Examensarbete
Jämförelse av genexpression mellan isolat av Dokdonia MED134 som tillvuxit i
konstant ljus kontra konstant mörker med qPCR
Författare: Marcus Stening
Jämförelse av genexpression mellan isolat av Dokdonia MED134 som tillvuxit i konstant ljus kontra konstant mörker med qPCR
Marcus Stening
Examensarbete, Biomedicinsk laboratorievetenskap 15hp Filosofie Kandidatexamen
Handledare: Professor Jarone Pinhassi, LNU institutionen för biologi och miljö, KSL Kalmar
Examinator: Professor Michael Lindberg, LNU institutionen för kemi och biomedicin, Norrgård Kalmar
Examensarbetet ingår i programmet Biomedicinska analytikerprogrammet 180hp
Sammanfattning
Marina bakterier fyller en viktig roll i havens näringscykler. Cirka hälften av alla havsytelevande bakterier kan nyttja ljus som energikälla, förutom organiska
kolföreningar, vilket är viktigt för överlevnad då haven blir sura och näringsfattiga på grund av förändrat klimat. Flavobacteriaceae är en viktig bakterieart som deltar i nedbrytningsfasen av komplexa organiska föreningar i naturligt klimat. Dokdonia donghaensis MED134 tillhör familjen Flavobacteriaceae och nyttjar både kemotrofi och fototrofi som energikälla. För sin fototrofiska förmåga nyttjar bakterien
proteorhodopsin, vilket är en membranbunden protonpump. Detta tillåter bakterien att överleva och tillväxa i näringsfattiga miljöer. Syftet med arbetet var att undersöka med qPCR om det finns en skillnad i genutryck för proteorhodopsin och
isocitratdehydrogenas i Dokdonia donghaensis MED134 beroende på om bakterierna fått tillväxa i konstant ljus eller mörker. Analys med qPCR visade på ett signifikant större genuttryck för proteorhodopsin i de bakterier som fått tillväxa i konstant ljus under sju dagar jämfört med de som fått tillväxa i konstant ljus under tre och fyra dagar och de som fått tillväxa i konstant mörker. Ingen signifikant skillnad kunde påvisas i genuttryck för isocitratdehydrogenas. Detta tyder på att Dokdonia donghaensis MED134 vid näringsbrist kan nyttja ljus som energikälla för överlevnad och vidare tillväxt. Genom att med simulerad klimatförändring påvisa en anpassningsförmåga genom ökat genuttryck kan en vidare förståelse för bakteriernas roll i det marina ekosystemet fås och vidare forskning kan utföras då den marina klimatfrågan blir mer aktuell.
Abstract
Marine bacteria play an important role in the marine nutrition cycles. About half of all sea-living bacteria can use light as an energy source, in addition to organic carbon compounds, which is important for survival as the seas becomes acidic and low in nutrition due to changing climate. The Flavobacteriaceae is a bacterial family that plays an important role in the degradation of complex organic compounds in natural
environments. Dokdonia donghaensis MED134 belongs to the Flavobacteriaceae family and use both chemotrophy and phototrophy as a source of energy. For its phototrophic ability, the bacteria use proteorhodopsin, which is a membrane-bound proton pump. This allows the bacteria to survive and grow in nutrient-poor
environments. The purpose of the study was to investigate with qPCR if there was a difference in gene expression for proteorhodopsin and isocitrate dehydrogenase in Dokdonia donghaensis MED134 depending on whether the bacteria had grown in constant light or darkness. Analysis with qPCR showed a significantly greater gene expression for proteorhodopsin in the bacteria grown in constant light for seven days, compared to those grown in constant light for three and four days and those grown in constant darkness. No significant difference could be demonstrated in gene expression for isocitrate dehydrogenase. This indicates that Dokdonia donghaensis MED134 in nutritional deficiency can use light as a source of energy for survival and further growth. By simulating climate change an adaptability could be seen through increased gene expression. Through this, further understanding of the role of bacteria in the marine ecosystem can be obtained and further research can be conducted as the marine climate issue becomes more relevant.
Nyckelord
qPCR, PCR, Dokdonia MED134, Proteorhodopsin, isocitratdehydrogenas
Förkortningar
PCR – Polymerase chain reaction dNTP – Deoxynukleotidtrifosfat
RT-PCR – Reverse transcription polymerase chain reaction qPCR – Quantitative polymerase chain reaction
PR – Proteorhodopsin
IsoD – Isocitratdehydrogenas
RpoD – Gen som kodar för RNA-polymeras subenhet D RecA – Gen som kodar för Rekombinas A
NADP+ - Nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat TCA-cykeln – Trikarboxylsyracykeln
Innehållsförteckning
1 INTRODUKTION _________________________________________________ - 1 - 1.1 Marina bakterier ________________________________________________ - 1 - 1.2 Dokdonia donghaenis MED134 ____________________________________ - 1 - 1.3 Proteorhodopsin ________________________________________________ - 1 - 1.4 Isocitratdehydrogenas ____________________________________________ - 2 - 1.5 RNA extraktion_________________________________________________ - 3 - 1.6 DNAse behandling ______________________________________________ - 4 - 1.7 PCR __________________________________________________________ - 4 - 1.7.1 RT-PCR ___________________________________________________ - 4 - 1.7.2 qPCR _____________________________________________________ - 5 - 1.8 Prober ________________________________________________________ - 5 - 1.9 StepOnePlus ___________________________________________________ - 5 - 1.10 Syfte ________________________________________________________ - 6 - 2 MATERIAL OCH METOD _________________________________________ - 6 - 2.1 Tillredning av marinagar _________________________________________ - 6 - 2.2 Odling av bakterier ______________________________________________ - 6 - 2.3 RNA-extraktion ________________________________________________ - 7 - 2.3.1 RNAprotect Cell Reagent______________________________________ - 8 - 2.3.2 RNeasy Plus Mini Kit ________________________________________ - 8 - 2.4 DNAsebehandling ______________________________________________ - 8 - 2.5 Kvantifiering och kvalitetskontroll av total-RNA ______________________ - 9 - 2.5.1 Kontroll av DNAsebehandling med PCR och gel ___________________ - 9 - 2.6 qPCR ________________________________________________________ - 10 - 2.7 Statistik och beräkningar ________________________________________ - 10 - 3 RESULTAT _____________________________________________________ - 11 - 3.1 Bakterieväxt __________________________________________________ - 11 - 3.2 Kvantifiering och kvalitetskontroll av extraherat RNA samt renhetskontroll av DNAsebehandling ________________________________________________ - 12 - 3.3 qPCR med statistisk jämförelse av ΔΔCt med One Way ANOVA ________ - 14 - 4 DISKUSSION____________________________________________________ - 17 -
5 Slutsats _________________________________________________________ - 18 -
6 Tack____________________________________________________________ - 19 -
7 REFERENSER __________________________________________________ - 20 - Bilaga A Material _________________________________________________ - 22 -
1 INTRODUKTION
1.1 Marina bakterier
Marina bakterier är en viktig del av marina biogeokemiska näringscykler och
energiflöden (1). Det finns flera arter av marina havsytelevande bakterier varav cirka hälften kan nyttja ljus som energikälla för överlevnad och tillväxt, förutom att nyttja föreningar av organiskt kol (1-3). En av de vanligt förekommande släktena av marina bakterier är Flavobacterium som är gramnegativa, motila, icke sporbildande
stavformade bakterier vilka bildar gula glansiga runda kolonier på fast medium (4).
Flavobacterium spelar en viktig roll i det marina ekosystemet då den deltar i den initiala nedbrytningsfasen av komplexa organiska föreningar (5). Då klimatet förändras och havsmiljön blir surare och förlorar näring i form av kolföreningar måste bakterierna anpassa sig (1). Därför är det viktigt att studera bakterier under simulerade
klimatförändringar för att få en större förståelse för dess funktion i ekosystemet (1).
1.2 Dokdonia donghaenis MED134
Dokdonia donghaensis MED134 är en marin bakterie tillhörande familjen
Flavobacteriaceae och är en fakultativt dubbelmixotrof bakterie vilket innebär att den nyttjar både kemotrofi och fototrofi som energikälla, det vill säga den kan ta upp kolföreningar ur vattnet eller använda ljus till att skapa energi (2). För sin fototrofiska förmåga använder bakterien proteorhodopsin vilket återfinns i cellmembranet och fungerar som ljusdriven protonpump (2, 6, 7). Genom att nyttja fototrofi som
energikälla kan bakterien fortsätta tillväxa även när det är ont om näring i omgivningen (1).
1.3 Proteorhodopsin
Proteorhodopsin är en membranbunden protonpump (Figur 1) som återfinns i ett flertal marina ytlevande bakterier och plankton över hela världen på både RNA- och
proteinnivå (1, 2, 6, 7). Studier har visat att proteorhodopsin har bidragit med tillräcklig näringsupptag för fortsatt tillväxt och överlevnad hos ett flertal marina bakterier, bland andra Dokdonia donghaensis MED134 (2).
Figur 1. Vid exponering för ljus pumpar proteorhodopsin H+ över membranet där det kan användas av ATP-syntas för syntes av ATP (2). (Egen bild, Marcus Stening, 2018).
1.4 Isocitratdehydrogenas
Isocitratdehydrogenas är ett nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP+)-beroende enzym som katalyserar den oxidativa dekarboxyleringen av isocitrat till 2-oxoglutarat och koldioxid länkat till reduktionen av NADP+ i cellens metabola trikarboxylcyracykel (TCA-cykel) (2) (Figur 2). Därigenom kontrolleras det metaboliska flödet mellan TCA- cykeln och glyoxylatshunten. Därför spelar isocitratdehydrogenas en viktig roll i den cellullära metabolismen (8, 9).
Ljus
ATP-
syntas
Figur 2. TCA-cykeln i vilken isocitratdehydrogenas är aktiv och spjälkar isocitrat till 2-oxoglutarat där NADP+ tar upp H+ och bildar NADPH och CO2. (Egen bild, Marcus Stening, 2018).
1.5 RNA extraktion
Vid RNA-extraktion kan kommersiella kit användas. Vid denna studie användes
RNeasy Protect Cell (QIAGEN, Hilden, Tyskland) som ger en lösning för att stabilisera och rena totalRNA från celler. RNA stabiliseras direkt vid användning av RNeasy Protect Cell. Omedelbar stabilisering av RNA i celler är generellt ett krav för pålitlig analys av genuttryck vid användning av RT-PCR eller annan nukleinsyrabaserad teknologi (13).
Vid extraktion av RNA användes RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) som selektivt avlägsnar dubbelsträngat DNA. Celler som stabiliserats i RNAprotect Cell Reagent (QIAGEN, Hilden, Tyskland) centrifugeras och resultatet blir en lyserad och
homogeniserad pellet av genetiskt material vilken förvaras i en starkt denaturerande buffert som i sin tur omedelbart inaktiverar RNaser för att säkerställa isolering av intakt RNA. Etanol tillsätts till lösningen för att ge optimala förhållanden för bindning av RNA. Proverna centrifugeras i en RNeasy spinkolonn där total-RNA binder till membranet och eventuella kontaminationer tvättas bort. Högkvalitativt RNA elueras sedan med RNAsefritt vatten (13).
1.6 DNAse behandling
Vid DNAsebehandling av extraherat RNA användes InvitrogenTM TURBO DNA-free Kit (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA). Kitet är designat för att ta bort kontaminerande DNA från extraherat RNA genom en patentskyddad metod (14).
1.7 PCR
Polymerase chain reaction (PCR) är en molekylärbiologisk metod som används för att amplifiera och undersöka RNA- och DNA-sekvenser (templat) som finns inuti celler, cellkärnor och virus (10, 11). För att komma åt och extrahera det genetiska materialet lyseras cellerna eller viruskapslar (10). Efter lysering av cellen extraheras det genetiska materialet vilket renas upp och blandas med en mix av DNA-polymeras,
deoxynukleotidtrifosfat (dNTP), primers, prober och buffert (10). PCR-reaktionen sker i tre steg; denaturering där provet hettas upp till över 90ºC och dubbelsträngat DNA klyvs, annealing där temperaturen sjunker till mellan 40-60ºC och primers binder in till sina specifika platser i det kluvna DNA’t, samt elongering där temperaturen höjs till 72ºC och DNA-polymeras bygger upp dubbelsträngat DNA med de tillgängliga dNTP som finns utifrån de primers som bundit in (10). Dessa steg ingår i en cykel som repeteras 30-40 gånger (10). PCR kan utföras antingen enligt singleplex-princip där endast ett templat används vilket resulterar i en enda produkt, eller multiplex-principen där flera olika templat används i samma prov vilket resulterar i flera produkter i samma prov (4). Till denna studie har singleplex-principen använts.
1.7.1 RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) är en PCR-metod som tillåter amplifiering av RNA genom att skapa komplementärt DNA (cDNA) från RNA
som sedan används som templat för PCR-reaktionen (10). Under RT-PCR utförs samma cykel som under PCR fast med lägre temperaturer och med ett reverse transcriptase- enzym, alternativt med vissa termostabila DNA-polymeraser som under särskilda omständigheter har reverse transcriptions-aktivitet (10). RT-PCR kan användas som antingen enstegs RT-PCR eller tvåstegs RT-PCR. Under enstegs RT-PCR utförs RT- PCR och PCR under samma program där PCR-instrumentet börjar med en RT-PCR- cykel för att bilda cDNA och fortsätter därefter med 30-40 cykler PCR-reaktion (12).
Under tvåstegs RT-PCR utförs först RT-PCR enligt ett program för att bilda cDNA.
Därefter utförs en vanlig PCR-reaktion enligt ett annat program, det krävs alltså två separata PCR-analyser (4). Till denna studie har enstegs RT-PCR använts.
1.7.2 qPCR
Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) är en PCR-reaktion där kvantitativ mätning av PCR-produkten sker mellan varje cykel (realtids-PCR) eller efteråt och jämförs med ett ickevarierande normalprov, exempelvis PCR-produkt av
housekeepinggener, det vill säga gener som krävs för cellens basala funktioner och alltid finns i cellen, exempelvis RpoD som kodar för RNA-polymeras subenhet D och RecA som kodar för rekombinas A (2). Kvantitativ mätning av PCR-produkt är möjlig genom tillsats av prober som binder in till PCR-produkten och avger fluoroscens vilken kan mätas (10).
1.8 Prober
Prober är korta sekvenser av oligonukleotider eller DNA-kopior vilka är inmärkta med fluorokromer (10). Exempel på vanliga prober är SYBR-green och TaqMan. SYBR- green är en ickespecifik prob som binder in till den stora gängan i dubbelsträngat DNA och fluoroscerar vilket möjliggör ljusdetektion. Begränsningen med SYBR-green är dock att den binder in till samtliga dubbelsträngade DNA-molekyler vilket inte lämpar sig för multiplex-PCR (10).
1.9 StepOnePlus
StepOnePlus (Applied Biosystems, ThermoFisher SCIENTIFICS, Waltham,
Massachusetts, USA) är ett realtids-PCR-instrument som nyttjar 96-håls provplattor och
mäter produkt genom fluoroscens (12). StepOnePlus kan utföra kvantitativa mätningar (qPCR) före (pre-PCR), under (realtids-PCR) eller efter (post-PCR) PCR-reaktionen (12). Det är även möjligt att nyttja både enstegs eller tvåstegs RT-PCR (12).
StepOnePlus använder främst metoder med standardkurva, relativ standardkurva samt jämförelse av Ct-värden för att beräkna kvantitet av PCR-produkt (12).
1.10 Syfte
Syftet med arbetet var att undersöka med qPCR om det finns en skillnad i genutryck för proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas i Dokdonia donghaensis MED134 beroende på om bakterierna fått tillväxa i konstant ljus eller mörker.
2 MATERIAL OCH METOD
Allt laborativt arbete utfördes med sterilteknik.
2.1 Tillredning av marinagar
Av DifcoTM Marine Agar vägdes 55.1g upp och blandades med Milli-Q-vatten till slutvolym 1L. Agarlösningen värmdes på kokplatta upp till 150ºC under 30 minuter under magnetomrörning. Efter att pulvret löst sig autoklaverades lösningen under tre timmar (uppvärmning till 121ºC varefter avsvalning). Den flytande agarn portionerades sedan upp i petriskålar och fick stelna och torka under tre dygn i rumstemperatur varefter de sattes in i kylskåp (2-8°C) för förvaring.
2.2 Odling av bakterier
En koloni av isolat från Dokdonia donghaensis MED134 (Tabell I) togs från DifcoTM Marine Agar 2216 med bakterieväxt och ympades i 1mL DifcoTM Marine Broth 2216 (Bilaga A) och löstes upp genom blandning med pipett och vortexblandning.
Spädningar med DifcoTM Marine Broth 2216 gjordes från den uppslammade kolonin upp till 106. Från spädningarna överfördes med automatpipett 50µL och ströks ut på DifcoTM Marine Agar 2216 (två plattor/spädningsgrad) och inkuberades i aerob miljö (22°C, 18-19 lux ljus, alternativt mörkt) (Tabell I). Tillväxt kontrollerades varje dag och kolonistorlek mättes med skjutmått.
Tabell I. Grupper av isolat från Dokdonia donghaensis MED134 med kollaborerande provnummer, generations-ID samt tillväxtklimat.
Grupp Provnummer Generation Tillväxtmiljö
Mörkt 3-4 M1 t154A Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M2 t145B Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M3 t154C Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M4 t145D Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M5 t154E Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M6 t145F Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M7 t154G Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M8 t145H Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M9 t154I Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M10 t145J Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M31 t155A Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M32 t155E Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
M33 t155G Mörkt, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar
Ljust 3-4
M11 t154A Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M12 t145B Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M13 t154C Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M14 t145D Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M15 t154E Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M16 t145F Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M17 t154G Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M18 t145H Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M19 t154I Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M20 t145J Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M34 t146B Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M35 t146H Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar M36 t155A Ljust, aerob miljö, 22°C, 3-4 dagar Mörkt 7
M41 t76A Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M42 t73B Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M43 t76C Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M44 t73D Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M45 t76E Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M46 t73F Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M47 t76G Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M48 t73H Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M49 t76I Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M50 t73J Mörkt, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
Ljust 7
M51 t77A Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M52 t73B Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M53 t77C Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M54 t73D Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M55 t77E Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M56 t73F Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M57 t77G Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M58 t73H Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M59 t77I Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
M60 t73J Ljust, aerob miljö, 22°C, 7 dagar
2.3 RNA-extraktion
2.3.1 RNAprotect Cell Reagent
Bakteriekolonier Dokdonia donghaensis MED134 (Tabell I) togs efter tre respektive fyra dagars tillväxt på DifcoTM Marine Agar 2216 med 1µL plastplatinös och
slammades upp i 1,5mL märkta eppendorfrör innehållande 1mL RNAprotect Cell Reagent (QIAGEN, Hilden, Tyskland) (Bilaga B) genom blandning med pipett och vortexblandning. Rören centrifugerades vid 3260xg under fem minuter varefter supernatanten avlägsnades och pelletarna frystes i -80ºC.
2.3.2 RNeasy Plus Mini Kit
Pelletarna togs ur frysförvaring och tinades på is. Då pelletarna tinat lösgjordes de från rören genom fingerknackningar och löstes upp med 600µL Buffer RLT Plus
innehållande 1% β-merkaptoetanol (QIAGEN, Hilden, Tyskland) genom blandning med automatpipett och vortexblandning. Etanol (70%, 600µL) tillsattes till RNA-lösningen och blandades väl varefter av RNA-lösningen fördes till RNeasy spinkolonn (QIAGEN, Hilden, Tyskland) som centrifugerades i 15 sekunder vid 8000xg. Till kolonnen
applicerades 700µL Buffer RW1 för tvätt av kolonnmembranet (QIAGEN, Hilden, Tyskland) varefter kolonnen centrifugerades i 15 sekunder vid 8000xg. Därefter
applicerades 500µL Buffer RPE (QIAGEN, Hilden Tyskland) för tvätt av RNA varefter kolonnen centrifugerades i 15 sekunder vid 8000xg. Detta steg utfördes en gång till men då med centrifugering vid 8000xg under två minuter. Kolonnen centrifugerades därefter vid maxhastighet under en minut för att med säkerhet få bort all Buffer RPE. RNeasy spinkolonnen placerades sedan i ett 1,5mL uppsamlingsrör (QIAGEN, Hilden, Tyskland) och 50µL RNasefritt vatten applicerades direkt på membranet. Efter en minuts inkubering i rumstemperatur centrifugerades kolonnen under en minut vid 8000xg för att eluera RNA. Detta steg utfördes därefter igen med ytterligare 50µL RNasefritt vatten för att med säkerhet få med allt RNA.
2.4 DNAsebehandling
DNAsebehandling utfördes med InvitrogenTM AmbionTM TURBO DNA-free kit (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham Massachusetts, USA). Från extraherat RNA överfördes med automatpipett 60µL till ett 0,2mL PCR-rör. Till röret tillsattes 6µL 10x DNase I Buffer och 1µL DNase I varefter röret inkuberades under 30 minuter i 37ºC.
Efter inkuberingen vortexblandades inaktiveringsreagenset innan 6µL applicerades till
det inkuberade röret som därefter inkuberades under 5 minuter i rumstemperatur med stundvis omblandning. Efter inkubering i rumstemperatur centrifugerades röret i 90 sekunder i 10000xg varefter DNasebehandlat RNA överfördes till ett sterilt 1,5mL eppendorfrör.
2.5 Kvantifiering och kvalitetskontroll av total-RNA
Kvantifiering av DNAsebehandlat RNA utfördes på InvitrogenTM Qubit 2.0
Fluorometer (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA) genom att tillreda reagenslösning till vilken RNA applicerades. Lösningen tillreddes genom att blanda 199µL Qubit RNA HS Buffer och 1µL Qubit RNA HS Reagens per prov som skulle analyseras. Lösningen vortexblandades. Av den tillredda reagenslösningen togs 198µL till rör passande InvitrogenTM Qubit 2.0 till vilket 2µL extraherat RNA tillsattes.
Efter vortexblandning och inkubering under två minuter i rumstemperatur analyserades extraherat RNA mot en standardkurva med InvitrogenTM Qubit 2.0. Resultatet visades i ng/mL vilket fick konverteras till ng/µL.
Kvantifiering och kvalitetskontroll av RNA utfördes med NanoDrop 2000
Spectrophotometer (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA).
Genom att applicera 2µL extraherat RNA på mätplattan gavs ett värde på kvantitet ut i ng/µL och ett kvalitetsvärde genom jämförelse av våglängder A260/280nm varav optimalt värde låg runt 1,80-2,20.
2.5.1 Kontroll av DNAsebehandling med PCR och gel
För att säkerställa att DNAsebehandlingen fungerat utfördes PCR för DNA för genen 16S. Detta genom att tillreda en mastermix innehållande 23µL Milli-Q-vatten, 0,5µL primer 27F (10pmol/µL) och 0,5µL primer 1492R (10pmol/µL) per prov som skulle kontrolleras. Mastermixen tillsattes till 0,2mL PCR-rör illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR beads (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA). Slutligen tillsattes 1µL extraherat RNA till mastermixen och PCR utfördes med Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) enligt program 95ºC under 2 minuter, 40 cykler 95ºC i 30 sekunder, 50ºC under 30 sekunder och 72ºC under 45 sekunder. Programmet avslutades med 72ºC under 7 minuter för att till sist sjunka till 4ºC. Därefter blandades 5µL PCR-produkt med 2µL loading dye (Bilaga A) per prov
och 5µL av PCR-produktblandningen applicerades på en 1% agarosgel (Bilaga A) per gel. I brunnar på gelen applicerades 5µL GeneRuler 1 kb DNA Ladder 0,1µg/µL (ThermoFisher SCIENTIFIC, Waltham, Massachusetts, USA) positiv och negativ kontroll samt upp till nio prover från PCR. Elektroforesen gick under 40 minuter i 89V.
Efter avslutad elektrofores lades gelen i etidiumbromid under cirka 20 minuter innan den fotograferades i UV-ljus med Quantity One (BIO-RAD Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA).
2.6 qPCR
Inför qPCR förbereddes PCR-platta (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) genom applicering av 9µL mastermix (Bilaga A) innehållande forward och reverse primers (Tabell II) till samtliga av de brunnar som skulle användas samt applicering av prover som skulle analyseras (1µL per brunn). Som positiv kontroll användes en pool av samtliga 26 prover och som negativ kontroll RNasefritt vatten.
qPCR utfördes på StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) med singleplex-princip och enstegs RT-PCR enligt
programmering 48ºC under 30 sekunder för reverse transkription, 95ºC under 10 minuter för enzymaktivering, 40 cykler av 95ºC under 15sekunder för denaturering och 60ºC under. 60 sekunder för annealing och elongering samt plattavläsning.
Tabell II. Sekvenser över forward och reverse primers för proteorhodopsin, isocitratdehydrogenas, RpoD och RecA.
Gen Forward primer Reverse primer
Proteorhodopsin AACCGGATACATAGGCGAAG ACAGCTCCACCTGCCCTTAC
Isocitratdehydrogenas AGTATGGGTGCTTGGAGTGC CGTATGTTGCCTGCCTCTTT
RpoD CACGGTCAGGGTTAGGTGAT TGCAAAGGAGCTGGATATGA
RecA ACTCAAAAATGGGGCTTCAC CCCGTAGTAGTCTCTGGGTTTC
2.7 Statistik och beräkningar
Analysresultatet analyserades med hjälp av SPSS (version 24). Då analysresultatet bygger på jämförelser mellan fyra grupper (ljus tre-fyra dagar, mörk tre-fyra dagar, ljus sju dagar och mörk sju dagar) valdes analysen baserad på One way ANOVA och presenteras i resultatet som medelvärde och standardeviation. Utifrån multipla grupper
användes Tukey Post Hoc-test i jämförelse mellan grupperna. Statistisk signifikansnivå var satt till 0.05 (15). De Ct-värden som gavs utifrån analys med qPCR jämfördes mot Ct-värden från housekeepinggener RpoD och RecA för att få ΔCt. De olika ΔCt jämfördes därefter mot varandra för att få ΔΔCt (2).
3 RESULTAT
3.1 Bakterieväxt
Isolat från Dokdonia donghaensis MED134 som odlats på DifcoTM Marine Agar 2216 kunde synligt observeras efter ett dygns tillväxt och tillväxte därefter med upp till 0,7mm/dygn (Tabell III). Både koloniernas diameter och area visade på att bakterierna var i exponentiell tillväxtfas efter tre och fyra dagar då material togs inför RNA- extraktion (Figur 3 och 4).
Tabell III. Medelvärden från uppmätt diameter och area från bakteriekolonier från isolat Dokdonia donghaensis MED134 som fått tillväxa under fem dagar på DifcoTM Marine Agar 2216 i
aerob miljö i konstant ljus eller mörker vid 22°C.
MED134 ljust 3-4 MED134 mörkt 3-4 Tid
(dagar) Diameter (mm) Area (mm2) Diameter (mm) Area (mm2)
0 0 0 0 0
1 0,2 0,13 0,2 0,13
2 0,8 2,01 0,8 2,01
3 1,5 7,07 1,5 7,07
4 2,1 13,85 2,3 16,61
5 2,8 24,62 2,9 26,41
Figur 3. Graf över bakteriekoloniernas medelvärden för tillväxt i diameter (mm) över fem dagars tillväxt på DifcoTM Marine Agar 2216. Pilarna visar på den tid material togs inför RNA-extraktion.
Figur 4. Graf över koloniernas medelvärde för tillväxt i area (mm2) över fem dagars tillväxt på DifcoTM Marine Agar 2216. Pilarna visar på den tid material togs inför RNA-extraktion.
3.2 Kvantifiering och kvalitetskontroll av extraherat RNA samt renhetskontroll av DNAsebehandling
Kvantifiering av extraherat RNA med Qubit 2.0 och NanoDrop 2000 visade att RNA- extraktionen fungerat och att kvaliteten på RNA var godkänt (önskvärda värden för A260/280 = 1,80-2,20) (Tabell IV). Vid kontroll av DNAsebehandling utfördes PCR på 16S-genen för extraherat RNA för samtliga isolat från Dokdonia donghaensis MED134
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
0 1 2 3 4 5 6
Diameter (mm)
Tid (dagar)
Light Dark
0 5 10 15 20 25 30
0 1 2 3 4 5 6
Area (mm2)
Tid (dagar)
Light Dark Ljus Mörk
Ljus Mörk
och gelelektroforesen visade på orenhet hos åtta prover innehållande extraherat RNA, då ett band kunde ses likt det på kontrollstegen (Figur 5). Dessa prover
DNAsebehandlades en gång till (Figur 6) och omkontrollerades på gel (Tabell IV).
Figur 5. Färgad gel från PCR för 16S-genen efter elektrofores. Band av DNA är synliga (grön pil) och kan jämföras mot DNA-stegen.
Figur 6. Färgad gel från PCR för 16S-genen efter elektrofores efter andra DNAsebehandlingen. Inga band av DNA är längre
synliga för de åtta proverna som DNAsebehandlades igen.
Tabell IV. Uppmätta RNA-koncentrationer för samtliga RNA-extraherade isolat från Dokdonia donghaensis MED134 med InvitrogenTM Qubit 2.0 Fluorometer samt kvalitetskontroll genom våglängderna 260/280 på NanoDrop 2000.
3.3 qPCR med statistisk jämförelse av ΔΔCt med One Way ANOVA
Smältkurva över amplifieringen under qPCR visade på produkt av generna
proteorhodopsin, isocitratdehydrogenas samt housekeepinggenerna RpoD och RecA (Figur 7-10). Smältkurva visade även på eventuell primerdimer för proteorhodopsin på första och andra körningen (Figur 9). One Way ANOVA med Tukey Post HOC-test (p
2:a DNAsebehandlingen
Provnummer
Koncentration Qubit ng/µL
Koncentration
Nanodrop ng/µL A260/280
Koncentration Qubit
Koncentration
Nanodrop A260/280
M1 16,9 26,3 1,74
M2 34,3 45,5 1,95 29,8 39,1 1,76
M3 18,3 25,6 1,78
M4 26,8 39,8 1,85 23,8 34,5 1,75
M5 48,0 79,2 1,95 39,9 64,8 1,88
M6 25,7 51,3 1,87 25 44,7 1,74
M7 23,8 41,3 1,87 20,7 35 1,71
M8 41,5 60,5 1,92 30,8 51,4 1,77
M9 24,5 31,3 1,85
M10 42,4 68,5 1,90
M11 20,9 30,1 1,80
M12 23,9 37,3 1,78
M13 16,0 24,0 1,68
M14 8,44 11,8 1,53
M15 16,4 27,9 1,73
M16 28,0 46,5 1,82
M17 32,7 64,1 1,75
M18 35,1 67,6 1,8
M19 24,8 38,2 1,81
M20 35,3 50,7 1,86
M31 30,2 76,6 1,77 27,8 59,2 1,73
M32 33,2 58,8 1,86 30 55,2 1,71
M33 27,5 58,8 1,75
M34 24,7 54,7 1,79
M35 12,3 19 1,56
M36 28,7 53 1,79
= 0,05) visade på en signifikant skillnad i genuttryck för proteorhodopsin hos de isolat av Dokdonia donghaensis MED134 som fått tillväxa i ljus under sju dagar då de hade ett större uttryck jämfört med de isolat som fått tillväxa en kortare tid i ljus och de isolat som fått tillväxa i mörker (Figur 12). Ingen signifikant skillnad kunde påvisas för genuttryck av isocitratdehydrogenas hos någon grupp av isolat (Figur 13).
Figur 7. Smältkurva för qPCR-produkt av proteorhodopsingenen vid 78,74°C.
Figur 8. Smältkurva för qPCR-produkt av isocitratdehydrogenasgenen vid 78,74°C.
Figur 9. Smältkurva för qPCR-produkt av RpoD-genen vid 74,39°C.
Figur 10. Smältkurva för qPCR-produkt av RecA-genen vid 76,50°C.
Figur 11. Smältkurva för qPCR-produkt med primerdimer eller kontamination av proteorhodopsingenen.
Figur 12. ANOVA boxplot för isolat av Dokdonia donghaensis MED134 med jämförelse av ΔΔCt-värde för genuttryck av proteorhodopsin mellan de fyra grupperna.
Figur 13. ANOVA boxplot för isolat av Dokdonia donghaensis MED134 med jämförelse av ΔΔCt-värde för genuttryck av isocitratdehydrogenas mellan de fyra grupperna.
4 DISKUSSION
Syftet med arbetet var att undersöka med qPCR om det finns en skillnad i genutryck för proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas i Dokdonia donghaensis MED134 beroende på om bakterierna fått tillväxa i konstant ljus eller mörker.
Följandet av isolatens tillväxt på DifcoTM Marine Agar visade att isolaten fortfarande var under tillväxtstadiet då material togs till RNA-extraktion vilken var av intresse för det relativa genuttrycket av proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas för isolat tillväxande i mörker jämfört med isolat tillväxande i ljus. Kvantifiering av extraherat RNA visade att tillräckliga mängder extraherats och kvalitetskontrollen med NanoDrop 2000 visade att extraherat RNA var av tillräcklig renhet för utförande av qPCR. Genom den extra kvalitetskontrollen med PCR för 16S-genen och gelelektrofores upptäcktes kvarvarande DNA i åtta av isolaten vilka genom ytterligare en DNAsebehandling uppnådde tillräcklig renhet för qPCR. Analys med qPCR visade på amplifiering av de
sökta målgenerna för proteorhodopsin och isocitratdehydrogenas och för de båda referensgenerna RpoD och RecA. Dock visade smältkurvan för analysen amplifiering av annan produkt än proteorhodopsin för ett flertal av proverna på de två första
körningarna vilket misstänktes bero på primerdimerer eller mer sannolikt kontamination (Figur 9). Detta bekräftades genom PCR-analys och gelelektrofores för kontroll av DNA för proteorhodopsin i isolaten samt byte av primerstock. PCR och gelelektrofores visade på intakt DNA utan mutationer och smältkurvan visade efter primerbytet på amplifiering av den sökta produkten (Figur 5). Genom utförandet av One Way ANOVA med Tukey Post HOC-test (p = 0,05) påvisades att det var en signifikant skillnad i genuttryck för proteorhodopsin mellan isolat som tillväxt sju dagar i ljus jämfört med de isolat som tillväxt i tre respektive fyra dagar i ljus och signifikant de isolat som tillväxt i mörker. Detta är mest troligt för att näringen i tillväxtmediumet begränsas efter längre tillväxt än fyra till sju dagar och bakterierna måste då anpasa sig vilket de kan med hjälp av proteorhodopsinet vid tillgång till ljus, men inte i mörker. Dock påvisades ingen signifikant skillnad för genuttryck av isocitratdehydrogenas mellan de olika
isolatgrupperna, detta mest troligt för att TCA-cykeln drivs normalt och ingen faktor har påverkat isolaten annorlunda och kunnat triggat igång en förändring i genuttryck för isocitratdehydrogenas.
5 Slutsats
Slutsatsen för denna studie blev att isolat av Dokdonia donghaensis MED134
som fått tillväxa i konstant ljus vid 22°C under sju dagar åt gången visade på ett större genuttryck för proteorhodopsin jämfört med de isolat som fått tillväxa i tre respektive fyra dagar åt gången och de isolat som fått tillväxa i mörker. Detta tyder på att
Dokdonia donghaensis MED134 vid näringsbrist i sin omgivning kan anpassa sig och nyttja ljus som energikälla för fortsatt tillväxt och överlevnad. Ingen signifikant skillnad kunde påvisas i genuttrycket för isocitratdehydrogenas mellan de olika isolatgrupperna, då ingen faktor kunnat påverka genuttrycket. Genom att med simulerad
klimatförändring påvisa en anpassningsförmåga genom ökat genuttryck för
proteorhodopsin kan en vidare förståelse för bakteriernas roll i det marina ekosystemet fås och vidare forskning kan utföras då den marina klimatfrågan blir mer och mer aktuell.
6 Tack
Ett stort tack till min handledare professor Jarone Pinhassi för gott handledande, bra stöd och för möjligheten att få utföra examensarbetet, även ett stort tack till doktorand Carina Bunse och labtekniker Camilla Karlsson för god upplärning, laborativt stöd och gott handledande. Tack till labtekniker Sabina Arnautovic, doktorand Benjamin
Pontiller och doktorand Christofer Karlsson för god upplärning och laborativt stöd.
Också ett stort tack till samtliga forskare på KSL för den goda stämning och trevliga arbetsmiljön som råder!
7 REFERENSER
1. Bunse C, Lundin D, Karlsson CMG, Akram N, Vila-Costa M, Palovaara J, et al. Response of marine bacterioplankton pHhomeostasis gene
expression to elevated CO22016; 6:[483-7 pp.].
2. Palovaara J, Akram N, Baltar F, Bunse C, Forsberg J, Pedrós-Alió C, et al.
Stimulation of growth by proteorhodopsin phototrophy involves regulation of central metabolic pathways in marine planktonic bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(35):E3650-8. Epub 2014/08/18.
3. Muthusamy S, Baltar F, González JM, Pinhassi J. Dynamics of metabolic activities and gene expression in the Roseobacter clade bacterium
Phaeobacter sp. strain MED193 during growth with thiosulfate. Appl Environ Microbiol. 2014;80(22):6933-42. Epub 2014/08/29.
4. Bernardet J-F, Segers P, Vancanneyt M, Berthe F, Kersters K, Vandamme P. Cutting a Gordian Knot: Emended Classification and Description of the Genus Flavobacterium, Emended Description of the Family
Flavobacteriaceae, and Proposal of Flavobacterium hydatis norn. nov. (Basonym, Cytophaga aquatilisStrohl and Tait 1978).
Int J Syst Bacteriol. 1996;46(1):128-48.
5. Hahnke RL, Harder J. Phylogenetic diversity of Flavobacteria isolated from the North Sea on solid media. Syst Appl Microbiol. 2013;36(7):497- 504. Epub 2013/08/16.
6. Kwon YM, Kim SY, Jung KH, Kim SJ. Diversity and functional analysis of light-driven pumping rhodopsins in marine Flavobacteria.
Microbiologyopen. 2016;5(2):212-23. Epub 2015/12/13.
7. Bamann C, Bamberg E, Wachtveitl J, Glaubitz C. Proteorhodopsin.
Biochim Biophys Acta. 2014;1837(5):614-25. Epub 2013/09/20.
8. Hirota R, Tsubouchi K, Takada Y. NADP. Extremophiles.
2017;21(4):711-21. Epub 2017/04/26.
9. Romkina AY, Kiriukhin MY. Biochemical and molecular
characterization of the isocitrate dehydrogenase with dual coenzyme specificity from the obligate methylotroph Methylobacillus Flagellatus.
PLoS One. 2017;12(4):e0176056. Epub 2017/04/19.
10. Wilson K, Walker JM. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. 7th ed. Cambridge: Cambridge University Press;
2010. xvi, 744 s. p.
11. Bauman RW, Machunis-Masuoka E. Microbiology : with diseases by taxonomy. 4th ed. San Francisco, Calif.: Benjamin-Cummings; 2013. xxiv, 912 s. p.
12. ThermoFisherSCIENTIFIC. Applied Biosystems StepOne and
StepOnePlus Real-Time PCR Systems - Relative Standard Curve and Comparative CT Experiments.
http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4376600
13. QIAGEN. RNAprotect Cell Reagent Handbook. 3 ed: QIAGEN; 2014. p.
8-21.
14. SCIENTIFIC T. Invitrogen TURBO DNA-free Kit. ThermoFisher SCIENTIFIC; 2018.
15. Wahlgren L. SPSS - steg för steg. Lund: Studentlitteratur AB; 2011. 188 p.
Bilagor
Bilaga A Material
DifcoTM Marine Agar 2216 Pepton 5.0g/L
jästextrakt 1.0g/L ferricitrat 0.1g/L natriumklorid 19.45g/L magnesiumklorid 8.8g/L natriumsulfat 3.24g/L kalciumklorid 1.8g/L kaliumklorid 0.55g/L natriumbikarbonat 0.16g/L kaliumbromid 0.08g/L agar 15.0g/L
strontiumklorid 34.0mg/L borsyra 22.0mg/L
natriumsilikat 4.0mg/L natriumfluorid 2.4mg/L ammoniumnitrat 1.6mg/L dinatriumfosfat 8.0mg/L DifcoTM Marine Broth 2216 Pepton 5.0g/L
jästextrakt 1.0g/L ferricitrat 0.1g/L natriumklorid 19.45g/L magnesiumklorid 5.9g/L magnesiumsulfat 3.24g/L kalciumklorid 1.8g/L kaliumklorid 0.55g/L natriumbikarbonat 0.16g/L kaliumbromid 0.08g/L strontiumklorid 34.0mg/L borsyra 22.0mg/L
natriumsilikat 4.0mg/L natriumfluorid 2.4mg/L ammoniumnitrat 1.6mg/L dinatriumfosfat 8.0mg/L Loading dye
0,0625g OrangeG
10g sackaros löst i 25mL Milli-Q-vatten Agarosgel 1%
0,5g SeaKem LE Agarose
50mL 1xTAE buffer (242g TRIS, 57,1mL ättiksyra, 100mL 0,5M EDTA pH 8,0 löst i 1000mL Milli-Q-vatten ger 50xTAE. 200mL 50xTAE spädes till 10L med avjoniserat vatten för 1xTAE buffer)
PCR Mastermix
3,02µL RNasefritt vatten
5µL Power SYBR Green RT-qPCR mix (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA)
0,45µL forward primer (10pmol/µL) 0,45µL reverse primer (10pmol/µL)
0,8µL RT enzyme (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA)
Linnéuniversitetet
Kalmar Växjö Lnu.se
