskt avvikande kolonier med katalas-, coagglutinations- samt koagulastest och genom direktmikroskopi med Gram-färgning. Det är dessutom möjligt att ett större urval genom fler antal analyserade kolonier per prov kunde ha lett till fynd av ytterligare kloner i vissa prov, men valet av antalet representerar ändå ett större antal kolonier än det antal som vanligtvis analyseras vid resistensbestämning av dessa prov. En vidare granskning av figur 4 visar också att flertalet av prov klassade som monoklonala sannolikt utgörs av S. epidermidis (se figur 4).

Att många olika patientprov hade en gemensam KNS-klon tyder på spridning av speciellt virulenta stammar i sjukhusmiljön. Denna spridning gynnas av faktumet att många av dessa patienter är svårt sjuka och ofta är inlagda på sjukhus under en längre tid samt blir utsatta för bred antibiotikabehandling. Intressant är också att notera att RP62A som har sitt ursprung från en katetersepsis från USA klustrar med KNS isolerade från CVK från patienter vårdade inom Örebro län.

Slutsatser

Polyklonal kolonisation av CVK med KNS noterades med 44% i denna studie, vilket vid rutinmässig antibiotikaresistensbestämning av endast enstaka kolonier från prov kan utgöra en risk att missa en mera resistent klon. Detta kan i värsta fall leda till felaktig

antibiotikabehandling av patienten. Jämförelsen av kolonier från olika patientprov resulterade i kluster med gemensamma PhP-typer vilket indikerar på att samma eller nära besläktade KNS stammar sprids i sjukhusmiljön.

Omnämnanden

Jag vill tacka min handledare Bo Söderquist för all hjälp och stöd under studiens gång och med bearbetningen av min uppsats. Jag vill även tacka min bihandledare Anna Önnberg för all praktisk hjälp med bland annat metoden Phene Plate system, samt för alla goda råd under studiens gång. Slutligen vill jag tacka all personal på mikrobiologen för all hjälp, goda råd och trevligt bemötande.

Referenser

1. Forbes B A, Sahm D F, Weissfeld A S. Bailys & Scott´s diagnostic microbiology. 12th ed. China: Mosby Elsevier; 2007. p. 254-6.

2. Bauman RW. Microbiology; Alternate edition with diseases by body system. USA: Pearson Benjamin Cummings; 2006. p. 541.

3. Phaller MA, Herwaldt LA. Laboratory, clinical, and epidemiological aspects of coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev. 1988; 1(3): 281-99.

4. Ryan K J, Ray C G. Sherris medical microbiology; an introduction to infectious diseases. 4th ed. USA. McGraw-Hill; 2004. 270-1.

5. Von Eiff C, Peters G, Heilmann C. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. Lancet Infect Dis. 2002; 2:677-85.

6. Edgeworth J. Intravascular catheter infections. J Hosp Infect. 2009; 73:323-30.

7. Isaksson B, Agvald-Öhman C. Infartsrelaterade infektioner i blodbanorna. Ingår i Tegnell A, Carlson J (red). Att förebygga vårdrelaterade infektioner. Ett kunskapsunderlag. (167-178). Stockholm. Socialstyrelsen.[online] Tillgänglig:

http://www.socialstyrelsen.se/Lists/Artikelkatalog/Attachments/9629/2006-123-12_200612312.pdf [Läst 2010-03-17]

8. Götz F. Staphyloccocus and biofilms. Mol Microbiol. 2002; 43(6): 1367-8.

9. Petrelli D et al. Analysis of different genetic traits and their association with biofilm formation in Staphylococcus epidermidis isolates from central venous catheter infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2006; 25:773-781.

10. Ziebuhr W et al. A novel mechanism of phase variation of virulence in Staphylococcus epidermidis: evidence for control of polysaccharide intercellular adhesin synthesis by alternating insertion and excision of the insertion sequence element IS256. Mol Microbiol. 1999; 32(2): 345-356.

11. Granslo H, Gammelsrud KW, Fredheim EA, Flaegstad T, Klingenberg C. Biofilm og antibiotikaresistens hos koagulasenegative stafylokokker. Tidsskr Nor Legeforen. 2008; 128(23): 2746-9.

12. Ziebuhr W et al. Detection of the intercellular adhesion gene cluster (ica) and phase variation in Staphylococcus epidermidis blood culture strains and mucosal isolates. Infect Immun. 1997; 65: 890-6.

13. Aparna MS, Yadav S. Biofilms: microbes and disease. Braz J Infect Dis. 2008; 12(6): 526-30.

14. Casey AL, Worthington T, Lambert PA, Elliot TSJ. Evaluation of routine microbiological techniques for establishing the diagnosis of catheter-related bloodstream infection caused by coagulase-negative staphylococci. J Med Microbiol. 2007; 56: 172-6.

15. Sveriges kommuner och landsting/regioner. Handbok för hälso- och sjukvård; Central venkateter. 2008-06-23(2009-0601). [online]

Tillgänglig:http://www.sjukvardsradgivningen.se/handboken/06_article.asp?CategoryId=3 945&ParentId=3944&ChapterId=3945&Preview [Läst 2010-03-17]

16. O´Grady NP et al. Guidelines for the prevention of intravascular catheter-related

infections. Centers for disease control and prevention. MMWR. 2002;51 (No. RR-10): 1-29.

17. Nilsdotter-Augustinsson Å, Koskela A, Öhman L, Söderquist B. Characterization of coagulase-negative staphylococci isolated from patients with infected hip prostheses: use of phenotypic and genotypic analyses, including tests for the presence of the ica operon. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007; 26: 255-65.

18. Möllby R, Kühn I, Katouli M. Computerised biochemical fingerprinting- a new tool for typing of bacteria. Rev Med Microbiol. 1993; 4:231-41.

19. Kühn I, Burman L G, Hæggman S, Tullus K, Murray B E. Biochemical fingerprinting compared with ribotyping and pulsed-field gel electrophoresis of DNA for

epidemiological typing of Enterococci. J Clin Microbiol. 1995; 33(11): 2812-7. 20. Manual for the phene-plate system. 2007. [www dokument]. Tillgänglig:

http://www.phplate.se/ [Hämtad 2010-03-14].

21. Hellmark B, Söderquist B, Unemo M. Simultaneous species identification and detection of rifampicin resistance in staphylococci by sequencing of the rpoB gene. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2009; 28(2): 183-190.