Ditiotreitol-behandling av erytrocyter vid förenlighetsprövning av blod till patienter med Darzalex medicinering

(1)

Ditiotreitol-behandling av erytrocyter vid

förenlighetsprövning av blod till patienter med

Darzalex medicinering

Dithiothretiol treatment of erythrocytes in

compatibility testing of blood to patients with

Darzalex medication

Författare: Merry Ghilai

Vårterminen 2021

Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap

Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng

Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Handledare: Emelie Granängen, Biomedicinsk analytiker, Transfusionsmedicin, Centralsjukhuset Karlstad

Examinator: Gabriella Lillsunde-Larsson, Medicinsk doktor, Örebro universitet

(2)

SAMMANFATTNING

Introduktion: Daratumumab är en monoklonal antikropp som används för att behandla patienter med multipelt myelom (MM), en typ av blodcancer som har sitt ursprung i B-lymfocyter. Daratumumab binder till CD38 som normalt uttrycks på erytrocyternas yta och ger upphov till panreaktivitet vid förenlighetsprövning, som kan maskera kliniskt signifikanta antikroppar. Ditiotreitol (DTT), ett reducerande lösningsmedel, denaturerar den extracellulära domänen av CD38 och därmed hämmar inbindning av daratumumab. DTT-behandling av testerytrocyter vid förenlighetsprövning möjliggör detektion av kliniskt relevanta alloantikroppar.

Syfte: Att verifiera en metod för DTT-behandling av erytrocyter vid

förenlighetsprövning, för att detektera alloantikroppar av klinisk relevans och lättare få fram blod till patienter som medicineras med Darzalex.

Metod & materiel: I studien ingick två plasmaprover från patienter med daratumumab behandling. Testerytrocyterna behandlades med olika DTT mängd (80, 160 och

320 𝜇𝜇L). DTT-behandlade samt obehandlade testerytrocyter testades mot

plasmaproverna, negativ kontroll (anti-K) och positiv kontroll (anti-C) vid olika dagar från tillredningsdatum.

Resultat: Daratumumab interferens mot obehandlade testerytrocyter observerades. Reaktionen för samtliga DTT-behandlade testceller vid varje analystillfälle blev

negativt, oavsett DTT mängd. Resultaten för den negativa kontrollen visade att det slog positivt vid DTT mängden 80 samt 160 µL och negativ vid 320 µL. Alla reaktioner för den positiva kontrollen var 4+ vid samtliga DTT mängder oavsett analysdag.

Slutsats: DTT-behandling av erytrocyter inaktiverar CD38 som motverkar

panreaktivitet vid serologiska analyser, för att upptäcka eventuella kliniskt signifikanta antikroppar hos patienter som behandlas med daratumumab. Den optimala DTT mängden är 320 µL/1 ml 1% testerytrocyt med upp till 15 dagars hållbarhet vid kylförvaring.

(3)

ABSTRACT

Introduction: Daratumumab is a monoclonal antibody used to treat patients with multiple myeloma (MM), a type of blood cancer that originates in B lymphocytes. Daratumumab binds to CD38, which is expressed on the surface of erythrocytes. This leads to panagglutination in compatibility testing and can mask clinically significant antibodies. Dithiothreitol (DTT), a reductant, denatures the extracellular domain of CD38, thereby inhibiting daratumumab from binding. DTT treatment of RBC-reagents enables the detection of clinically relevant alloantibodies.

Purpose: To verify a method for DTT treatment of erythrocytes in compatibility testing, in order to detect alloantibodies of clinical relevance and to ensure that transfusion recipient with Darzalex medication receive compatible blood transfusion.

Method: Two plasma samples from daratumumab treated patients were included. RBC-regents were treated with different amounts of DTT (80, 160 and 320 μL). DTT-treated and untreated RBC-reagents were tested against plasma samples, negative control (anti-K) and positive control (anti-C) on different days.

Results: Daratumumab interference with untreated RBC-reagents were observed. DTT treated RBC-reagents however, showed negative reaction regardless of the amount of DTT used. Results for the negative control showed positive reaction with 80 and 160 µL DTT and negative at 320 µL. Reactions for the positive control were all 4+ no matter the amount of DTT and day it was analyzed.

Conclusion: DTT treatment of erythrocytes inactivates CD38, which prevents panagglutination, to detect any clinically significant antibodies in patients with

daratumumab treatment. The optimal DTT amount is 320 µL / 1 ml 1% RBC-reagents and a shelf life of up to 15 days when stored cold.

(4)

Innehållsförteckning

1. INTRODUKTION ... 1 1.1.BLODGRUPPSANTIKROPPAR ... 1 1.2.FÖRENLIGHETSPRÖVNING ... 2 1.3.TESTERYTROCYTER ... 3 1.4.ANTIHUMANGLOBULINTEKNIKEN ... 3

1.5.AVLÄSNING OCH AGGLUTINATIONSGRADERING... 4

1.6.DARZALEX (DARATUMUMAB) ... 5

1.7.DITIOTREITOL (DTT) ... 7

1.8.SYFTE OCH FRÅGESTÄLLNING ... 7

2. MATERIAL OCH METOD ... 8

2.1.FÖRBEREDELSER ... 8 2.1.1. Provmaterial ... 8 2.1.2. Beredning av 1% Testerytrocyter ... 8 2.1.3. Beredning av Ditiotreitol (DTT) ... 9 2.2.UTFÖRANDE ... 9 2.2.1. DTT-behandling av 1% testerytrocyter ... 9 2.2.2. Kvalitetskontroll ... 9 2.2.3. BAS-test ... 10 2.3.ETISKA ASPEKTER ... 10 3. RESULTAT ... 11 4. DISKUSSION ... 15

4.1.METODENS STYRKOR OCH SVAGHETER ... 16

4.2.FELKÄLLOR ... 17 5. SLUTSATS ... 20 6. TACKORD ... 21 7. REFERENSER ... 22 8. BILAGOR ... 24 BILAGA 1 ... 24 BILAGA 2 ... 25

(5)

1

1. INTRODUKTION

Molekylstrukturer som har förmåga att alstra en immunrespons, karaktäriseras som ett antigen (antibody generator, Ag). Det finns olika typer av antigen som uttrycks på alla cellers membran. Dessa antigen visar om en cell uttrycker självantigen eller om

antigenet är kroppsfrämmande, därigenom kan immunförsvaret differentiera och reagera mot antigen som är främmande (1).

Blodgrupper används för att klassificera den ärftliga egenskapen hos de erytrocyter som baseras på eventuell förekomst/avsaknad av antigensubstanser på erytrocyternas yta. Blodgruppsantigenerna hör till olika blodgruppssystem och kan utgöras av proteiner, glykoproteiner eller glykolipider. Ett blodgruppssystem kan bestå av en eller flera antigener som härrör från en gen med flera alleler eller flera närakopplade gener. Enligt The International Society of Blood Transfusion (ISBT) finns det över 300

erytrocyantigener registrerade i 41 blodgruppssystem, där ABO och Rhesus (Rh) -systemet är de vanligaste blodgruppsindelningarna. Dessa två system kombineras oftast och avgör en individs blodgrupp och är av klinisk betydelse vid blodtransfusioner. Det vill säga viktiga antigener som måste tas hänsyn till vid blodtransfusioner för att

minimera risk för transfusionskomplikationer. Den vanligaste blodgruppssystem som är av klinisk relevans utanför ABO- och Rh-systemet är Kell-systemet. Andra

blodgruppssystem med potentiell, men relativ låg, risk för transfusionsreaktioner förekommer (2–5).

1.1. Blodgruppsantikroppar

Det finns ett stort antal antigentyper på erytrocyternas yta och dessa varierar mellan individer. Variationen är en genetisk egenskap som ger upphov till en individs unika antigenuppsättning som kan identifieras med en specifik alloantikropp. En alloantikropp kan utgöras av reguljära (oftast benämnd naturliga antikroppar) samt irreguljära

antikroppar riktade mot främmande antigen hos en individ som saknar antigen i fråga. Vanligtvis uppstår irreguljära antikroppar på grund av immunisering i samband med blodtransfusioner eller graviditet, vilket kan orsaka allvarliga transfusionsreaktioner. ABO-systemet är ett viktigt undantag, därför att reguljära (naturliga) antikroppar förekommer utan att immunförsvaret stött på antigent. Detta medför till att de med

(6)

2 blodgrupp O kan donera blod till alla blodgrupper i ABO-systemet men kan endast ta emot från samma blodgrupp, eftersom blodgrupp O saknar antigener som kan ge upphov till immunologisk reaktion. Medan tvärtom gäller för individer med blodgrupp AB (1–3).

Reguljära antikroppar består huvudsakligen av immunoglobulin M (IgM). Antikroppen har pentamer till sin struktur och är en köldantikropp, vilket innebär att optimala temperaturen för reaktion är vid 20° C, men kan även reagera vid 37° C. Irreguljära antikroppar utgörs vanligen av IgG, en värmereaktiv antikropp med optimal temperatur för reaktion vid 37° C. IgM antikroppar kan tack vare sin struktur direkt agglutinera, det vill säga överbrygga avståndet mellan två erytrocyter för att agglutination ska uppstå. Det är däremot svårare för IgG antikroppar att direkt agglutinera på grund av sin storlek och struktur som är en monomer. Agglutination av irreguljära antikroppar av IgG-klass uppnås genom tillsatsen av antihumanglobulin (AHG) (2–4).

1.2. Förenlighetsprövning

En av de vanligaste vävnadstransplantationer i Sverige är blodtransfusioner. Innan blodtransfusion utförs, görs en blodgruppering och förenlighetsprövning på mottagarens blod. En blodgruppering innefattar ABO-bestämning, serumgruppering,

RhD-gruppering och antikroppsscreening. ABO-bestämning utförs för att undersöka ABO antigen uppsättningen på erytrocyternas yta. Serumgruppering påvisar förekomst av eventuellt anti-A och/eller anti-B i plasma. RhD-gruppering utförs för att påvisa förekomst av D-antigen. Antikropsscreening innefattar undersökning på förekomst av irreguljära antikroppar mot avsaknad antigen. En förenlighetsprövning görs då en blodgruppering är utförd och analyseras på två olika sätt, blodgruppskontroll och antikroppsscreening (BAS-test) och mottagare-givare test (MG-test) (2, 6–8). BAS-test tillämpas om patienten inte har kända irreguljära erytrocytantikroppar och betraktas giltig när negativ antikroppsscreening erhölls och blodgruppskontrollen stämmer överens med resultatet från tidigare blodgruppering. MG-test görs när klinisk signifikanta antikroppar förekommer. Blodenhet som saknar aktuell antigen väljs och testas mot patientens blod och endast vid negativt resultat kan blod utlämnas för

transfusion. Det är nästintill omöjligt att lämna ut blod som överensstämmer exakt med mottagarens blodgruppssystem och risken att antikroppar bildas vid blodtransfusion

(7)

3 finns alltid där. Förenlighetsprövning är därför av stor betydelse för att säkerställa att kompatibla blodenheter transfunderas (2, 6–8).

1.3. Testerytrocyter

Testerytrocyter används vid antikroppsscreening och antikroppsidentifiering för att fånga upp och klassificera kliniskt signifikanta antikroppar. Erytrocyterna kommer från kända blodgivare med blodgrupp O som är fenotypade på utvalda antigen/blodgrupper efter nationella kriterier. Det innebär att antigenuppsättningen på erytrocyternas yta är bestämd sedan tidigare. Val av testerytrocyt baseras på ett specifikt fenotypmönster för olika antigen, som tillsammans uttrycker de alla kliniskt signifikanta antigener och minimerar risken för att en antikropp ska missas på grund av att testcellen saknar det aktuella antigenet. Sammanställning av utvalda testerytrocyter utgör en panel som avläses manuellt med hjälp av ett antigram, där antigener som tillhör de olika cellerna finns listad (7).

Ett antal panelceller används beroende på undersökningssyfte. För antikroppsscreening används tre eller fyra paneler, medan för antikroppsidentifiering kan många olika paneler beroende på antikropp användas. Testerytrocyter bevaras i en bestämd

erytrocytkoncentration (%) i isoton lösning, vilket förlänger hållbarheten samt hjälper att skapa en gynnsam reaktionsmiljö (7).

1.4. Antihumanglobulintekniken

Antihumanglobulintekniken (AHG) är ett hemagglutinationstest för att påvisa antikroppar genom tillsats av en sekundärantikropp, det vill säga AHG. Antiglobulin test består av en direkt och indirekt testmetoder, där båda testmetoder baseras på AHG som binder till humana antikroppar (3, 9).

Direkt antiglobulin test (DAT) används för att påvisa förekomsten av erytrocytbundna irreguljära antikroppar av IgG, IgA och IgM-typ samt komplementfaktorer. Patientens erytrocyter inkuberas med AHG reagens, en sekundär antikropp som binder till

antikroppar eller komplementprotein bundna till patients erytrocytantigen. Denna metod utförs vid bl.a. utredning av autoimmun hemolytisk anemi (AIHA) och hemolytisk sjukdom hos nyfödda (HDFN) (3, 9, 10).

(8)

4 Indirekt antiglobulin test (IAT) används för att påvisa antikroppar av klinisk betydelse i patienters plasma. Patientens plasma som separeras från helblod inkuberas i 37° C med ett antal testerytrocyter tillsammans med AHG. AHG ger upphov till agglutination genom att det binder in till irreguljära antikroppar som är bundna till testerytrocyt antigen. IAT används huvudsakligen för att påvisa alloantikroppar vid

antikroppsscreening samt antikroppsidentifiering (9).

Det finns olika serologiska metoder som tillämpar antiglobulin teknik, där rörteknik och geltekniken är de vanligaste metoderna. Sedan länge har rörtekniken varit standarden för immunhematologiska tester, trots att metoden har varit svår att standardisera. Gelteknik är en känslig teknik som utvecklades 1980-talet av den franske forskaren Yves Lapierre, för att minska begränsningar i samband med konventionella metoder vid blodserologiska undersökningar. Metoden utnyttjar gelkort med mikrorör innehållande Sephadexgel dextrangel, buffertlösning och specifika reagens (AHG eller andra

reagens), beroende på vad det är som ska undersökas. Varje mikrorör består av en reaktionsbrunn och en kolonn var gelen och färdiginkorporerade reagenset finns.

Principen bakom metoden är att erytrocyter inkuberas med plasma. Under inkuberingen sensibiliseras erytrocyterna vid förekomst av en antikropp, vilket gör att interaktion mellan antigen och antikropp uppstår. För att främja agglutination centrifugeras gelkorten. Storleken på kolonnen och mängden porösa gel partiklar fungerar som filter för erytrocyterna att tränga sig igenom. Under centrifugeringen fastnar stora agglutinat ovanför gelen medan icke agglutinerade erytrocyter filtreras genom gelen och samlas i botten av mikroröret (3, 8–10).

1.5. Avläsning och agglutinationsgradering

Enligt riktlinjer ur Handbok för blodcentraler, utgivet av Svensk förening för klinisk immunologi och transfusionsmedicin, avläses agglutinationsreaktion från bägge av kortets sidor mot en väl belyst bakgrund. Agglutinationsreaktion vid gelteknik graderas från negativt till 4+ och blandbild (Figur 1.). Negativ reaktion förekommer då ingen agglutination bildas och alla erytrocyter passerar genom gelen och hamnar på botten av kolonnen. En 1+ reaktion karaktäriseras av agglutinat i nedre delen av kolonnen samt celler på botten av mikroröret. En 2+ reaktion, spridda agglutinat observeras genom

(9)

5 hela gelkolonnen. En 3+ reaktion, stora agglutinat kvar i övre delen av gelen. En 4+ reaktion, ovanpå gelen bildas ett band av agglutinerade erytrocyter (9).

Figur 1. Agglutinationsgradering baserad på mönster vid gelteknik. 4+ ett stort agglutinat ovanpå gelen, 3+ fasta agglutinat med få fallande celler, 2+ spridda och lösa agglutinat, 1+ få agglutinerade erytrocyter och negativt inga agglutinerade celler. (bilden tillgänglig på: http://lnu.diva-portal.org/smash/get/diva2:1442143/FULLTEXT01.pdf).

1.6. Darzalex (daratumumab)

Darzalex är ett relativt nytt läkemedel som används för att behandla patienter med multipelt myelom (MM). MM är en typ av hematologisk neoplasi som har sitt ursprung i B-lymfocyter. Det är en form av blodcancersjukdom som stör den normala

blodcellsproduktionen genom den snabba tillväxten av onormala maligna celler i benmärgen. Myelom karaktäriseras som en kronisk sjukdom som är obotlig och befintliga behandlingsmetoder syftar till att lindra symtom samt kontrollera sjukdomsförloppet (11–13).

Darzalex består av en den aktiva läkemedelssubstansen daratumumab (DARA), ett IgG1 human monoklonal antikropp riktad mot Cluster of differentiation 38- (CD38)

receptorer som överuttrycks hos myeloiska celler. CD38 är ett transmembrant glykoprotein med multifunktionell aktivitet i cellsignalering, receptormedierad

inbindning samt intracellulär kalciumreglering. CD38-receptor finns uttryckt på ytan av olika celler i olika vävnader, hematopoetiska celler och immunologiska celler.

Genuttryck hos en cell är vanligtvis en välreglerad process, men vid MM är denna process nedreglerad och hög expression av CD38 leder bland annat till hypercalcemi, njurinsufficiens och benskörhet. Daratumumab binder till CD38 och inducerar apoptos av neoplastiska plasmaceller samt aktiverar immunsystemet genom att främja delning av T-celler (12–14).

(10)

6 Behandlingen är framgångsrik och fler patienter kommer att bli behandlade i framtiden och flera likartade läkemedel är redan på väg ut på marknaden. Detta ställer till problem för blodcentralerna vid serologiska analyser, då låg expression av CD38 även finns på ytan av erytrocyter. Det kan leda till panreaktivitet, det vill säga att läkemedlet kommer att binda till CD38 på testerytrocyterna. Detta gör att falskt positiva resultat vid

antikroppsscreening uppstår, och interferensen kan persistera upp till 6 månader efter avslutad behandling (Figur 2.). Eftersom panreaktivitet uppstår vid IAT, kan kliniskt signifikanta antikroppar maskeras, då det uppstår en falskt positiv reaktion mellan testerytrocyter och plasma prover från daratumumab-behandlade patienter. Det ökar risken att oförenliga erytrocyter ges, därför är det viktigt att denna typ av

läkemedelspåverkan undviks för att säkerställa patientsäkerheten vid transfundering av dessa patienter (14–15).

Figur 2. Interaktion mellan Daratumumab och röda blodceller vid indirekt antiglobulintest (IAT). (A) Negativt IAT hos patientprov som saknar alloantikroppar mot erytrocytantigener. (B) Positivt IAT vid förekomst av irreguljära alloantikroppar hos patientserum. (C)

(11)

7 Panagglutination orsakad av daratumumab inbindning till CD38-receptorer, maskerar förekomst av eventuella alloantikroppar och ger en falskt positiv IAT (14).

1.7. Ditiotreitol (DTT)

Ditiotreitol (DTT) är ett reducerande lösningsmedel som används för att motverka panreaktivitet som uppstår av anti-CD38. DTT behandling av erytrocyter denaturerar den extracellulära domänen av CD38 genom klyvning av disulfidbindningar och därigenom inhiberar inbindning av daratumumab. DTT denaturerar även andra

blodgruppsantigener på erytrocyternas yta inom Kell, Lutheran, Yt, JMH, LW, Cromer, Indian, Dombrock och Knops-system. Detta medför svårigheter att detektera

alloantikroppar mot antigener i dessa blodgruppssystem. daratumumab behandlade patienter som är i behov av blodtransfusion, transfunderas därför med K-negativa erytrocytenheter, såvida de inte är kända som K-positiva. Detta för att minimera risken för transfusionsreaktion på grund av risken för förekomst av oidentifierad anti-K antikroppar (16). Eftersom DTT förstör antigener i Kell-systemet, användes K+ erytrocyter som negativ kontroll för att kontrollera om erytrocytbehandlingen har lyckats.

1.8. Syfte och frågeställning

Syftet med studien är att verifiera en metod för DTT-behandling av erytrocyter vid förenlighetsprövning (dvs BAS-test och MG-test). Detta för att detektera

alloantikroppar av klinisk relevans och lättare få fram blod till patienter med MM som medicineras med Darzalex.

- Kan ditiotreitol (DTT) framgångsrikt användas för att avlägsna CD38 från erytrocyterna i blodcentralens analyser av patienter behandlade med Daratumumab?

- Vid vilken mängd av DTT blir effekten som bäst?

- Kontrollera hållbarheten/stabiliteten hos DTT-behandlade BAS-testceller, hur ofta ska nya testceller behöver beredas?

(12)

8

2. MATERIAL OCH METOD

Än idag så finns det inte en standardiserad metod för CD38-antikroppsinterferens vid förenlighetsprövning. Det finns olika metoder för att undvika sådana interferenser, och vilken metod som valideras beror på klinikens lokala praxis, kostnad samt tillgänglighet (17). Region Örebro läns metodbeskrivning för DTT-behandling av testerytrocyter studerades och användes som utgångspunkt för att verifiera samma metod på Centralsjukhuset, Karlstad, avdelningen för transfusionsmedicin. Val av undersökningsmetod grundades på att metoden var lätt tillgänglig samt kostnadseffektiv.

2.1. Förberedelser

2.1.1. Provmaterial

I denna studie användes två plasmaprover från två patienter som stod under pågående daratumumab-behandling på Hematologimottagningen på Centralsjukhuset, Karlstad. Blodproverna togs venöst i 2 x 5 mL rör med etylendiamintetraättiksyra-tillsats (EDTA, Greiner-Bio-One, Kremsmünster, Österrike). Innan behandlingsstart utfördes

blodgruppsantigentypning samt förenlighetsprövning, dvs blodgruppskontroll och antikropps-screeningtest (BAS-test) på båda patienter.

Blodproverna centrifugerades (Rotina 380/380R, Hettich, Tuttlingen, Tyskland) fem minuter vid 1500 g, därefter separerades plasman från resterande blodkropparna. Plasman delades, avidentifierades och överfördes till nya kodade rör för att skydda patienternas identitet, kvarblivna erytrocyter destruerades. Sedan förvarades proverna i -20° C mellan analysomgångarna. Inför varje analysomgång tinades och

rumstempererades alla reagenser och plasma. 2.1.2. Beredning av 1% Testerytrocyter

Beredning av testerytrocyter utfördes enligt egna laboratoriets anvisningar. Samtliga testerytrocyter (BI-BIV) som används rutinmässigt vid förenlighetsprövning användes. En 1% erytrocytsuspension bereddes från 4% testerytrocytsuspension (Blodcentralen Serologen, USÖ, Sverige) som späddes i ID-Cellstab (Bio-Rad, DiaMed, Neuchâtel, Schweiz). Testerytrocyterna förvarades i 5° C mellan analysomgångarna.

(13)

9 2.1.3. Beredning av Ditiotreitol (DTT)

Ditiotreitol-lösning förbereddes enligt instruktioner från avdelningen för Klinisk

Immunologi och blodgruppsserologi Universitetssjukhuset Örebro. DTT-lösningen (0,2 M) bereddes genom att lösa upp 1,0 g ditiotreitol (Blodcentralen Serologen, USÖ, Sverige) i 32 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (NaCl 0,9%, XboXlab AB, Tranås, Sverige) pH 7,24. DTT-lösningen fördelades i mindre volymer, ca 3 mL i varje rör och förvarades fryst vid -20° C.

2.2. Utförande

2.2.1. DTT-behandling av 1% testerytrocyter

DTT-behandling av 1% testerytrocyter utfördes enligt instruktioner från avdelningen för klinisk Immunologi och blodgruppsserologi Universitetssjukhuset Örebro. Ett rör 0,2 M DTT-lösning tinades i rumstemperatur. Ur 1% BAS-testcellerna överfördes 1mL

suspension till tre förmärkta glasrör. Erytrocyterna centrifugerades 60 sekunder vid 1000 g för att cellerna skulle packas ihop och supernatanten avlägsnades. Olika mängd DTT; 80, 160 och 320 𝜇𝜇L 0,2 M DTT-lösning tillsattes till respektive rör. Samtliga rör inkuberades i ett 37° C värmeskåp i 40 minuter, varpå rören blandades var 10 minut under inkubationstiden. Erytrocyterna tvättades manuellt fyra gånger enligt följande: samtliga rör fylldes med PBS, centrifugerades en minut vid 1000 g och därpå

avlägsnades tvättvätskan. Till packade erytrocyter tillsattes 950 𝜇𝜇L ID-Cellstab, tills suspensionen blev ca 1% i styrkan. DTT-behandlade erytrocytsuspension kylförvarades i 5° C mellan analysomgångarna.

2.2.2. Kvalitetskontroll

Kvalitetskontroll utfördes för att kontrollera att DTT-behandlingen hade lyckats. En positiv samt negativ kontroll av C+ och K+ erytrocyter tillsammans med anti-C (Seraclone, Bio-Rad, Stockholm, Sverige) och anti-K (DiaClon, DiaMed, Stockholm, Sverige) reagens användes. Eftersom DTT-behandlingen denaturerar K-antigenet, användes K+ erytrocyter som negativ kontroll och C+ erytrocyter som positiv kontroll, då ingen känd påverkan påträffar antigen i Rh-systemet. Till kontrollen användes Coombs Anti-IgG gelkort (ID-card, DiaMed, Stockholm, Sverige) där 50 𝜇𝜇L C+ samt 50 𝜇𝜇L K+ DTT-behandlad respektive 50 𝜇𝜇L K+ och 50 𝜇𝜇L C+ obehandlad

(14)

10 anti-K reagens till respektive brunn på gelkortet. Gelkorten inkuberades i

gelkortsinkubator (ID-Incubator 37 S I, DiaMed, Stockholm, Sverige) 37° C i 15 min, därefter centrifugerades gelkorten i gelkortscentrifug (ID-Centrifuge 12 S II, DiaMed, Stockholm, Sverige) 10 minuter vid 85 g.

2.2.3. BAS-test

BAS-test utfördes enligt egna laboratoriets anvisningar. Till analysen användes en IAT-teknik med Coombs Anti-IgG gelkort. Till respektive brunn tillsattes 50 𝜇𝜇L av 1 % DTT-behandlade testerytrocytsuspension BI-BIV till motsvarande position på gelkortet. Därefter tillsattes 25 𝜇𝜇L plasma från patienten och gelkortet inkuberades i 37° C i 15 minuter och centrifugerades i 10 minuter vid 85 g. Gelkorten avlästes och graderades enligt Region Värmlands instruktion dokument, Agglutinationsgradering (bilaga 1). BAS-test på plasmaproverna utfördes dag 0, 3, 7, 10 och 15.

2.3. Etiska aspekter

Studien utfördes på Kliniken för Transfusionsmedicin i Karlstad. I studien ingick två plasmaprover erhållna från patienter som medicineras med Darzalex. Patienterna informerades muntligen och skriftligen (bilaga 2) om studien, att deltagandet var frivilligt och att de kunde utan någon särskild anledning, avbryta sitt medverkande i forskningsprojektet. Studien utfördes med klinikens medicinsk ansvariga godkännande.

(15)

11

3. RESULTAT

Fenotypning, BAS-test samt DAT utfördes på patienternas prov före behandlingsstart. Fenotypningen visade förekomsten av de vanligaste antigener i Rh-, Duffy- samt Kidd-systemen (Tabell. 1). BAS-test samt DAT som utfördes innan start av behandling med daratumumab, var negativa hos båda patienter.

Tabell 1. Resultat av fenotypning visar uttryckta samt avsaknad av antigener på erytrocyternas yta (utförd av Centralsjukhuset i Karlstad).

C c E e K Fya _Fyb _Jka _Jkb

Prov 1 - + + + - - + + -

Prov 2 + + - + - + + - +

I denna verifiering utfördes endast antikroppsscreening på testerytrocyterna. Resultat av BAS-test med DTT-behandlade samt obehandlade 1% testerytrocyter (BI-BIV) vid olika dagar från tillredningsdatum erhölls. Dag 0 bereddes DTT-behandlade 1% testerytrocyter och färsk plasma användes, dag 3, 7, 10 och 15 användes fryst upptinad plasma. Vid varje analysomgång kontrollerades testerytrocytsuspensionen mot anti-C respektive anti-K. Den negativa kontrollen bestod av testerytrocyt innehållande K-antigen, medan positiva kontrollen var C-antigen positiv.

Totalt utfördes dag 0 fyra BAS-tester manuellt för varje prov. Samtliga plasmaprover gav negativ reaktion (Tabell 2.). Kontroll av testerytrocyterna mot K-antigen gav reaktionen 3+ mot obehandlade celler och 1+ vid 80 och 160 µL DTT-behandlade erytrocyter. En tydlig doseffekt noterades i reaktionen för den negativa kontrollen. Vid 80 µL en 1+ agglutinationsreaktion, medan svagare 1+ reaktionsmönster observerades vid 160 µL och vid 320 µL var alla erytrocyter i botten av kolonnen (Figur 3.). Kontroll mot C-antigen gav reaktionen 4+ för samtliga testerytrocyter.

(16)

12 Tabell 2. Dag 0 användes färsk plasma. Reaktionsresultat för antikroppsscreening av plasma från daratumumab behandlade patienter. Patientproverna, positivt och negativa kontrollen screenades mot DTT-behandlade och obehandlade 1% testerytrocyter (BI-BIV), för att detektera daratumumab interferens samt kontrollera att daratumumab interferens avlägsnats.

Testerytrocyterna behandlades med olika DTT mängd för att kontrollera mängden som gav bäst effekt, där erytrocyterna kontrollerades mot patientens plasma, anti-C respektive anti-K.

Erhållna resultat graderades från negativt till 4+ utifrån reaktionsmönster. 0,2 M DTT

Volym µL:

BAS I BAS II BAS III BAS IV Neg K Pos K

Prov 1 2 1 2 1 2 1 2 80 - - - + ++++ 160 - - - + ++++ 320 - - - ++++ Obeh. ery ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++++

Figur 3. Representativ resultat av antikroppsscreening med DTT-behandlade samt obehandlade celler vid kvalitetskontroll av testerytrocyterna. (A) DTT-behandlade samt obehandlade testerytrocyter (BIV) mot anti-K agglutineras vid 80 och 160 µL samt obehandlade screeningceller. (B) DTT-behandlade samt obehandlade testerytrocyter (BI) mot anti-C agglutineras alla fyra screeningceller.

Dag 3, 7, 10 och 15 användes fryst upptinad plasma. BAS-tester för båda plasmaprover utfördes samt kontroll av testerytrocyterna. Daratumumab interferens hos båda plasma prover observerades för obehandlade testceller. Reaktionsresultat för DTT-behandlade testerytrocyter mot patienternas plasma innehållande anti-CD38 var negativa för samtliga testceller (BI-BIV) vid varje analystillfälle, oavsett DTT mängd (Tabell 3–6). Resultaten för den negativa kontrollen visade att det slog positivt vid DTT mängden 80 samt 160 µL, medan negativ reaktion vid 320 µL observerades alla analysdagar. Alla

A B

80 160 320 _Obhe

(17)

13 reaktioner för den positiva kontrollen var genomgående ett 4+ mönster vid samtliga DTT mängder oavsett analysdag.

Tabell 3. Dag 3 användes fryst upptinad plasma. Reaktionsresultat för antikroppsscreening av plasma från daratumumab behandlade patienter. Patientproverna, positivt och negativa

kontrollen screenades mot DTT-behandlade och obehandlade 1% testerytrocyter (BI-BIV), för att detektera daratumumab interferens samt kontrollera att daratumumab interferens avlägsnats. Testerytrocyterna behandlades med olika DTT mängd för att kontrollera mängden som gav bäst effekt, där erytrocyterna kontrollerades mot patientens plasma, anti-C respektive anti-K.

Volym µL:

Prov 1 2 1 2 1 2 1 2 80 - - - + ++++ 160 - - - + ++++ 320 - - - ++++ Obeh. ery ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ +++ ++++

Volym µL:

Prov 1 2 1 2 1 2 1 2 80 - - - + ++++ 160 - - - + ++++ 320 - - - ++++ Obeh. ery ++ + ++ ++ + + ++ ++ +++ ++++

(18)

14 Tabell 5. Dag 10 användes fryst upptinad plasma. Reaktionsresultat för antikroppsscreening av plasma från daratumumab behandlade patienter. Patientproverna, positivt och negativa

Volym µL:

Prov 1 2 1 2 1 2 1 2 80 - - - + ++++ 160 - - - + ++++ 320 - - - ++++ Obeh. ery ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ +++ ++++

Volym µL:

Prov 1 2 1 2 1 2 1 2 80 - - - + ++++ 160 - - - + ++++ 320 - - - ++++ Obeh. ery ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ +++ ++++

(19)

15

4. DISKUSSION

Daratumumab är en framgångsrik behandlingsmetod för patienter med MM och

pågående studier avseende likartade läkemedel för andra maligna neoplasier tyder på att fler patienter kommer att bli behandlade i framtiden. Daratumumab är riktad mot

maligna myeolida celler som har högre uttryck av receptorn CD38 än normalt. Problemet är att daratumumab binder till receptorn som också uttrycks normalt på övriga vävnader, till exempel på erytrocyternas yta. Läkemedlets interferens kan förhindras med hjälp av DTT som denaturerar CD38 genom att klyva dess

disulfidbindningar och omöjliggöra interaktionen mellan receptorn och daratumumab. Nackdelen med att använda DTT är att den deaktiverar andra blodgruppsantigener. DTT förstör alla antigener som ingår i Kell-systemet, vilket gör att antikroppar ur

blodgruppssystemet inte kan detekteras. Som regel ges därför K negativa blodenheter om de inte är registrerade som K positiva. Andra känsliga blodgruppsantigener tillhör Lutheran, Yt, JMH, LW, Cromer, Indian, Dombrock och Knops-blodgruppssystem. Detta medför svårigheter att detektera alloantikroppar mot antigener i dessa

blodgruppssystem. Av den anledningen bör patienter som ska påbörja daratumumab behandling undergår en fullständig fenotypning alternativt genotypning för att säkerställa att förenliga blodenheter transfunderas vid behov (16).

Syftet med studien var att verifiera en metod för DTT-behandling av testerytrocyter vid förenlighetsprövning för att detektera alloantikroppar av klinisk relevans.

Metodprincipen bygger på att med hjälp av DTT förhindra panreaktivitet för att lättare få fram blod och transfundera förenliga erytrocyter till patienter som medicineras med daratumumab.

Fenotypningen på patienternas prov före behandlingsstart visade förekomsten av de vanligaste antigener i Rh-, Duffy- samt Kidd-systemen (Tabell. 1). Det utförs före behandlingsstart för att fastställa erytrocytantigener. Detta eftersom daratumumab leder till en panreaktivitet vid rutinanalyser och på grund av att olika blodgruppsantigener inom Kell-systemet samt andra denatureras av DTT. Båda patienter saknar K-antigenet och vid behov av blodtransfusion, transfunderas de med K-negativa erytrocytenheter. BAS-test samt DAT som utfördes innan behandlingen påbörjades var negativa hos båda patienter. Detta innebär att båda patienter inte har alloantikroppar eller autoantikroppar.

(20)

16 Båda patienter hade stått på daratumumab behandling under ett par veckor respektive några månader då verifieringen startades. Daratumumab interferens hos obehandlade testerytrocyter observerades vid BAS-test med 1+ samt 2+ reaktionsmönster för samtliga BAS-testceller oavsett analysdag. Detta tyder på att panreaktivitet uppstår redan under ett tidigt skede av behandlingsfasen. Reaktionerna för DTT-behandlade testerytrocyter mot patienternas plasma innehållande anti-CD38 var negativa för

samtliga testceller (BI-BIV) vid varje analysomgång och oavsett DTT mängden (Tabell 2–6). Anledningen att testerytrocyterna testades endast i 15 dagar beror på att,

testcellerna vanligtvis har 15 dagars hållbarhet innan nya måste beredas.

Olika mängd DTT tillsattes tillsammans med en positiv samt negativ kontroll för att avgöra mängden DTT som gav optimal effekt. En positiv och negativ kontroll sattes för varje testerytrocyt som behandlades med olika DTT mängd. För den positiva kontrollen valdes BI som var C+ och sattes med anti-C reagens. Alla reaktioner för den positiva kontrollen vid samtliga DTT mängder uppvisade ett 4+ mönster för varje analys. För den negativa kontrollen användes BIV som var K-antigen positiv. Här förväntades negativa reaktioner, därför att antigener som tillhör Kell-systemet förstörs av DTT-lösningen. Resultaten visade att det slog positivt vid DTT mängden 80 samt 160 µL, vilket tyder på DTT inte har förstört K-antigenet. Det är viktigt att notera att

reaktionsstyrka blev starkare med ökande DTT mängd. Men eftersom det slog positivt, tolkas det som att volymen DTT inte var tillräcklig för att avlägsna samtliga CD38 receptorer på erytrocyterna. Volymen 320 µL uppvisar däremot en negativ reaktion varvid det tolkas som att mängden DTT har denaturerat CD38 på erytrocyternas yta och därigenom hämmat daratumumab inbindning till receptorn. Utifrån resultaten verkar 320 µL vara tillräckligt för att förhindra antigen-antikroppskomplex som uppstår mellan

CD38 och daratumumab.

4.1. Metodens styrkor och svagheter

Den vanligaste metoden för att hindra daratumumab interferens vid

förenlighetsprövning är genom att behandla testerytrocyter med DTT. DTT är ett reducerande lösning med förmågan att förändra den tertiära strukturen hos

proteinbaserade blodgruppsantigener på erytrocyternas yta. Nackdelen med metoden är att DTT förstör kliniskt signifikanta antigener som tillhör Kell-systemet men även andra

(21)

17 blodgruppssystem. Detta medför svårigheter att detektera alloantikroppar mot antigener i blodgruppssystem som också är DTT känsliga. Vid misslyckad upptäck av kliniskt signifikanta antikroppar kan patienten riskera en hemolytisk transfusionsreaktion, som kan leda till allvarliga skador och i värsta fall, dödfall. Svårigheter att införa metoden på mindre blodcentraler är också en annan begränsning (17).

Det är viktigt att notera att forskningsstudier kring transfusionssäkerhet visar att hittills så har inga hemolytiska transfuionsreaktioner rapporterats i samband med

blodtransfusioner hos daratumumab behandlade patienter (18).

En tidigare studie som utfördes för att verifiera DTT-behandling av erytrocyter

internationellt, visade att metoden är tillförlitlig. I studien ingick 25 blodcentraler som fick två plasmaprover innehållande daratumumab, varav ett av proverna även innehåll an alloantikropp. Vid antikroppsscreening rapporterade alla blodcentraler om

daratumumab interferens och med hjälp av DTT-behandlade erytrocyter kunde de förhindra daratumumab interferens. Samtliga blodcentraler kunde även identifiera vilken alloantikropp som fanns i det andra provet efter denaturering av CD38 från erytrcoyternas ytan med DTT-lösning. Flera blodcentraler som ingick i studien upplevade att metoden var enkel att utföra och planerar att i framtiden införa DTT-behandling av testerytrocyter, för att förhindra interferens hos daratumumab behandlade patienter (16).

Andra metoder har utvecklats för att hindra panreaktivitet hos daratumumab behandlade patienter. Lösligt CD38 eller anti-daratumumab idiotyp har använts som ett alternativ till DTT för att neutralisera daratumumab i plasma. Denna metod bedöms vara mer effektiv och enklare att utföra men brist på reagens tillgänglighet samt metodens kostnadskrav, gör det svårt att införa och standardisera metoden. Fördelen med DTT är det är lätt tillgängligt samt kostnadseffektiv (16).

4.2. Felkällor

DTT behandling av erytrocyter vid förenlighetsprövning är en metod som ställer krav på kunskap och noggrannhet då utförande av metoden är för att undvika daratumumab interferens samt upptäcka eventuella antikroppar av klinisk signifikans.

(22)

18 Det finns olika faktorer såsom kontamination, temperatur eller inkubationstid som kan påverka och ge falska resultat. Det är viktigt att DTT lösningen förvaras fryst i mindre volymer för att undvika upprepad upptining av samma rör. DTT har kort hållbarhet i rumstemperatur och upprepad upptining försvagar dess reduktionsförmåga. Beredning av DTT vid pH >7 krävs för irreversibel denaturering av disulfidbindningar. Det finns risk för inadekvat reduktion och reversibel denaturering av disulfidbindningarna om reagenset beredes vid ett lägre pH (19). Anledningen till detta är att pH är en

logaritmisk skala och skillnaden mellan pH 6,9 och 7,0 är stor. I denna studie bereddes DTT lösningen vid olika tillfällen med pH 7,24 respektive 7,96 och det visade sig att effekten var densamma.

Kliniskt signifikanta antikroppar mot DTT känsliga antigener kan inte uteslutas vid negativ antikroppsscreening med DTT-behandlade testerytrocyter. Panreaktivitet med falskt positiv antikroppsscreening kan uppstå vid misslyckad DTT-behandling på grund av för liten mängd DTT. Överbehandling av testerytrocyter med för hög DTT mängd kan förstöra antigener inom Lutheran, Yt, JMH, LW, Cromer, Indian, Dombrock och Knops-blodgruppssystem.

DTT förstör antigener i Kell-systemet, därför användes K+ erytrocyter som negativ kontroll. Vid positiv reaktion för den negativa kontrollen användes anti-K reagenset mot K- testerytrocyt för att utesluta kontamination samt en ny anti-K sattes mot negativa kontrollen. När negativa kontrollen fortfarande slog positivt, utfördes

DTT-behandlingen om på nytt. Kontinuerlig positiv reaktion för den negativa kontrollen löstes genom att öka inkubationstiden. Erytrocyterna inkuberades i 40 minuter istället för 30 och det gav bättre reaktion. För att konfirmera utfallet utfördes ett antal BAS-test med DTT-behandlade testerytrocyter som hade olika inkubationstider. Det visade sig att 40 minuter var tillräckligt för att avaktivera CD38 och motverka panreaktivitet utan att överbehandla erytrocyterna. Anledningen att det fungerade bättre vid längre

inkubationstid beror på att Örebro använde sig utav ett vattenbad, som är effektivare på värmeöverföring än ett värmeskåp (20). I den nya metodbeskrivnigen implementeras 40 minuters inkubationstid.

(23)

19 En begränsning i studien är antalet patienter under behandling som ingick i

metodvalideringen samt att integriteten hos de andra blodgruppsantigener som förstörs av DTT behandling inte kunde undersökas.

(24)

20

5. SLUTSATS

Studien visade att DTT-behandling av erytrocyter inaktiverar CD38, vilket eliminerar panreaktivitet mellan daratumumab hos patientens plasma och CD38 vid serologiska analyser. Den optimala DTT mängden är 320 µL/1 ml 1% testerytrocyt med 15 dagars hållbarhet vid kylförvaring. Metodens tillgänglighet samt den låga kostnaden gör det möjlig att använda DTT i rutinundersökningar, för att upptäcka eventuella kliniskt signifikanta antikroppar hos patienter som behandlas med daratumumab.

(25)

21

6. TACKORD

Ett stort tack till min handledare Emelie Granängen, för möjligheten att genomföra examensarbetet och stöttningen under arbetets gång. Jag vill även framföra tack till personalen på blodcentralen Centralsjukhuset i Karlstad, tack för all hjälp, handledning och stöd.

(26)

22

7. REFERENSER

1. Wood P. Understanding Immunology. 3: e upplaga. Harlow: Pearson Education Limited; 2011.

2. Harmening DM, Modern Blood Banking and Transfusion Practices. 6:e upplaga. Philadelphia: F.A. Davis Company; 2012.

3. Daniels G, Bromilow I. Blodgruppsserologi. 1: a upplagan. Lund: Studentlitteratur; 2008.

4. Mitra R, Mishra N, Rath GP. Blood groups systems. Indian J Anaesth. 2014; 58:524-528.

5. Transfusion ISoB. Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminolgy [Internet]. Amsterdam: ISBT Central Office; 2020 [citerad 2021-04-13].

Tillgängligt från:

http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group-terminology.

6. Scharberg E, Rink G, Portegys J, Rothenberger S, Gillhuber N, Richter E, et al. The Impact of Using Genotyped Reagent Red Blood Cells in Antibody

Identification. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2018; 45:218–24. 7. Säfwenberg J. Förenlighetsprövning. Handbok för blodcentraler. u.o.: Svensk

förening för Transfusionsmedicin. 2009.

8. Rudmann SV. Tesxtbook of Blood Banking and Transfusion Medicine. 2: a upplaga. London: Elsevier Health Sciences; 2005.

9. Theis S, Hashmi M. Coombs Test. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019.

10. Parker V, Tormey CA. The Direct Antiglobulin Test: Indications, Interpretation, and Pitfalls. Arch Pathol Lab Med. 2017; 141:305-10.

11. Darzalex [Internet]. Stockholm: FASS; 2016 [uppdaterad 2020 December 17; citerad 2021 April 17]. Tillgängligt från:

https://www.fass.se/LIF/product?userType=0&nplId=20150911000058 12. Krejcik J, Casneuf T, Nijhof IS, Verbist B, Bald J, Plesner T, et al.

Daratumumab depletes CD38+ immune regulatory cells, promotes T-cell expansion, and skews T-cell repertoire in multiple myeloma. Blood. 2016; 128:384–94.

(27)

23 13. Dizon MF. The Challenges of Daratumumab in Transfusion Medicine.

Laboratory medicine. 2017; 48:6–9.

14. Chari A, Arinsburg S, Jagannath S, Satta T, Treadwell I, Catamero D et al. Blood Transfusion Management in Transfusion-Related Outcomes in

Daratumumab-Treated Patients with Relapsed or Refractory Multiple Myeloma. Clin Lymp, Myl & Leuk. 2018; 18: 44–51.

15. Bub CB, Nagle dos Reis I, Aravechia MG, Santos LD, Bastos EP, Kutner JM et al. Transfusion management for patients taking an anti-CD38 monoclonal antibody. Hematol Transfus Cell Ther. 2018; 40: 25–29.

16. Chapuy CI, Aguad MD, Nicholson RT, AuBuchon JP, Cohn CS, Delaney M et al. International validation of a dithiotreitol (DTT)-based method to resolve the daratumumab interference with blood compability testing. Transfusion 2016; 56:2964–2972.

17. Lancman G, Arinsburg S, Jhang J, Cho HJ, Jagannath S, Madduri D etal. Blood Transfusion Management for Patients Treated With Anti-CD38 Monoclonal Antibodies. Frontiers in Immunology. 2018; 9:2616.

18. Barrientos-Soto MC, Castañeda-García M, Herrera-García H, Padilla-López S, Dimas-Adame MA, Cazares-Tamez R. The use of DTT in the resolution of the interferences generated by daratumumab in the blood bank. Medicina

Universitaria. 2017; 19:127–130.

19. Bub CB. Dithiothreitol treatment of red blood cells. Immunohematology. 2017; 33:170–172.

20. Singh Khandpur RS. Compendium of Biomedical Instrumentation, Water Bath. John Wiley & Sons, Ltd. 2020;1:2099–2101.

(28)

24

8. Bilagor

(29)

25 Bilaga 2