Kemiskt försvar mot havstulpanskolonisering i marina svampdjur

(1)

Examensarbete

Kemiskt försvar mot havstulpanskolonisering i marina

svampdjur

Nina Bohlin

2013-06-19

LITH-IFM-G-EX--13/2819—SE

Linköpings universitet Institutionen för fysik, kemi och biologi 581 83 Linköping

(2)

Institutionen för fysik, kemi och biologi

Kemiskt försvar mot havstulpanskolonisering i marina

svampdjur

Nina Bohlin

Examensarbetet utfört vid Sveriges tekniska forskningsinstitut

2013-06-19

Handledare: Mia Dahlström

(3)

(4)

Innehåll

Sammanfattning ... 5 Abstract ... 6 Förord ... 7 Inledning ... 8 Utförande ... 10 Larvtester... 10 Ellipsometriska tester ... 11 Resultat ... 11 Larvtester... 12 Hydrofob 12-05-21 ... 12 Hydrofob 12-04-06 ... 13 Hydrofil 12-06-11... 16 Hydrofob 12-06-18 ... 19 Ellipsometri ... 22 Diskussion ... 26 Slutsats ... 28 Källor ... 29

(5)

Sammanfattning

Syftet med arbetet är undersöka adsorptionen av ämnena ivermectin, spinosad och barettin till hydrofoba respektive hydrofila ytor samt att ta reda på om havstulpanslarven påverkas när de försöker kolonisera på den behandlade ytan.

Inkuberingstester med havstulpanslarver i petri-skålar har utförts samt adsorptionstester på hydrofoba och hydrofila ytor som sedan testat med ellipsometri för att bestämma yttjockleken Havstulpanslarver placerades i hydrofoba samt hydrofila petri-skålar som inkuberades med ivermectin, spinosad eller barettin. Efter fyra till sex dagar kontrollerades skålarna och larverna räknades för att analysera påväxten. Utifrån resultaten drogs slutsatser om ämnenas

adsorptionsförmåga till de respektive ytorna.

För att analysera ämnenas adsorptionsförmåga preparerades kiseloxidplattor med hydrofoba respektive hydrofila poly-dimetylsiloxangrupper samt albumin. Dessa analyserades sedan med ellipsometri.

Larvernas dödlighet var mycket stor i de första försöken, vilket kan förklaras av att larverna

förvarades för kallt de första dygnen, vilket ledde till att de dog. Det kan även ha berott på att de blev kontaminerade då håven som användes kom i kontakt med alla ämnens koncentrationer.

Standardavvikelserna för ellipsometrin är mycket stor, troligtvis på grund av ojämn adsorption av ämnena till ytan. Med fler tester och mätningar hade mer exakta resultat kunnat erhållas.

(6)

Abstract

The purpose of this project is to analyze and study the absorption of the substances ivermectin, spinosad and barettin to hydrophobic and hydrophilic surfaces, and to analyze and study if the barnacle larva are effected when they try to settle on the treated surface.

Incubation tests with barnacle larva in Petri dishes were performed as well as absorption tests on hydrophobic and hydrophilic surfaces which were tested with ellipsometry. To determine the surface thickness.

The barnacles were placed in hydrophobic as well as hydrophilic Petri dishes that had been incubated with ivermectin, spinosad or barettin. After four to six days the larva was counted to analyze the settling. From the results conclusions could be drawn about the adsorption abilities of the substances to the different surfaces.

To analyze the adsorption abilities, pieces of silicon oxide were prepared with hydrophobic and hydrophilic poly dimethyl siloxan groups, and albumine. The pieces were then analyzed with ellipsometry.

The larva's mortality was very high in the first tests. It can be explained with them being stored too cold the first days, which might have caused their death. It might also be because of contamination from the net used to move the larva, since it was in contact with all the substances concentrations. The standard deviations from the ellipsometry tests are very high, most likely due to uneven adsorption of the substances to the surface. With more tests and measurements, more accurate results could have been sustained

(7)

Förord

Jag vill tacka alla som har hjälpt mig med det här arbetet. Framför allt min handledare Mia Dahlström och mina examinatorer Thomas Ederth och Hans–Björne Elwing för ert stöd, support och stora tålamod. Även tack till Pentti Tengvall för hjälp och support med ellipsometern. Tack till min opponent Emma Thorsensson för förslag och återkoppling, samt ett gott samarbete.

Ett mycket stort tack till min familj som alltid hejar på mig, och framför allt till Lily, Nela och Gary som lät mig bo hos sig under arbetets gång och alltid muntrade upp mig med glada tillrop. Tack till min underbare fästman Patrik som alltid håller mig vid gott mod.

(8)

Inledning

Marin påväxt är ett stort miljöproblem, både i form av de gifter som båtfärger utsöndrar och genom att påväxten till viss del påverkar farkosters framkomlighet i vatten, vilket i sin tur leder till ökad bränsleförbrukning och därigenom till ökade utsläpp av växthusgaser. Framför allt kolonisering av havstulpaner är ett stort problem då de utgör en stor del av påväxten samt att de är omständiga att avlägsna.

Examensarbetet har inneburit en studie om hur havstulpanslarver påverkas vid närvaro av ämnena ivermectin, spinosad respektive barettin på hydrofoba och hydrofila ytor när de ska metamorfosera och sätta sig fast på ytan för att utvecklas till fullvuxna havstulpaner. Även ellipsometriska försök har gjorts där ämnenas adsorption till de olika ytorna har mätts.

Det här examensarbetet är en liten del i ett större forskningsprojekt som går ut på att framställa en båtbottenfärg som inte är baserad på frisättning av de aktiva substanserna, utan hämmar påväxt vid kontakt med ytan. Målet är att färgen helt ska sakna frisättning av aktiva substanser och därmed kan vara aktiv under flera säsonger. De påväxtorganismer som varit främsta målet för projektet är havstulpaner, då de är bland de vanligaste och svåraste organismerna. Arbetet har pågått i flera år och är ett samarbete mellan Sveriges Tekniska Forskningsinstitut och institutionen för kemi och molekylärbiologi vid Göteborgs universitet. Då det här examensarbetet endast är en del av det större projektet har de metoder och ämnen som användes vid tidigare försök även använts i detta arbete. Syftet med arbetet har varit att undersöka om de testade ämnena, ivermectin, spinosad och barettin adsorberas till hydrofoba respektive hydrofila ytor. Även hur ämnenas närvaro på dessa ytor påverkar havstulpanslarverna när de försöker kolonisera har undersökts genom in vitro tester. Arbetet i sig har i inkluderat en kombination av laborativa tester samt litteraturstudier. De artiklar och böcker som har använts erhölls från handledare i början av arbetet och finns presenterad i avsnittet ”Källor”. Den är till stor del skriven av deltagarna i det större projektet. De färger som finns på marknaden idag baseras nästan uteslutande på att en giftig substans, till exempel koppar eller organiska föreningar såsom irgarol och diuron, aktivt läcker från färgskiktet ut i vattnet.1Forskningen inom området pågår ständigt och är framförallt fokuserad på redan kända påväxthämmande substanser, framförallt sådana som finns naturligt i marina svampdjur, då dessa har visat sig vara oskadliga för omkringlevande organismer, eftersom de aktiva substanserna inte läcker ut .2 De tre ämnen som testas i det här arbetet är alla kända och väl studerade inom området, varför just dessa valdes.

I de ellipsometriska mätningarna prioriterades hydrofoba ytor. Dessa är för arbetet de mest

intressanta eftersom cypriderna, havstulpanslarvernas sjunde och sista stadium, använder hydrofobt protein för att vidhäfta vid ytan där de ska metamorfosera.3

En del av resultaten från dessa mätningar jämfördes med ett tvåsidigt ANOVA- test. ANOVA är ett statistiskt test som används för att påvisa skillnader inom och mellan värdeserier. I det här arbetet används det för att jämföra hydrofila ytor mot hydrofoba, samt ytor med albumin mot de utan. Testet går ut på att testa om det skillnaderna mellan de två serierna är systematiska eller slumpmässiga.

1

E. Almeida, T.C Diamantino, O. De Sousa, Marine paints: the particular case of antifouling paints, Progress in Organic Coatings vol. 59 (2007) s. 2–20

2

L. D Chambers, K. R. Strokes, F.C. Walsh, R. J. K. Wood, Modern Approaches to Marine Antifouling Coatings, Surface &Coatings Technology vol. 201 (2006) s. 3642–3652

3_{L. D Chambers, K. R. Strokes, F.C. Walsh, R. J. K. Wood, Modern Approaches to Marine Antifouling Coatings,} Surface &Coatings Technology vol. 201 (2006) s. 3642–3652

(9)

De studerade ämnena är ivermectin (875,1 g/mol), spinosad (734,3 g/mol) och barettin (420,3 g/mol). De två första tillhör gruppen makrolaktoner medan den senare är en cyklodipeptid4, och de har alla återfunnits i marina djur, framförallt i olika sorters tvättsvampar. Där fungerar de som naturligt försvar mot marin påväxt av framförallt havstulpaner5. Ivermectin är ett av flera liknande ämnen kallade Avermectiner6. Det finns två varianter av barettin, se figur 3, och de har båda använts till försöken.

Figur 1. Ivermectin.7

Figur 2. Spinosad.8

4_{E. Hedner, M. Sjögren, S. Hodzic, R. andersson, U. Göransson, P. R. Jonsson, L. Bohlin, Antifouling Activity of a}

Dibromated Cyclopeptide from the Marine Sponge Geodia baretti, Journal of Natural Products, vol. 71 (2008) s.

330–333

5_{A H. Adelsberger, T. Scheuer, J. Dudel, A Patch Clamp Study of a Glutamatergic Chlodide Channel on}

Pharyngeal Muscle of the nematode Ascaris suum, Neurosciense Letter vol. 230 (1997) s. 183–186

6

C. Campbell, M. H. Fischer, E. O. Stapley, G. Albers-Schönberg, T. A. Jacob, Ivermectin: A Potent Antiparasitic

Agent, Science vol. 221(1983) s. 823–828

7

C. Campbell, M. H. Fischer, E. O. Stapley, G. Albers-Schönberg, T. A. Jacob, Ivermectin: A Potent Antiparasitic

Agent, Science vol. 221(1983) s. 823–828

8_{Kollman, W.S Environmental Fate of Spinosad, Depatrment of Pesticed Regulation, Environmental Monitoring} Branch, Sacramento s. 1-16

(10)

Figur 3. Barettin.9

Utförande

Arbetet bestod av två delar. Den ena delen handlade om försök med havstulpanslarver och den andra om mätningar med en ellipsometer.

Larvtester

Havstulpaner går igenom sju olika larvstadier innan de metamorfoserar10 och sätter sig fast på underlaget (klippa, båtskrov, oljerigg, rör etc.) och det är det sista larvstadiet, som kallas för cyprider, som har använts till dessa försök eftersom det är det efterföljande, metamorfoserande, stadiet som ska studeras. De larver som användes för försöken erhölls från Tjärnö marinbiologiska laboratorium. Testerna utfördes genom att stamlösningar med koncentrationen 10mM ivermectin, spinosad och barettin bereddes i dimetylsulfoxid (DMSO). Dessa späddes sedan med filtrerat havsvatten (FSW) till 10 ml med önskade koncentrationer i hydrofila eller hydrofoba petri-skålar. Fyra replikat per koncentration bereddes samt fyra till åtta kontrollskålar med endast FSW. Koncentrationerna 10nM, 100nM, 1µM, 10µM samt 100µM användes. Dock användes inte alla koncentrationer vid varje försök och inte heller till alla ämnen, Allt material, så som substanser, petri-skålar samt FSW erhölls från handledaren.

Skålarna fick stå för inkubering i ett dygn innan lösningarna hälldes av och skålarna sköljdes tre gånger var med FSW. Därefter placerades 15 - 30 cyprider i varje skål. Skålarna, med larver, stod sedan i fyra till sex dygn innan de kontrollerades. Genom stereolupp räknades antalet levande frisimmande larver, antalet döda samt hur många som metamorfoserat på ytan av petri-skålen. Resultaten presenteras nedan.

Både hydrofila och hydrofoba skålar testades för att undersöka om ämnena adsorberades annorlunda till ytan beroende på struktur. Hydrofoba ytor var dock prioriterade, då dessa var de som använts mest tidigare i projektet och hade visat sig vara mest intressanta, eftersom cypriderna använder hydrofobt protein för att vidhäfta till ytan där de ska metamorfosera.11

9

E. Hedner, M. Sjögren, S. Hodzic, R. andersson, U. Göransson, P. R. Jonsson, L. Bohlin, Antifouling Activity of a

Dibromated Cyclopeptide from the Marine Sponge Geodia baretti, Journal of Natural Products, vol. 71 (2008) s.

330–333 10

L. D Chambers, K. R. Strokes, F.C. Walsh, R. J. K. Wood, Modern Approaches to Marine Antifouling Coatings, Surface &Coatings Technology vol. 201 (2006) s. 3642–3652

(11)

Ellipsometriska tester

En ellipsometer fungerar, enkelt förklarat, genom att en laserstråle med känd polarisation skjuts med en viss vinkel mot ytan som ska testas där den reflekteras in i en detektor. Inuti detektorn finns en polariserande analysator som vrids för att ta reda på hur mycket ljusets polaritet har ändrats. Instrumentet kan utav det räkna ut tjockleken av tunna ytor eller skikt på ytan som har bestrålats12. Ellipsometri är en användbar metod då det kan användas till flera olika sorters ytor, organiska och oorganiska såväl som för metaller och halvledare. Det kan även användas för vätskor och i vakuum13. Ellipsometri användes i det här arbetet för att kontrollera om och i vilken utsträckning ivermectin, spinosad och barettin adsorberas till ytor, och för att undersöka om substansernas bindningsförmåga till hydrofoba respektive hydrofila, samt om adsorptionen påverkas om ett protein, i det här fallet albumin, finns inbundet till ytan, då de studerade ämnena lätt binder till protein14.

Till försöken skars 100 stycken 1x1 cm stora plattor av kiseloxid till med hjälp av en diamantpenna och lades i en glasskål. Plattorna tvättades med ammoniak och väteperoxid under upphettning och sköljdes därefter med destillerat vatten. Sedan tvättades de en gång till med saltsyra och väteperoxid under upphettning och sköljdes igen med destillerat vatten. Detta gjordes för att säkerställa att inga föroreningar eller oxidskikt fanns kvar på plattornas ytor.

Därefter hydrofobiserades 50 stycken av plattorna, och 50 hydrofiliserades, med poly-dimetylsiloxaner för att sedan placeras i två petri-skålar med destillerat vatten och några droppar saltsyra som koncentration för att undvika nya kontamineringar på ytorna. Allt detta arbete utfördes utanför examensarbetet av utomstående person, och beskrivs därför inte ingående. Tio plattor av vardera slagen blåstes försiktigt torra med kvävgas och analyserades med ellipsometer för att mäta det genomsnittliga ytskiktet. Medelvärden och standardavvikelse presenteras nedan.

Därefter löstes albumin i PBS-buffert med pH-värdet 7 till en koncentration av 0,5 g/l och i den inkuberades plattorna i ca 15 minuter. Därefter sköljas sedan plattorna med PBS-buffert och destillerad vatten. Ytorna torkades försiktigt med kvävgas och analyserades därefter med ellipsometern.

För att sedan undersöka de aktuella ämnenas adsorption till ytorna läts kiselplattorna inkuberas tio stycken av de hydrofila och tio av de hydrofoba med albumin i ca 60 minuter i lösningar av ivermectin, spinosad och barettin. Alla tre lösningarna hade koncentrationen 4 mg/l. Även tio hydrofila och tio hydrofoba utan albumin inkuberades i ivermectinlösningen. Plattorna sköljdes åter med PBS-buffert och torkades med kvävgas innan de analyserades på ellipsometern.

Resultat

Nedan presenteras resultaten av alla försök och tester. De procentuella resultaten av larvtesterna presenteras i den ordning som testerna utfördes. Av siffrorna som presenteras i varje figur visar det övre värdet den totala mängden larver som användes vid varje enskilt försök.

12

Begnt Wälivaara, In vitro studies of Selected Blood Protein on Solid Surfaces, Linköping Studies in Sience and Technology, Dissertation No 415, 1996

13

Magnus Lestelius, Tailor-made Monolayer Assemblies for In-vitro studies of Blood Protein- Surface

interactions, Linköping Studies in Sience and Technology, Dissertation No 455, 1996

(12)

Larvtester

Vid första försöket, 12-05-02, inkuberades endast ivermectin i koncentrationerna 10 µM och 100 µM, samt kontroller, i hydrofila skålar. När räkningen sedan skulle ske var alla larverna döda. Troliga orsaker tas upp i diskussionsdelen.

Hydrofob 12-05-21

I det här, andra, försöket användes ämnena med koncentrationer som presenteras nedan. Hos ivermectin och spinosad hade flera larver metamorfoserat, men sedan dött och fallit av från sidan av skålen och räknas därför som döda.

Figur 1. Ivermectin 100 µM. Figur 2. Spinosad 100 µM. 0 0% 169 100% 0 0%

Ivermectin 100 µM

Levande (st) Döda (st) Metamorfosedade (st)

0 0% 195 100% 0 0%

Spinosad 100 µM

(13)

Figur 3. Barettin 100 µM.

Figur 4. Kontroll.

Hydrofob 12-04-06

Dödligheten i kontrollerna var mycket stor i det här försöket och möjliga anledningar presenteras i diskussionsdelen. Figur 5. Ivermectin 10 nM. 47 87% 2 4% 5 9%

Barettin 100 µM

47 87% 2 4% 5 9%

Kontroller

36 23% 56 37% 61 40%

Ivermectin 10 nM

(14)

Figur 6. Ivermectin 100 nM. Figur 7. Ivermectin 1 µM. Figur 8. Spinosad 10 nM. 5 4% 110 92% 5 4%

Ivermectin 100 nM

0 0% 151 100% 0 0%

Ivermectin 1 µM

38 30% 44 34% 47 36%

Spinosad 10 nM

(15)

Figur 9. Spinosad 100 nM. Figur 10. Spinosad 1 µM. Figur 11. Barettin 1 µM. 19 12% 70 42% 77 46%

Spinosad 100 nM

35 29% 51 43% 33 28%

Spinosad 1 µM

5%

45% 104

50%

Barettin 1 µM

(16)

Hydrofil 12-06-11

Det här är ett av de få tester som gjordes med hydrofila skålar. Det beror dels på tidsbrist och dels på grund av att de hydrofoba var prioriterade. Testet är ett försök att visa på eventuell skillnad mellan de hydrofila och hydrofoba ytor.

12 8% 70 44% 75 48%

Barettin 10 µM

16 7% 92 41% 118 52%

Kontroller

(17)

Figur 14. Ivermectin 10 nM. Figur 15. Ivermectin 100 nM. Figur 16. Ivermectin 1 µM. 35 51% 30 43% 4 6%

Ivermectin 10 nM

Levande (st) Döda (st) Metamorfosedade (st) 5 10% 46 90% 0%

Ivermectin 100 nM

0 0% 55 100% 0 0%

Ivermectin 1 µM

(18)

Figur 17. Spinosad 10 nM. Figur 18. Spinosad 100 nM. Figur 19. Spinosad 1 µM. 50 62% 13 16% 18 22%

Spinosad 10 nM

40% 15% 34 45%

Spinosad 100 nM

22 34% 18 28% 25 38%

Spinosad 1 µM

(19)

Figur 20. Barettin 1 µM. Figur 21. Barettin 10µM. Figur 22. Kontroll. Hydrofob 12-06-18 48 57% 12 14% 25 29%

Barettin 1 µM

28 30% 44 47% 22 23%

Barettin 10 µM

55 50% 25 23% 30 27%

Kontroller

(20)

Figur 23. Ivermectin 10 nM. Figur 24. Ivermectin 100 nM. Figur 25. Ivermectin 1 µM. 61 86% 8 11% 2 3%

Ivermectin 10 nM

0 0% 81 100% 0 0%

Ivermectin 100 nM

0 0% 81 100% 0 0%

Ivermectin 1 µM

(21)

Figur 26. Spinosad 10 nM. Figur 27. Spinosad 100 nM. Figur 28. Spinosad 1 µM. 32 48% 30 45% 5 7%

Spinosad 10 nM

42 64% 20 30% 4 6%

Spinosad 100 nM

47 52% 35 38% 9 10%

Spinosad 1 µM

(22)

Ellipsometri

I figur 32 nedan presenterar medelvärdena från de olika behandlingarnas mätningar. Kontrollvärdena visar yttjockleken på de behandlade plattorna innan de kom i kontakt med ämnena som skulle testas, det vill säga grundtjockleken efter hydrofob/hydrofil behandling. Några av ämnena uppvisar tunnare

25 33% 3 4% 48 63%

Barretin 1 µM

36 42% 5 6% 45 52%

Barettin 10 µM

12 15% 3 4% 64 81%

Kontroller

(23)

ytor vid vissa behandlingar än vad kontrollvärdena visar. En möjlig orsak till detta presenteras i diskussionsdelen.

Ivermectin var den enda substans som testades på hydrofila plattor då det var det mest intressanta ämnet att testa på. Dessutom har huvudfokus under hela projektet legat på hydrofoba ytor.

Tjockleken på de hydrofila kontrollerna utan albumin är plattorna grundtjocklek. Alla mätvärden nedan anges i Ångström. Felstaplarna visar standardavvikelsen för varje enskild behandling

Figur 32. Resultat från ellipsometrimätningarna.

Medelvärde (Å) Standardavvikelse

Ivermectin

Hydrofob med albumin 96,7 25,01

Hydrofob utan albumin 68,9 14,84

Hydrofil med albumin 24,83 3,43

Hydrofil utan albumin 13,71 2,14

Spinosad

Hydrofil med albumin 18 3,24

Barettin

Kontroll

Hydrofob utan albumin 65,06 14,24

Hydrofil utan albumin 14,82 1,60

0 20 40 60 80 100 120 140 Hydrofob med albumin Hydrofob utan albumin Hydrofil med albumin Hydrofil utan albumin Yttjo kl e k (Å) Behandling

Ellipsometriska tester

Kontroll Ivermectin Spinosad Barettin

(24)

Tabell 1. Statistiska värden från ellipsometrimätningar av yttjocklek.

Ett tvåsidigt ANOVA-test utfördes genom att jämföra alla erhållna mätvärden för

ivermectinbehandlingarna, som presenteras i tabell 2, för att jämföra variationen mellan de hydrofila och hydrofoba ytor, variationen inom de respektive behandlingarna, samt variationen mellan de albuminbehandlade plattorna och de övriga.

Ivermectin Hydrofob Hydrofil

Med Albumin 107 24,1 130 22,1 113 20,1 61 21,1 127 25,8 119 26,6 85,5 28,9 77,1 22,8 89,8 31,8 57,6 25 Utan Albumin 79,1 18,2 60,2 13,4 104 13 68,2 12,7 64,6 15,7 52,5 10,4 57,3 12,4 64,6 12,5 86,6 12,8 62,1 16

Tabell 2. Resultat av ellipsometriska tester med ivermectin.

Resultatet av ANOVA-testet presenteras i tabell 3. De värden som används i jämförelsen är F-värdena som jämförs med krit. sample visar skillnader om ytan är behandlad med albumin eller inte,

F-kolumner visar på skillnader mellan hydrofila och hydrofoba ytor, och F-interaktion visar på skillnader

mellan de två. Värdena jämförs med varandra för att testa om nollhypotesen stämmer. Nollhypotesen innebär att de enda variationsskillnaderna inom och mellan grupperna beror på slumpen. Om F-värdet överstiger F-krit kommer nollhypotesen att förkastas för den gruppen.

ANOVA

Variationsursprung KvS fg MKv F p-värde F-krit

Sampel 3591,025 1 3591,025 14,99383 0,000437 4,113165

Kolumner 41 011,22 1 41 011,22 171,2367 3E-15 4,113165

Interaktion 613,089 1 613,089 2,559869 0,118348 4,113165

Inom 8622,006 36 239,5002

(25)

Tabell 3. Resultat av tvåsidigt ANOVA-test för ivermectin.

Ur tabellen kan konstateras att både F-kolumner och F-sample överstiger F-krit, det vill säga

variationen mellan de hydrofoba och hydrofila plattorna samt mellan de med albuminbehandling och de utan inte beror på slumpen, utan att det finns en systematisk skillnad. Den skillnaden är mycket högre för de hydrofoba och hydrofila plattorna än för albumintestet. Då interaktion understiger

F-krit visar det på att variationen mellan de olika behandlingarna med stor sannolikhet beror på

(26)

Diskussion

Under arbetets gång påträffades en del komplikationer, framför allt i fråga om cypridernas dödlighet. I de första omgångarna av larvtester konstaterades att dödligheten var mycket högre än förväntat. När larverna räknades i första testet konstaterades att alla hade dött. Detta kan ha berott på att de hade förvarats för kallt, i cirka 6-8 °C, innan testet påbörjades och då larverna är känsliga för temperaturer under 11 °C kan det vara en trolig dödsorsak. En annan anledning kan vara att det var den första omgången larver som fötts upp den säsongen i Tjärnös laboratorium, och därmed kan larverna ha varit försvagade från början. Troligast är dock kombinationen av ovanstående var chockande för cypriderna så att de dog innan de hunnit metamorfosera.

I det tredje testet, 12-06-04, var dödligheten i kontrollerna mycket stor vilket kan bero på att kontrollskålarna hade blivit kontaminerade av håven som användes för att flytta över larverna från bunken där de låg till sina testskålar. Samma håv användes till alla ämnen och koncentrationer, varför risken att substanser fanns kvar på ytor i nätet är stor trots noggrann tvättning. Det är också möjligt att några av larverna var döda eller döendes från början, eftersom kontrollskålarna var de sista som fick larver placerade i sig och de levande hade börjat ta slut.

För att undvika kontaminering mellan skålarna skulle fler håvar kunna användas, en per koncentration av varje ämne. Ett alternativ kan vara engångspipetter om kasseras direkt efter användning.

För att kunna dra några slutsatser angående de hydrofila skålarna borde fler mätningar ha genomförts, men då tiden var knapp i kombination med att de hydrofoba skålarna var prioriterade gjordes inte det.

Angående ellipsometrimätningarna kan en möjlig anledning till att spinosad och barettin visar på tunnare ytskikt än kontrollerna vid albuminbehandlingen av de hydrofoba plattorna vara att substanserna i sig löser upp ytskiktet. Det samma gäller för ivermectin och spinosad på de albuminbehandlade hydrofila plattorna och för ivermectin på de hydrofila plattorna utan albumin.15 Medelvärdena från ellipsometrimätningarna visar på skillnader i yttjockleken hos de olika ämnena och behandlingarna, även om standardavvikelsen är mycket stor i vissa fall, speciellt hos de hydrofoba behandlingarna, och gör det därför svårt att dra slutsatser.

En anledning till den stora standardavvikelsen kan vara att de hydrofoba silanolgrupperna adsorberas ojämnt till ytan genom att hydrofobiseringen är en slumpmässig reaktion. Eftersom alla 50 plattor låg i samma skål kan några plattor ha legat ovanpå varandra, så att silanolgrupperna inte kunnat komma åt och fästa in till ytan på de plattor som har legat under andra, medan de som låg fritt har bundit in desto mer. Detta har gjort att skillnaden mellan plattorna har blivit mycket stor. Det i sin tur kan ha gett upphov till att även albuminet och de testade substanserna i sin tur har adsorberats ojämnt till silanolgrupperna. När plattorna sedan testades blev mätvärdena på grund av detta mycket olika.

Torkningen av plattorna skedde genom att kvävgas under högt tryck blåstes, vilket skulle kunna ha deformerat silanolytan och därmed bidragit till tjockleksvariationen.

Fler tester borde göras av både larvförsök och ellipsometrimätningar för att säker data ska kunna erhållas.

15

(27)

(28)

Slutsats

Resultaten av larvförsöken stämmer med de förväntade, det vill säga att substanserna adsorberas till den hydrofoba ytan, finns kvar där även efter att ytan har tvättats och påverkar havstulpanscypriderna när de försöker metamorfosera till den grad att de dör. För få tester gjordes med de hydrofila skålarna för att några slutsatser ska kunna dras.

Försöken med ellipsometer visar på att substanserna eventuellt adsorberas till ytan. De adsorberas däremot mycket ojämnt till ytorna, vilket kan ha bidragit till de varierande resultaten. De respektive standardavvikelserna är dock alldeles för höga för att några slutsatser ska kunna dras endast ur detta.

Utifrån ANOVA-testet som presenterades i tabell 3 kan dock följande konstateras: då

F-krit<F-kolumner och F-krit <F-sample tyder det på en systematisk skillnad mellan hydrofoba och hydrofila

ytor samt om ytan är behandlad med albumin eller inte. Dessutom kan noteras att variationen inom de olika behandlingarna är liten och mest beror på slumpmässigt fel då F-krit>F-interaktion.

Sammanfattningsvis kan sägas att dessa tester kan vara en bit på vägen mot ett resultat, men för att få ett som är tillförlitligt måste fler och mer systematiska tester göras.

(29)

Källor

 H. Adelsberger, T. Scheuer, J. Dudel, A Patch Clamp Study of a Glutamatergic Chlodide

Channel on Pharyngeal Muscle of the nematode Ascaris suum, Neurosciense Letter vol. 230

(1997) s. 183–186

 E. Almeida, T.C Diamantino, O. De Sousa, Marine paints: the particular case of antifouling

paints, Progress in Organic Coatings vol. 59 (2007) s. 2–20

 T.A. Blizzard, C. L. Ruby, H. Mrozik, F.A. Preiser, M.H. Fisher, Brine Shrimp (artemia salina) as

a Convenient Bioassay for Avermectin Analogs, The Journal of Antibiotics, August (1989) W.

s.1304–1307

 C. Campbell, M. H. Fischer, E. O. Stapley, G. Albers-Schönberg, T. A. Jacob, Ivermectin: A

Potent Antiparasitic Agent, Science vol. 221(1983) s. 823–828

 L. D Chambers, K. R. Strokes, F.C. Walsh, R. J. K. Wood, Modern Approaches to Marine

Antifouling Coatings, Surface &Coatings Technology vol. 201 (2006) s. 3642–3652

 N. Dey, Mitigation of Marine Fouling Growth Trough TBT Free Anti Fouling Coating - A

Review, Paintindia November (2011) s. 61–67

 G. Edwards, Ivermectin: Does P-glycoprotein play a role in Neurotoxicity?, Filaria Journal 2 (Suppl 1):S8 (2003)

 N. Fusetani, Antifouling Marine Natural Products, National Product Reports, vol. 28 (2011) s. 400–410

 M.A. García, R.m. Garcinuño, P. Fernández-Hernando, J.S. Durand-Alegría, Liquid

Chromatography-UV Diode-array Detection Method for Multi-residue Determination of Macrolide Antibiotics in Sheep's Milk, Journal of Chromatography vol. 1122 (2006) s. 76–83

 U. Göransson, M. Sjögren, E. Svangård, P. Claeson, L. Bohlin, Reversible Antifouling Effect of

the Cyklotide Cycloviolacin O2 against Barnacles, Journal of Natural Products, vol. 67 (2004)

s. 1287–1290

 E. Hedner, M. Sjögren, S. Hodzic, R. andersson, U. Göransson, P. R. Jonsson, L. Bohlin,

Antifouling Activity of a Dibromated Cyclopeptide from the Marine Sponge Geodia baretti,

Journal of Natural Products, vol. 71 (2008) s. 330–333

 M. Honma, H. Teragaki, H. Takaki, Y. Kiseki, Study of Biocide Release from Antifouling Paints -

Verification of Mass Balance Calculation Method by Actual Measurement, Original Technical

Paper vol.83 (2010) s. 458–463

 A-L. Johnson, J. Bergman, M. Sjögren, L. Bohlin, Synthesis of Barettin, Tetrahedron vol. 60 (2004) s. 961–965

 Kollman, W.S Environmental Fate of Spinosad, Depatrment of Pesticed Regulation, Environmental Monitoring Branch, Sacramento s. 1-16

 M. Lestelius, Tailor-made Monolayer Assemblies for In-vitro studies of Blood Protein- Surface

interactions, Linköping Studies in Sience and Technology, Dissertation No 455, 1996

 X. Liu, A.M.A. El-Aty, J-Y. Park, J-H. Park, S-K. Cho, H-C. Shin, J-H. Shim, Determination of

Spinetoram in Leafy Vegetable Crops Using Liquid Chromatography and Confirmation via Tandem Mass Spectrometry, Biomedical Chromatography 25 (2011) 1099–1106

 P. Nygren, Structural and Functional Studies of De Novo Designed Peptides at Surfaces, Linköping Studies in Science and Technology, Dissertation No. 1199, 2008

 E. Pinori, M. Berglin, L. M. Brive, M. Hulander, M .Dahlström, H .Elwing, Multi-seasonal

barnacle (balanus improvisus) protection achieved by trace amounts of a macro cyclic lactone (ivermectin) included in rosin-based coatings, Biofouling, vol. 27 (2011)s. 941–953

 A. Sannino, Determination of three natural pesticides in processed fruit and vegetables using

high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Rapid

(30)

 J. R. Saroyan, E. Lindner, C. A. Dooley, Repair and Reattachment in the balanidae as related to

their cementing mechanism, Biological Bulletin, vol. 139 (1970) s. 333–350

 M. Sjögren, U. Göransson, A-L. Johnsson, M. Dahlström, R. Andersson, J. Berman, P.R. Jonsson, L. Bohlin, Antifouling Activity of Brominated Cyclopeptides from the Marine Sponge

Geodia baretti, Journal of Natural Products, vol. 67 (2004) s. 368–372

 M. Sjögren, P. R. Jonsson, M. Dahlström, T. Lundälv, R. Burman, U. Göransson, L. Bohlin, Two

Brominated Cyclic Dipeptides Released by the Coldwater Marine Sponge Geodia baretti Act in Synergy as Chemical Defense, Journal of natural Products vol. 74 (2011) s. 449–454

 S. Sölter, R. Dieckmann, M. Blummenberg, W. Francke, Barettin, revisited?, Tetrahedron Letters vol. 43 (2002) s. 3385–3386

 M. Thouvenin, J-J. Peron, C. Charreteur, P. Guerin, J-Y. Langlois, K. Vallee-Rehel, A Study of

the Biocide Release from Antifouling Paints, Process in Organic Coating vol. 44 (2002) s. 75–

83

 Begnt Wälivaara, In vitro Studies of Selected Blood Protein on Solid Surfaces, Linköping Studies in Sience and Technology, Dissertation No 415, 1996