Hållbarhetsstudier av cancerassocierat antigen 15 3, 19 9 och 125 i primärrör

(1)

Fakulteten för hälso- och livsvetenskap

Examensarbete

Hållbarhetsstudier av

cancerassocierat antigen 15–3, 19–

9 och 125 i primärrör

Författare:Sofie Johansson

Ämne:Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå::Grundnivå

(2)

Hållbarhetsstudier av cancerassocierat antigen 15–3, 19–9 och 125 i primärrör

Sofie Johansson

Examensarbete i biomedicinsk laboratiorievetenskap, 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen

Extern handledare:

Kim Norell, Sjukhuskemist Klinisk Kemi och transfusionsmedicin Länssjukhuset i Kalmar

391 85 Kalmar Intern handledare:

Camilla Mohlin, PhD Institutionen för kemi och biomedicin Linneuniversitetet

391 82 Kalmar Examinator:

Sven Tågerud, Professor Institutionen för kemi och biomedicin Linneuniversitetet

391 82 Kalmar

Examensarbetet ingår i programmet Biomedicinska analytikerprogrammet, 180 högskolepoäng

Sammanfattning

Cancerassocierade antigen (CA) används vid diagnostisering, prognosbestämning och för att följa behandling vid cancer. Exempel på CA är CA 15–3, CA 19–9 och CA 125. Syftet med arbetet var att undersöka hållbarheten för blodprover förvarade i primärrör som skulle analyseras för CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 och jämföra med nuvarande metod på klinisk kemi, Oskarshamn, Region Kalmar län. Enligt nuvarande metod överförs plasman till nya provrör innan analys. Metoden som användes var att dubbelprov togs och det ena förvarades i primärrör och analyserades på Roche Cobas 411® tre, fem och tio dagar efter provtagning. Det andra provet överfördes till nytt provrör inför analys. Den procentuella skillnaden mellan analys av CA i primärrör och överfört prov beräknades.

För alla tre analyserna var den procentuella skillnaden störst hos de lägsta koncentrationerna av CA. Medelvärde för analyserna av CA, standardavvikelse (SD) och variationskoefficient beräknades. SD för CA jämfördes mot kontrollerna MAS Omni Immune Pro 1 och MAS Omni Immune Pro 3s SD. Provernas SD var mindre för kontrollerna förutom för CA 19–9 >1100 kIE/L. I den gruppen analyserades dock för få

(3)

analyser för att utföra statistisk analys och gav därmed ingen slutsats hur CA 19–9 påverkades av de olika förvaringarna. För övriga analyser och för CA 19–9 i lägre koncentrationer kunde slutsatsen dras att prover kunde förvaras i primärrör i tio dagar

utan att analysresultatet påverkades.

Nyckelord

Roche Cobas 411, Cancerassocierat antigen 15–3, Cancerassocierat antigen 19–9, Cancerassocierat antigen 125, Hållbarhet

(4)

Abstract

Cancer-associated antigens (CA) are used for diagnosis, establish prognosis and to monitor treatment of cancer. Three CA are CA 15-3, CA 19-9 and CA 125. The aim of this study was to evaluate the stability of CA 15-3, CA 19-9 and CA 125 blood samples in primary tubes coated with Litium-heparin gel and compare the results with the method used at Klinisk Kemi Oskarshamn, Region Kalmar where the samples today are transferred to new tubes before analysis. In this study two samples were collected from each patient, one was stored and analyzed according to the current method. The other sample was stored in the primary tube and analyzed three, five and ten days after collection. Roche Cobas 411 instrument was used for analysis. The mean value for the samples in primary tubes was compared to the current method and were calculated in percent. The difference was more distinct when the concentration of the analyte was low. The mean value, standard deviation (SD) and variation coefficient were calculated for each analyte. The SD of the samples were compared to the SD of the controls IM 1 and IM3. All the obtained SD from the samples were lower than the control SD, except for CA 19-9 > 1100 kIE/L. Unfortunately, there were only three test results in the concentration interval and therefore no statistic conclusion could be made. The conclusion for the other analytes CA 15-3, CA 125 and CA 19-9 in lower

concentrations was that the storage in primary tubed up to ten days did not affect the test results.

Keywords

Roche Cobas 411, Cancer associated antigen 15–3, Cancer associated antigen 19–9, Cancer associated antigen 125, Stability

(5)

Förkortningar

CA Cancerassocierat antigen

CA 15–3 Cancerassocierat antigen 15–3 CA 19–9 Cancerassocierat antigen 19–9 CA 125 Cancerassocierat antigen 125

CV % Variationskoefficient

ECLIA Elektrokemiluminiscensimmunanalys

IE Internationell enhet

Ru Rutenium

TPA Tripropylamin

SD Standardavvikelse

(6)

Innehållsförteckning

1 Introduktion _________________________________________________________ 1 1.1 Cancerassocierat antigen 15–3 _______________________________________ 1 1.2 Cancerassocierat antigen 19–9 _______________________________________ 2 1.3 Cancerassocierat antigen 125 ________________________________________ 2 1.4 Analysinstrumentet Cobas 411 _______________________________________ 3 1.4.1 Analysprincip _________________________________________________ 3 1.4.2 Kvalitetssäkring _______________________________________________ 4 1.5 Provhantering ____________________________________________________ 4 1.5.1 Nuvarande provhantering _______________________________________ 5 1.6 Syfte ___________________________________________________________ 5 2 Material och metod ___________________________________________________ 6 2.1 Provmaterial _____________________________________________________ 6 2.2 Reagens _________________________________________________________ 6 2.3 Kalibrering ______________________________________________________ 6 2.4 Kontroller _______________________________________________________ 6 2.5 Hållbarhetsstudie _________________________________________________ 7 2.6 Statistik _________________________________________________________ 7 2.7 Etik ____________________________________________________________ 7 3 Resultat _____________________________________________________________ 8 3.1 CA 15–3 ________________________________________________________ 8 3.2 CA 19–9 ________________________________________________________ 9 3.3 CA 125 ________________________________________________________ 11 4 Diskussion __________________________________________________________ 12 Tack ________________________________________________________________ 15 Referenser ___________________________________________________________ 16 Bilaga I Analysresultat för CA 15–3

Bilaga II Analysresultat för CA 19–9 Bilaga III Analysresultat för CA 125

(7)

1 Introduktion

Inom cancerdiagnostiken används olika former av analyser som radiologiska, analys av vävnadsprov och kroppsvätskor. En typ av analys är tumörmarkörer eller biomarkörer i blod. Det är oftast molekyler så som enzymer och proteiner (1). En ideal tumörmarkör ska förekomma i låga halter hos friska individer. Istället uppregleras eller produceras markören av tumören så att halten i blodet ökar (2). Markören ska dessutom helst kunna kopplas till endast en cancertyp. Koncentrationerna av tumörmarkörer i blodet ska gärna kunna spegla sjukdomsstadiet och ge prognos inför terapival. Tumörmarkörer kan också användas för att följa sjukdomens utveckling före och efter behandling av cancern (1, 3).

Beroende på tumörmarkörens egenskaper och specificitet kan de användas för screening för att upptäcka nya cancerfall, exempelvis prostataspecifikt antigen (PSA), men de flesta markörerna används för att följa redan konstaterad cancer (4). Tumörmarkörerna kan delas in i två klasser, cancerspecifika antigen och cancerassocierade antigen (CA).

Cancerspecifika antigen kan endast uttryckas av cancerceller medan cancerassocierade antigen kan produceras av normala och friska celler men också tumörceller (5).

CA är som det hörs på namnet antigen, ett antigen kan kännas igen utav antikroppar. Den delen av antigen som en antikropp kan känna igen och binda in till kallas för epitop. Ett antigen kan ha flera epitoper vilket gör att flera olika antikroppar kan binda till antigenet.

Antikroppar är glykoproteiner och de kan vara antingen monoklonala eller polyklonala.

Monoklonala antikroppar är identiska antikroppar som producerats av en B-cellsklon (3).

Monoklonala antikroppar är mycket specifika för just ett epitop på ett antigen.

Antikropparna kan tillverkas i laboratorier genom att möss vaccineras med antigen. Det leder till att musens B-celler stimuleras att producera antikroppar. Musens mjälte avlägsnas och cellerna i den isoleras. Cellerna fuseras sedan med tumörceller som kan dela sig snabbt, vilket ger många kopior av antikroppar. Antikropparna renas fram och kan användas för analys med immunologiska metoder. De flesta metoder för analys av tumörmarkörer och CA är baserade på immunologiska metoder. Metoderna utnyttjar monoklonala antikroppars specifika bindning till antigen för att detektera analyten (3, 6).

1.1 Cancerassocierat antigen 15–3

Cancerassocierat antigen 15–3 (CA 15–3) är ett mucin som produceras främst av epitel i bröstkörtelgångarna men kan även produceras av andra epitelceller som lungepitel.

Mucinet består till största del av glykoproteiner och har en molekylmassa på cirka 300

(8)

kDa. CA 15–3 kan definieras med hjälp av två monoklonala antikroppar DF3 och 115- D8 som kan används vid analys av CA 15-3 (1, 7). Halten av CA 15–3 i blodet ökar vid bröstcancer, och vid metastaserande ovarie-, pankreas- och koloncancer. CA 15–3 kan också öka vid graviditet och leversjukdomar (1). Referensvärdet för CA 15-3 är <25 kIE/L (8), vid värden> 50 kIE/L finns en stor risk för metastaserande cancer. Analys av CA 15–3 i blod används främst för att följa utvecklingen av bröstcancer efter behandling mot cancern. Koncentrationen av CA 15–3 i blodet ska vara stabil efter behandling och stiger värdet mer än 50 % tyder det på recidiv (1, 9). CA 15–3 kan inte användas som enskild markör för att diagnostisera bröstcancer eftersom den inte är cancerspecifik.

Koncentrationen av CA 15-3 kan också stiga vid benigna sjukdomar i bröst och lever (7).

Det krävs fler undersökningar tillexempel röntgen och palpation för att ställa diagnos.

Vid recidiv stiger dock halten av CA 15–3 i blodet innan det går att upptäcka andra kliniska tecken (1, 9).

1.2 Cancerassocierat antigen 19–9

Cancerassocierat antigen 19–9 (CA 19–9) är ett glykoprotein som normalt uttrycks av bland annat epitelceller i pankreas, lever och galla. Vid cancer i dessa och övriga delar i mag-tarmkanalen kan halten av CA 19–9 i blodet öka. Antigenet är ett derivat av sialylerat Lewis A- (Le a-) blodgruppsantigen och kan definieras av den monoklonala antikroppen 1116-NS. Personer med blodgrupp Le(a-b-) saknar förmågan att uttrycka CA 19-9 (1, 10). Det innebär att det inte går att använda analysen CA 19–9 på dessa personer eftersom falskt negativa resultat erhålls (10, 11).

Analysen används vanligen främst för att ge en prognos både pre- och postoperativt vid pankreascancer. Koncentrationen av CA 19–9 ger en indikation på hur effektiv behandlingen av pankreascancer och cancer i gallgångarna är. Koncentrationen av CA 19-9 i blodet analyseras pre- och postoperativt, och även under behandlingen av cancern (10). Referensvärdet för CA 19-9 är <27 kIE/L (8).

1.3 Cancerassocierat antigen 125

Cancerassocierat antigen 125 (CA 125) kallas också mucin 16, och är ett glykoprotein som kan definieras av två monoklonala antikroppar, OC123 och M11. CA 125 uttrycks av epitelceller i kroppens hålrum. Referensvärdet för CA 125 är <35 kIE/L. Halterna av CA 125 i blodet ökar främst vid ovarial cancer men det går också att observera en

(9)

koncentrationshöjning vid cancer i pankreas, lungor och uterus liksom vid menstruation och graviditet (1, 12). Vid operationer där epitel kring hålrum påverkas kan koncentrationen av CA 125 stiga. Analysen kan tidigt visa på recidiv av ovarialcancer eftersom koncentrationen av CA 125 ökar. Halten av CA 125 pre- och postoperativt ger en indikation på om hela tumören har avlägsnats. Provtagningen postoperativt får ske tidigast efter sex veckor för att inte erhålla falskt förhöjt värde (1).

1.4 Analysinstrumentet Cobas 411 ®

Roche Cobas 411 ® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) är ett helautomatiskt instrument för immunologiska analyser och använder elektrokemiluminiscens immunoassay (ECLIA). Instrumentet består av en datorenhet och en analysdel (13).

1.4.1 Analysprincip

Principen för ECLIA syns i figur 1, ECLIA använder två monoklonala antikroppar specifika för analyten. Den ena antikroppen märks in med ett komplex innehållande rutenium (Ru). Den andra antikroppen är biotinylerad, vilket innebär att en biotinmolekyl har fästs på antikroppen. Antikropparna inkuberas med provet och binder in till analyten om den finns närvarande (14). Mikropartiklar med streptavidin tillsätts. Biotin har hög affinitet för streptavidin och streptavidin binder därmed till den biotinylerade antikroppen (15). Provet förs till mätkyvetten där mikropartiklarna dras magnetiskt till mätkyvettens vägg och hålls fast vid väggen på grund av magnetismen (14). Obundna partiklar tvättas bort och tripropylamin (TPA) tillsätts. När en spänning läggs över mätkyvetten kommer Ru²⁺ och TPA att oxideras till Ru³⁺och TPA⁺. TPA⁺är reaktivt och Ru³⁺ kommer ta upp en elektron och återgå till sitt grundstadie Ru²⁺. När det sker emitteras ljus som mäts via en detektor. Intensiteten av ljuset motsvarar koncentrationen av analyten i provet (15).

Eftersom obundna partiklar tvättas bort innan detekteringen kommer ingen emittering ske om inte ett antikropps-antigenkomplex har bildats (13).

(10)

Figur 1. Principen för elektrokemiluminiscens immunoassay (ECLIA) här illustrerat med CA 15–3 men med samma mekanism för CA 19–9 och CA 125. Två monoklonala antikroppar tillsätts den ena märkt med rutenium och den andra biotinylerad. De binder till analyten och streptavidin tillsätts vilken binder till biotin. Komplexet binder magnetiskt till en elektrod och därefter läggs en spänning över elektroden. Spänningen gör att rutenium och tripropylamin (TPA) oxiderar. När rutenium sedan går tillbaka till sitt normaltillstånd emitteras ljus. Ljuset är proportionellt mot halten av analyten i provet. Illustration: Sofie Johansson.

1.4.2 Kvalitetssäkring

CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 kontrolleras med interna kontroller före och efter varje serie av patientprover. Kontrollproverna ska ge ett resultat inom 2 standardavvikelser (SD) från klinisk kemi, Oskarshamns uppsatta kontrollgränser för att patientprov ska kunna godkännas (16). Analyserna CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 kontrolleras 12 gånger per år med det externa kontrollprogrammet EQAS immunoassay (BIO-RAD Irvine, USA). I kontrollgruppen ingår ca 150 laboratorier från hela världen som använder samma instrument och metod, och cirka 1000 laboratorier som analyserar samma analys.

En kontroll med okänt resultat skickas ut och analyseras enligt laboratoriets rutiner därefter jämförs resultaten mellan laboratorierna. Kontrollen kan ge en indikation på metodens riktighet (hur bra resultatet är jämfört med det korrekta värdet) och hur bra resultat överensstämmer mellan olika metoder och laboratorier (1).

1.5 Provhantering

En bra provhantering är en förutsättning för att få ett korrekt analysresultat. Resultaten kan påverkas av många faktorer så som provrörstyp, tid innan centrifugering, förvaring och transportering exempelvis (1). Målet med den preanalytiska hanteringen är att få så stabila analysresultat som möjligt och ett bra arbetsflöde. Valet av provmaterial kan vara

(11)

en viktig del i provhanteringen och för att erhålla korrekta analysresultat (17). Vid många analyser används plasma eller serum. Plasma och serum behöver avskiljas från blodceller som finns i provet, eftersom cellerna kan påverka analyterna så att de bryts ned eller förändras i sin struktur. Ämnen i provet kan också diffundera/transporteras in och ut ur blodcellerna vilket kan påverka analysresultatet (18). För att få en effektiv separering kan provrör med gel användas, vid centrifugering hamnar blodcellerna under gelen och plasma/serum ovanpå. Efter centrifugering kan plasman antingen fortsätta förvaras i primärröret eller föras över till ett nytt provrör (19). Gelen i provröret kan påverka genom att ämnen i provet diffunderar in i gelen. Vid förvaring kan gelen i vissa fall släppa ifrån sig ämnen som stör, ju längre tid ett prov förvaras i primärröret desto större risk för att analysresultatet påverkas (17, 19). Det finns dock fördelar med att behålla prover i primärrör. Det krävs mindre material i form av nya provrör och korkar, proverna behöver hanteras mindre manuellt och fler delar i den preanalytiska kedjan kan automatiseras (19).

1.5.1 Nuvarande provhantering

Prover för analys av CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 tas i Plasma separator tubes (PST) med Litium (Li)-heparintillsats (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA).

I provrören finns en gel som separerar plasma från blodkroppar. Efter provtagning ska provrören centrifugeras inom fyra timmar vid 4000g i 10 minuter. Plasman kan förvaras i upp till 24 timmar i primärröret och för att överföras till ett nytt provrör utan tillsats (Sarsteds, Nümbrecht, Germany). Avskilt förvaras provet i fem dygn i kylskåp. På grund av analysfrekvensen på klinisk kemi Oskarshamn fryses proven i -20 °C om det dröjer längre än fem dagar innan analys (20).

Enligt flera tillverkares metoder är CA 15–3 hållbar i sju dagar i kylskåp, CA 19–9 i 30 dagar och CA 125 i 5 dagar i både plasma och serum. Det specificeras dock inte om det gäller plasma i primärrör eller om plasman precis som serum måste vara överfört till nytt provrör (19).

1.6 Syfte

Syftet var att analysera hållbarheten av cancermarkörerna CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 i primärrör och jämföra med nuvarande metod där proverna förs över till nya rör.

Syftet var att undersöka om det skulle vara möjligt att förvara proverna i primärrör utan att analysresultatet påverkas.

(12)

2 Material och metod

Analyserna i studien utfördes på en Cobas 411 (Roche Diagnostics).

2.1 Provmaterial

Patientproverna som användes var venösa blodprover tagna i gelrör med Li-heparin (Becton, Dickinson). Proverna var tagna på vårdcentraler och provtagningsenheter i Region Kalmar. Dubbla prover togs på varje patient. Provrören centrifugerades i 10 minuter vid 2000g. Det ena blodprovet överfördes till ett nytt provrör utan tillsats och förvarades i kyla vid cirka 6 °C. Om det dröjde längre än fem dagar från provtagning till analys placerades proverna vid cirka -20 °C. Det andra provröret förvarades i primärröret i cirka 6 °C fram tills analys. Alla prover fick anta rumstemperatur innan analys.

2.2 Reagens

Reagensen som användes kom från Roche Diagnostics. Varje reagenskit bestod av tre delar, R1, R2 och M. Reagens M delades av alla analyser och bestod av streptavidintäckta mikropartiklar 0,72 mg/ml. Till analys av CA 15–3 användes R1, biotinylerad monoklonal anti-CA15-3 antikropp (mus) 1,75 mg/L och R2 monoklonal anti-CA 15–3 antikropp med ruteniumkomplex (mus) 10 mg/L. För analys av CA 19–9 användes R1, biotinylerad monoklonal anti-CA19-9 antikropp (mus) 3 mg/L och R2 monoklonal anti- CA 19–9 antikropp med ruteniumkomplex (mus) 4 mg/L. För analys av CA 125 användes R1, biotinylerad monoklonal anti-CA 125 antikropp (mus) 1 mg/L och R2 monoklonal anti-CA 125 antikropp med ruteniumkomplex (mus) 1 mg/L (8).

2.3 Kalibrering

Analyserna kalibrerades regelbundet enligt klinisk kemi Oskarshamns metod. Kalibrering utfördes vid byte av reagenslot och när samma reagens hade använts i mer än sju dagar.

Kalibratorerna som användes var Ca 15–3 CalSet II (Roche Diagnostics), Ca 19–9 CalSet (Roche Diagnostics) och Ca 125 CalSet II (Roche Diagnostics) (8).

2.4 Kontroller

Analyserna CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 kontrollerades vid varje analystillfälle av prover. Två kontroller analyserades, en låg, MAS Omni Immune Pro 1 (IM1) (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) och en hög, MAS Omni Immune Pro 3 (IM3) (Thermo

(13)

Scientific, Fremont, CA, USA) och kontrollgränser för respektive ses i tabell I. Vid analysserier av patientprov analyserades kontrollerna av laboratoriepersonal (8).

Tabell I. Kontrollgränser för IM1 och IM3 vid av analys CA 15–3, CA 19–9 och CA 125

MAS OMNI IMMUNE PRO 1 MAS OMNI IMMUNE PRO 3

Åsatt värde (kIE/L)

Kontrollintervall (SD) (kIE/L)

Åsatt värde (kIE/L)

Kontrollintervall (SD) (kIE/L)

CA 15–3 10,2 8,8–11,6 (0,7) 74,2 64,8–83,6 (4,7)

CA 19–9 15,3 12,5–18,1 (1,4) 112,5 97,5–127,5 (7,5)

CA 125 12 10,8–13,2 (0,6) 110 100,2–119,8 (4,9)

2.5 Hållbarhetsstudie

Dubbla patientprover togs på 30 patienter. Det första provet behandlades enligt nuvarande provtagningsrutiner. Det andra provet behölls plasman i primärröret och analyserades tre, fem och tio dagar efter provtagning. CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 analyserades på alla prover.

2.6 Statistik

Resultaten från var och en av de tre cancermarkörerna delades upp i tre grupper baserat på deras referensvärden. CA 15–3 delades in i 1–25 kIE/L (n=17), 25–100 kIE/L (n=9) och 100–300 kIE/L (n=2). CA 19–9 delades in i 1–27 kIE/L (n=23), 30–120 kIE/L (n=4) och >1100 kIE/L (n=3). CA 125 delades in i 1–35 kIE/L (n=22), 35–100 kIE/L (n=5) och 100–350 kIE/L (n=2). För varje prov räknades medelvärdet ut från resultaten av analys i primärrör. Medelvärdet användes sedan för att räkna ut den procentuella skillnaden mellan prover i primärrör och provet som behandlades enligt nuvarande rutin. För varje grupp/analysdag räknades medelvärde och standardavvikelse (SD) ut som sedan användes för att beräkna totala medelvärdet och SD för gruppen. Även variationskoefficienten (CV%) beräknades för varje grupp. De statistiska beräkningarna utfördes i Excel.

2.7 Etik

Alla patientprover var sådana vilka ändå skulle tagits inom vården och inga prover togs specifikt för det här arbetet. Patientproverna avidentifierades och inga resultat kan kopplas till patienten. Provresultateten från originalrören granskades enbart i utbildningssyfte och inga personuppgifter visades i resultathanteringsprogrammet.

Tystnadsplikt och personuppgifter har hanterats enligt lagar och förordningar så som patientsäkerhetslagen (2010:659) och patientdatalagen (2008:355) (21, 22)

(14)

3 Resultat

För samtliga provresultat se Bilaga 1–3

3.1 CA 15–3

Resultat för gruppen 1–25 kIE/L (n=17) syns i figur 2. Medelvärdet för gruppen var 15,06

±0,38 kIE/L och CV 2,51 %. I figur 3 visas skillnaden mellan medelvärdet för analys i primärrör jämfört med den nuvarande rutinen i procent. Förändringen i procent varierade mellan -11% till +17%.

Figur 2. Resultat för CA 15–3 i koncentrationsintervallet 1–25 kIE/L (n=17) med nuvarande rutin och efter 3, 5 och 10 dagar i primärrör.

Figur 3. Skillnaden mellan medelvärdet för analyser av CA 15–3 i primärrör jämfört med resultatet för nuvarande rutin uttryckt i procent.

11,46

10,73 10,52 10,22

18,84 18,38

21,84

18,62

7,68

9,73 9,5

7,75 18,17

19,9 19,26

17,84

14,55 14,63

11,86

15,26 12,4

11,05 11,06 11,52

17,23 16,93 17,38 16,93

11,37

9,78 9,46

10,95 13,69

11,84 11,78

13,35

13,9 13,71 13,23

14,91

16,57 17,52

16,49

17,76

13,21 13,63 13,73 14,15

7,92

9,76 9,46 9,02

18,04

19,37 19,37 19,24

14,62

16,93 17,04

15,36 16,42

19,29

18,33

17,37 24,13

27,21 26,64 26,21

5 10 15 20 25 30

Nuvarande rutin Dag 3 Dag 5 Dag 10

Koncentration (kIE/L)

-20%

-10%

0%

10%

20%

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Skillnad i %

Koncentration CA 15-3 (kIE/L)

Medelvärdet primärör/nuvarande metod

(15)

Medelvärde för gruppen 25–100 kIE/L (n=9) var 32,46 ±0,44 kIE/L, och CV 1,35 %.

Provresultaten syns i figur 4. Den procentuella skillnaden mellan medelvärdet för prover analyserade i primärrör och nuvarande rutin varierade mellan -7 till +10 % och visas i figur 3. Medelvärdet för gruppen 100–300 kIE/L (n=2) var 180,01 ±4,5 kIE/L och CV 2,5 %. Båda proverna i primärrör visade på en ökning i koncentrationen jämfört med nuvarande rutin. Skillnaden mellan medelvärdet för analys av CA 15–3 i primärrör jämfört med den nuvarande rutinen var 5 % och 10 %.

Figur 4 Resultat för analys CA 15–3 i koncentrationsintervallet 25–100 kIE/L (n=9) och 100–300 kIE/L (n=2) med nuvarande rutin och efter 3, 5 och 10 dagar i primärrör.

3.2 CA 19–9

Resultat för analys av CA 19–9 visas i figur 5. För gruppen 1–27 kIE/L (n=23) var medelvärdet 12,52 ±0,03 kIE/L och CV 0,24 %. Gruppens medelvärde i

primärrören jämfört med nuvarande rutin varierade mellan +15 – 32 % och visas i figur 6.

25,31 25,18

29,74

27,42 32,22

29,99 30,78

29,19 27,27

30,06 30,09

28,04 25,78

28,83 28,32

25,88 35,24

32,21

37,38

33,42 46,43

45,38 44,86

47,51

26,42 26,96 26,5 28,36

38,74 38,51

41,28

38,25

29,53

33,57

32,2 31,56

20 25 30 35 40 45 50

Koncentration CA 15-3 kIE/L

215,2 225,7 219,9 232,8

127,4

142,7 138,9 137,5

110 130 150 170 190 210 230 250

(16)

Figur 5 Resultat för CA 19–9 i koncentrationsintervallet 1–27 kIE/L (n=23) med nuvarande rutin och efter 3, 5 och 10 dagar i primärrör.

Figur 6 Den procentuella skillnaden mellan medelvärdet för resultatet i primärrören jämfört med resultatet för nuvarande rutin.

Gruppen 30–120 kIE/L (n=4) hade ett medelvärde på 62,34 ±2,14 kIE/L och CV 3,43%.

Resultaten visas i figur 7. Den procentuella skillnaden mellan medelvärdet i primärrör och nuvarande rutin var 0 - 6 %. För gruppen >1100 kIE/L (n=3) var medelvärdet 1612

±21,89 kIE/L och CV 1,36 %. Skillnaden mellan medelvärdet i primärrör och nuvarande rutin var -5%, 0% och + 11%.

16,09

14,66

16,64

15,68

2,76 2,49 2,74 2,47

6,38 6,11 6,01 6,27

11,66 11,23 11,34 11,33

22,99 22,63

21,08 22,41

10,63 11,6 11,27 11,51

15,49 16,38 16,5 16,64

2,4 2,79 2,83 2,67

2,88 3,22 3,27 3,21

8,21 8,21 7,8 8,6

8,18 8,22 7,94 8,24

18,07 18,93

17,86 19,04

24,85 25,14

23,88 24,54

22,02

20,78 20,7 20,52

4,01

2,58 2,45 2,75

2,67 2,51 2,86 2,41

19,71 19,36

20,93

19,26

21,4 21,99 22,74

20,87

14,67 14,91 15,14

13,94

7,8 7,76 7,93 7,76

16,26 16,46 17,67

16,22

7,03 7,14 6,76 6,49

22,89 22,63 22,08 23,41

0 5 10 15 20 25

Koncentration CA 19-9 kIE/L

-40%

-30%

-20%

-10%

0%

10%

20%

0 10 20 30 40 50 60

Skillnad %

Ca 19-9 kIE/L

Medelvärdet i primärrör jämfört med nuvarande rutin

(17)

Figur 7. Resultat för analys av CA 19–9 30–120 kIE/L (n=4) och >1100 kIE/L (n=3) (n=7) med nuvarande rutin och efter 3, 5 och 10 dagar i primärrör.

3.3 CA 125

Resultat för analys av CA 125 visas i figur 8. Gruppens 1–35 kIE/L (n=22) medelvärde var 13,04 ±0,08 kIE/L och CV 0,6 %. Gruppens medelvärde i primärrör jämfört med nuvarande rutin varierade mellan -8 % och +10% och visas i figur 9.

Figur 8. Resultat för CA 125 (n=22) i med nuvarande rutin och efter 3, 5 och 10 dagar i primärrör

7,04 6,91 7,16 7,4

12,07 11,99 12,55

9,67 14,99

13,98

15,36 15,29

8,05 7,56

8,35 7,89

4,64 4,43 5,01 4,68

14,34

13,68

14,9 14,66

7,47 7,34 7,74 7,6

11,42 11,87

10,97

10,12

8,07 7,99 7,9 8,3

11,57

10,97 11,6 11,66

11,24 11,52 11,36 11,42

9,55 9 9,27 9,62

13,81 14,43 14,51

12,97

7,62 8,35 8,3

7,84

12,97 13,53

13,16 13,68

10,15

9,56 9,77

9,37 11,52

11,13 11,3

9,42 10,69

10,32

9,87

10,74

4 6 8 10 12 14 16

Koncentration CA 125 kIE/L

2114 2115 2185

2068

1132 1060 1097 1071

1499

1667 1609

1721

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400

Koncentration Ca 19-9 (kIE/L)

52,5 52,37 58,99 55,07

30,74 30,84 32,87 30,06

47,74 46,91 50,75 45,65

113,8 115,2 113,4 120,5

20 70 120

(18)

Figur 9. Procentuell skillnad mellan medelvärdet i primärrör jämfört med den nuvarande rutinen

Gruppen 35–100 kIE/L (n=5) hade ett medelvärde på 36,98 ±0,3 kIE/L och CV 0,8% där analysresultaten visas i figur 10. Skillnaden mellan medelvärdet för analys i primärrör och nuvarande rutin var -2 ̶ +2 %. För gruppen 100–350 kIE/L (n=2) var medelvärdet 238,93 ±4,53 kIE/L och CV 1,89 %. Skillnaden mellan medelvärde i primärrör och nuvarande rutin var -1 och -4%.

Figur 10. Resultat för analys av CA 125 35–100 kIE/L (n=5) och 100–350 kIE/L (n=2) i med nuvarande rutin och efter 3, 5 och 10 dagar i primärrör

4 Diskussion

Syftet var att analysera hållbarheten för cancermarkörerna CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 i primärrör och jämföra med nuvarande metod där proverna hälls av och överförs till

-9%

-4%

1%

6%

4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

Skillnad %

Medelvärdet i primärrör jämfört med nuvarande rutin

35,69

35,1 34,67 34,72

39,33

38,73 38,32

39,97 37,01

38,52

36,18

38,34

38,1 38,64 38,13 38,79

34,69 35,4

34,57 34,72

33 35 37 39

334,3 332 324,5 338,7

149,9 144,9 144 143,1

100 200 300

(19)

nya rör. Detta genomfördes för att eventuellt kunna förbättra arbetsflödet för personalen vid avdelningarna för klinisk kemi, Region Kalmar län.

Resultatet för CA 15–3 i gruppen 1–25 kIE/L (n=17) blev medelvärdet 15,06 ± 0,38 kIE/L. Jämförs det med kontrollvärdet för IM 1 (tabell 1) som har ett åsatt värde på 10,2 och SD ±0,7. SD för CA 15–3 är mindre än för kontrollen IM1. Det innebär att resultatet ligger inom den tillåtna toleransen. I gruppen 25–100 kIE/L (n=9) blev medelvärdet 32,46

±0,44 kIE/L. Medelvärdet ligger närmast IM 1 och även här är SD lägre än för kontrollen.

För det höga koncentrationsintervallet var medelvärdet 180,01 ±4,5 kIE/L (n=2). Åsatt värde för IM 3 (tabell 1) är 74,2 och SD ±4,7 vilket innebär att även det resultatet ligger inom gränsen. Resultaten för CA 15–3 visar att skillnad i analyssvar mellan den nuvarande rutinen med överfört prov och prover förvarade i primärrör är inom gränserna för den interna kontrollen. Den procentuella skillnaden mellan den nuvarande rutinen och medelvärdet för primärrörsresultaten varierar. Differensen är minst för gruppen 25–

100 kIE/L och högst för proverna med lägst koncentrationer. Exempelvis prov 984 (se tabell II, bilaga 1) med 19 %. Eftersom värdena är låga (överfört prov: 7,92; prov i primärrör: 9,76; 9,46 och 9,02) blir den procentuella skillnaden mellan det överförda provet och proven i primärrör stor. Om 948 varit ett patientprov hade resultatet för CA 15–3 enligt klinisk kemi Oskarshamns svarsrutin varit 8, 10, 10 och 9 kIE/L (8). Den variationen hade inte haft någon klinisk relevans. Resultatet för CA 15-3 stämmer in med vad som anges i Roches metod för hållbarheten i serum (14) och för analys av CA 15-3 med andra metoder än Roches (19).

I gruppen 1–27 kIE/L vid analys av CA 19–9 med ett medelvärde på 12,52 ± 0,03 kIE/L.

Medelvärdet ligger närmast IM 1 (åsatt 15,3) med SD ±1,4. SD är betydligt lägre än SD för IM 1. Det samma gäller för gruppen 30–120 kIE/ med ett medelvärde på 62,34 ± 2,14 kIE/L, där SD ± 2,14 är närmast IM 3 med SD ±7,5. Precis som för CA 15–3 är den procentuella skillnaden mellan resultatet från prover analyserade primärrör och den nuvarande rutinen störst i de lägsta koncentrationerna av CA 19–9. För gruppen >1100 kIE/ med ett medelvärde på 1612 ± 21,89. Avvikelsen för gruppen ligger utanför ±2SD för IM3 som är närmaste kontrollvärdet. Resultatet kan vara lite missvisande, det saknas resultat i intervallet 120–1000 kIE/L och antalet mätvärden är lågt. Ett av proverna (922) (bilaga 2, tabell II) har en differens på 0 % mellan analys i primärröret och den nuvarande rutinen, så det går inte att dra en slutsats att höga koncentrationer av CA 19–9 skulle

(20)

påverkas av förvaring i primärrör över tid. Enligt metoden från Roche och en sammanställning med fler analysmetoder är proverna hållbara i 30 dagar i kylskåp (8, 19).

Eftersom undersökningen bara pågick i 10 dagar går det inte att med säkerhet uttala sig att proverna är hållbara så länge som 30 dagar, men resultaten tyder på att de är hållbara i åtminstone de undersökta tio dagarna.

För CA 125 i intervallet 1–35 kIE/ blev medelvärdet 13,04 ± 0,08 kIE/L. I intervallet 35–

100 kIE/L var medelvärdet 36,98 ± 0,3 kIE/L. Båda ligger närmast kontrollen IM1 med åsatt värde på 12 och den har ett SD på ±0,6. Resultaten ligger därmed inom det godkända intervallet för hur stor variation det får vara på ett prov. Intervallet 100–350 kIE/L med ett medelvärde på 238,9 ± 4,53 kIE/L och ligger närmare IM3 (åsatt 110, SD ±4,9). Även i det intervallet är SD för proverna lägre än kontrollens SD. CA 125 är den analys som har minst procentuell variation mellan analys i primärrör och analys av överförda prover, även i de lägre koncentrationerna. Enligt Roche är prover för analys av CA 125 hållbara i 5 dagar i plasma (19), resultaten tyder på att proverna troligtvis är hållbara ännu längre.

2019 analyserades 805 CA 15–3 prover, 887 CA 19–9 prover och 986 CA 125 prover.

Totalt 2678 analyser per år. En analys av CA 15–3 kostar 150 kronor, CA 19–9 och CA 125 kostar båda 140 kr (20). Kan proverna förvaras i primärrören kan både pengar och miljö sparas, i materialkostnader och eftersom provrör klassas som biologiskt avfall.

För att få säkrare resultat i undersökningen hade antalet prover i varje grupp kunnat varit jämnare. För alla tre analyserna är n störst (ca 2/3) för koncentrationerna som ligger under referensvärdet. Om fler prover analyserats kunde bättre information erhållits angående koncentrationens påverkan på provens hållbarhet. Undersökningen hade också kunnat förbättras genom att använda fyra prov istället för två. Då hade ett prov förvarats enligt nuvarande rutin, och de andra hade förvarats i primärrören och analyserats varsin dag. Då hade inte provens korkar behövt avlägsnas innan analystillfället. Det är en fördel eftersom det kan påverka analysresultatet att förvara prover utan kork (19).

Slutsatsen är att provsvaren för CA 15–3, CA 19–9 och CA 125 förändras väldigt lite över tid efter förvaring i primärrör. Resultaten från proverna som förvarats i primärrör stämmer också bra överens med resultaten från prover som överförts till nya rör enligt nuvarande metod. Hållbarheten som Roche anger verkar gälla även för plasmaprover förvarade i primärrör. Kan en ny rutin införas där prover för analys av CA 15–3, CA 19–

(21)

9 och CA 125 förvaras i primärrör kan personalen på klinisk kemi, Region Kalmar läns arbetsflöde förbättras och material och miljö sparas.

Tack

Jag vill tacka Kim Norell min handledare på Klinisk kemi för hjälp med upplägg och utförande av arbetet. Camilla Mohlin, intern handledare på Linnéuniversitetet för vägledning i det vetenskapliga skrivandet. Anna-Lena Nilsson, Elin Allard och övrig personal på klinisk kemi Oskarshamn för hjälp med det praktiska arbetet. John för den bra påminnelsen om att gå ifrån skrivandet och datorn ibland.

(22)

Referenser

1. Theodorsson E, Berggren Söderlund M, Laurell C-B. Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin. Tionde upplagan. ed. Lund : Studentlitteratur; 2018.

2. Bhatt AN, Mathur R, Farooque A, Verma A, Dwarakanath BS. Cancer biomarkers - current perspectives. The Indian journal of medical research. 2010;132:129.

3. Wild D, John R. The immunoassay handbook theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. 4th ed.. ed. Oxford: Oxford : Elsevier; 2013.

4. Babu G, Supriya A, Kumar NR, Swetha P. Tumor markers: An overview.(Review Article). Journal of Orofacial Sciences. 2012;4(2):87.

5. Kelderman S, Kvistborg P. Tumor antigens in human cancer control. BBA - Reviews on Cancer. 2016;1865(1):83-9.

6. Darwish IA. Immunoassay Methods and their Applications in Pharmaceutical Analysis: Basic Methodology and Recent Advances. International Journal of Biomedical Science : IJBS. 2006;2(3):217-35.

7. Nafija S, Raif S, Amra M. Comparison of the performance of three cancer antigen (CA) 15-3 immunoassays. Journal of Health Sciences. 2016;6(3).

8. Klinisk kemi och transfusionsmedicin Oskarshamn. Handhavande och metoder Cobas 411. 2018.

9. Grzywa R, Łupicka-Słowik A, Walczak M, Idzi M, Bobrek K, Boivin S, et al. Highly sensitive detection of cancer antigen 15-3 using novel avian IgY antibodies. ALTEX.

2014;31(1):43-52.

10. Ballehaninna U, Chamberlain R. Serum CA 19-9 as a Biomarker for Pancreatic Cancer—A Comprehensive Review. Indian Journal of Surgical Oncology.

2011;2(2):88-100.

11. Boeck S, Haas M, Laubender RP, Kullmann F, Klose C, Bruns CJ, et al. Application of a time-varying covariate model to the analysis of CA 19-9 as serum biomarker in patients with advanced pancreatic cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2010;16(3):986-94.

12. Razmi N, Hasanzadeh M. Current advancement on diagnosis of ovarian cancer using biosensing of CA 125 biomarker: Analytical approaches. Trends in Analytical Chemistry. 2018;108:1-12.

13. Ltd. RDI. Cobas e411 analyzer. Operator's Manual. 2.0 ed: Roche Diagnostics GmbH; 2008.

14. Cobas. Insert Ca 15-3 II. V19 ed: Roche Diagnostics GmbH; 2014.

15. Richter MM. Electrochemiluminescence (ECL). Chemical Reviews.

2004;104(6):3003-36.

16. Klinisk kemi och transfusionsmedicin Oskarshamn. Regler och rutiner, interna kontroller. 2017.

17. Brandhorst G, Engelmayer J, Gotze S, Oellerich M, von Ahsen N. Pre-analytical effects of different lithium heparin plasma separation tubes in the routine clinical chemistry laboratory.(Short Communication)(Report). Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2011;49(9):1473.

18. Boyanton BL, Jr., Blick KE. Stability studies of twenty-four analytes in human plasma and serum.(General Clinical Chemistry). Clinical Chemistry. 2002;48(12):2242.

19. Guder WG. Pre-Examination Procedures in Laboratory Diagnostics: Preanalytical Aspects and Their Impact on the Quality of Medical Laboratory Results. Berlin/Boston:

De Gruyter, Inc.; 2015.

(23)

20. Tornegård M. Provtagningsanvisningar CA 15-3 [Internet]. Diagnostiskt centrum Klinisk kemi och transfusionsmedicin; 2019 [cited 20200227]. Available from:

https://provtag.regionkalmar.se/newResult.aspx?id=946.

21. Socialdepartementet. Patientdatalag (2008:355) [Internet]. 2008-05-29 [cited 2020- 04-28]. Available from: https://www.riksdagen.se/sv/dokument-lagar/dokument/svensk- forfattningssamling/patientdatalag-2008355_sfs-2008-355.

22. Socialdepartementet. Patientsäkerhetslagen [Internet]. 2010-06-17 [cited 2020-04- 28]. Available from: https://www.riksdagen.se/sv/dokument-lagar/dokument/svensk- forfattningssamling/patientsakerhetslag-2010659_sfs-2010-659.

(24)

Bilaga I Analysresultat för CA 15–3

Tabell II Rådata för analys av CA 15–3

Prov Provtagningsdag Lidnummer Nuvarande rutin

Dag 3 Dag 5 Dag 10

1 02-feb 348-1 25,31 25,18 29,74 27,42

2 07-apr 408-2 11,46 10,73 10,52 10,22

3 08-apr 204-3 32,22 29,99 30,78 29,19

4 16-apr 417-4 18,84 18,38 21,84 18,62

5 17-apr 860-5 7,68 9,73 9,5 7,75

6 2020-04-17 861-6 18,17 19,9 19,26 17,84

7 17-apr 862-7 27,27 30,06 30,09 28,04

8 17-apr 863-8 25,78 28,83 28,32 25,88

9 16-apr 065-9 35,24 32,21 37,38 33,42

10 20-apr 370-10 14,55 14,63 11,86 15,26

11 21-apr 485-11 20,34 18,54 18,12 18,9

12 21-apr 660-12 12,4 11,05 11,06 11,52

13 21-apr 291-13 17,23 16,93 17,38 16,93

14 21-apr 579-14 215,2 225,7 219,9 232,8

15 22-apr 748-15 11,37 9,78 9,46 10,95

16 22-apr 852-16 13,69 11,84 11,78 13,35

17 23-apr 187-17 46,43 45,38 44,86 47,51

18 23-apr 470-18 13,9 13,71 13,23 14,91

19 23-apr 250-19 26,42 26,96 26,5 28,36

20 23-apr 523-20 16,57 17,52 16,49 17,76

21 25-apr 484-21 38,74 38,51 41,28 38,25

22 24-apr 662-22 13,21 13,63 13,73 14,15

23 27-apr 192-23 127,4 142,7 138,9 137,5

24 27-apr 439-24 29,53 33,57 32,2 31,56

25 27-apr 984-25 7,92 9,76 9,46 9,02

26 28-apr 888-26 18,04 19,37 19,37 19,24

27 27-apr 911-27 14,62 16,93 17,04 15,36

28 27-apr 052-28 16,42 19,29 18,33 17,37

29 27-apr 362-29 1880 1874 1747 1725

30 27-apr 862-30 24,13 27,21 26,64 26,21

(25)

Bilaga II Analysresultat för CA 19–9

Tabell III. Rådata för analys av CA 19–9

Dag 3 Dag 5 Dag 10

1 feb-30 922-1 2114 2115 2185 2068

2 09-apr 633-2 16,09 14,66 16,64 15,68

3 17-apr 860-5 2,76 2,49 2,74 2,47

4 17-apr 861-6 6,38 6,11 6,01 6,27

5 17-apr 862-7 11,66 11,23 11,34 11,33

6 17-apr 863-8 22,99 22,63 21,08 22,41

7 16-apr 065-9 10,63 11,6 11,27 11,51

8 20-apr 370-10 52,5 52,37 58,99 55,07

9 21-apr 485-11 1132 1060 1097 1071

10 21-apr 660-12 15,49 16,38 16,5 16,64

11 21-apr 291-13 2,4 2,79 2,83 2,67

12 21-apr 579-14 2,88 3,22 3,27 3,21

13 22-apr 748-15 8,21 8,21 7,8 8,6

14 22-apr 852-16 1499 1667 1609 1721

15 23-apr 187-17 8,18 8,22 7,94 8,24

16 23-apr 470-18 18,07 18,93 17,86 19,04

17 23-apr 250-19 113,8 115,2 113,4 120,5

18 23-apr 523-20 24,85 25,14 23,88 24,54

19 25-apr 484-21 22,02 20,78 20,7 20,52

20 24-apr 662-22 4,01 2,58 2,45 2,75

21 27-apr 192-23 2,67 2,51 2,86 2,41

22 27-apr 439-24 19,71 19,36 20,93 19,26

23 27-apr 984-25 21,4 21,99 22,74 20,87

24 28-apr 888-26 14,67 14,91 15,14 13,94

25 27-apr 911-27 7,8 7,76 7,93 7,76

26 27-apr 052-28 30,74 30,84 32,87 30,06

27 27-apr 362-29 16,26 16,46 17,67 16,22

28 27-apr 862-30 47,74 46,91 50,75 45,65

29 28-apr 903-31 7,03 7,14 6,76 6,49

30 27-apr 363-32 22,89 22,63 22,08 23,41

(26)

Bilaga III Analysresultat för CA 125

Tabell IV. Rådata för analys av CA 125

Dag 3 Dag 5 Dag 10

1 07-apr 668-1 7,04 6,91 7,16 7,4

2 14-apr 085-2 12,07 11,99 12,55 9,67

3 17-apr 860-5 14,99 13,98 15,36 15,29

4 17-apr 861-6 8,05 7,56 8,35 7,89

5 17-apr 862-7 4,64 4,43 5,01 4,68

6 17-apr 863-8 14,34 13,68 14,9 14,66

7 16-apr 065-9 7,47 7,34 7,74 7,6

8 20-apr 370-10 11,42 11,87 10,97 10,12

9 21-apr 485-11 35,69 35,1 34,67 34,72

10 21-apr 660-12 39,33 38,73 38,32 39,97

11 21-apr 291-13 8,07 7,99 7,9 8,3

12 21-apr 579-14 37,01 38,52 36,18 38,34

13 22-apr 748-15 27,97 28,84 28,04 29,08

14 22-apr 852-16 11,57 10,97 11,6 11,66

15 23-apr 187-17 24,38 23,82 23,42 23,4

16 23-apr 470-18 334,3 332 324,5 338,7

17 23-apr 250-19 11,24 11,52 11,36 11,42

18 23-apr 523-20 9,55 9 9,27 9,62

19 25-apr 484-21 24,69 23,43 24,49 22,6

20 24-apr 662-22 13,81 14,43 14,51 12,97

21 27-apr 192-23 23,42 25,56 25,83 25,67

22 27-apr 439-24 3592 3942 3975 3932

23 27-apr 984-25 7,62 8,35 8,3 7,84

24 28-apr 888-26 12,97 13,53 13,16 13,68

25 27-apr 911-27 149,9 144,9 144 143,1

26 27-apr 052-28 10,15 9,56 9,77 9,37

27 27-apr 362-29 38,1 38,64 38,13 38,79

28 27-apr 862-30 11,52 11,13 11,3 9,42

29 28-apr 903-31 10,69 10,32 9,87 10,74

30 27-apr 363-32 34,69 35,4 34,57 34,72

(27)

Linnéuniversitetet

Kalmar Växjö Lnu.se