Pro hodnocenı́ struktur byly voleny následujı́cı́ metody: elektronová rastrovacı́ mik-roskopie (SEM), EDX chemická analýza a měřenı́ nanotvrdosti s cı́lem určit také mo-dul pružnosti (Youngův momo-dul).
3.2.1 Rastrovací elektronová mikroskopie
Pro hodnocenı́ struktury byl využit rastrovacı́ elektronový mikroskop (REM), který
byl k dispozici v oddělenı́ přı́pravy a analýzy nanostruktur na Ustavu pro nanomate-riály, pokročilé technologie a inovace. Mikroskop byl vyroben společnostı́ Carl Zeiss, konkrétně se jednalo o typ UHR FE-SEM Carl Zeiss ULTRA Plus s In-Lens SE detek-torem pro max. rozlišenı́, In-Lens EsB detekdetek-torem pro snı́mánı́ BSE dle energie. Mi-kroskop byl vybaven kompletnı́ mikroanalytickou sestavou EDS + WDS + EBSD (OX-FORD) a nábojovým kompenzátorem pro analýzu nevodivých vzorků bez nutnosti úpravy povrchu. Přı́stroj umožňuje 3D zobrazenı́ pomocı́ 4-kvadrantového AsB detektoru. Možné rozlišenı́ mikroskopu je 1 nm @ 15 kV; 1,6 nm @ 19 kV, zvětšenı́ 12 -1000000x v SE módu. Elektrony je možno urychlovat napětı́m od 0,02-30 kV.
Mikroskop byl rovněž využit pro chemickou analýzu - EDX.
Příprava vzorků pro mikroskopii
Přı́prava vzorků pro mikroskopii spočı́vala v odběru vzorku z vhodné pozice v rámci zkoumaného biokompozitnı́ho systému. Vzorky byly pro snadnějšı́ vakuovánı́ komory mikroskopu vysušené. Pro zajištěnı́ vodivosti sledovaného vzorku bylo nutno vytvo-řit tenkou platinovou vrstvu o tlouštce 5 nm (naprašovačka Quorum Q150R ES). Ná-sledně byl vzorek upevněn oboustrannou lepicı́ páskou na terčı́ky, které byly vloženy do samotné komory elektronového mikroskopu.
Průběh zkoumání na elektronovém mikroskopu
Cı́lem bylo pozorovánı́ stavby a struktury biologických materiálů - biokompozitnı́ch struktur. Proto bylo nutno volit urychlovacı́ napětı́ o takové velikosti, aby nedochá-zelo k přı́lišnému nabı́jenı́ povrchu vzorku a zároveň byla zachována ostrost pořizo-vaného snı́mku. Urychlovacı́ napětı́ elektronů bylo dle potřeby voleno od 5 do 10 kV (bude uvedeno v zápatı́ jednotlivých snı́mků struktur), sekundárnı́ elektrony byly de-tekovány in-lens detektorem, detektorem sekundárně odražených elektronů či jejich kombinacı́. Apertura, ovlivňujı́cı́ hloubku ostrosti vytvářených snı́mků, byla volena od cca 10 do 30 µm.
3.2.2 Energiově disperzní spektroskopie
Energiově disperznı́ analýza byla využita k chemické analýze za účelem kvantitativnı́
a kvalitativnı́ analýzy. Instrumentálně je EDX analýza součástı́ pracoviště elektronové
mikroskopie SEM (viz. podkap. č. 3.2.1) v rámci mikroanalytické sestavy EDX + WDS + EBDS (Oxford).
Energiově disperzní spektroskopie - princip
Energiově disperznı́ rentgenová spektroskopie (EDX, EDS nebo také XEDS) je analy-tická technika užı́vaná pro zjišťovánı́ zastoupenı́ jednotlivých prvků a chemické cha-rakteristiky vzorků. Metoda je založena na interakci zářenı́ vysı́laného ze zdroje rent-genova zářenı́ se vzorkem.
K emisi charakteristického rentgenova zářenı́ ze studovaného vzorku sloužı́ paprsek vysoce energetických elektronů popř. protonů (PIXE metoda) nebo svazek rentge-nova zářenı́ - XRF. Srážkou elektronového svazku s elektrony umı́stěnými na jednotli-vých slupkách elektronového obalu (K, L, M, atd.) může být elektron excitován do vyš-šı́ch energetických hladin popř. může zcela opustit elektronový obal. Energie, která
je při tomto ději uvolněna je vzhledem ke kvantovému modelu atomu vždy pevně
kvantována a charakteristická pro daný prvek. EDX metoda umožňuje energii v po-době rentgenova zářenı́ měřit a následně analyzovat a určit chemické složenı́ vzorků.
Zařı́zenı́ pro EDX analýzu je složeno ze čtyř základnı́ch jednotek. Prvnı́ jednotkou je
prvkem je detektor, sloužı́cı́ pro převod rentgen. zářenı́ na elektrický (napěťový) sig-nál, který je posı́lán do pulznı́ho procesoru. Detektory jsou v současnosti na bázi Si(Li) chlazené tekutým dusı́kem nebo křemı́kové driftové detektory (SDD) na bázi CdTe chlazené Peltiérovým článkem. Třetı́ částı́ je pulznı́ procesor, který je spojen s analyzátorem.
Vedle EDX existuje ještě WDS (vlnově disperznı́) analýza, která vyniká vyššı́m rozli-šenı́m (5 eV), nižšı́ mezı́ detekce a vyššı́m poměrem signál/šum. [27]
Příprava vzorků pro EDX chemickou analýzu
Přı́prava vzorků pro chemickou analýzu probı́hala identicky jako přı́prava vzorků pro elektronovou mikroskopii - viz podkap. č. 3.2.1.
3.2.3 Měření vybraných mechanických vlastností - nano-indentace
Dı́ky strukturám přı́rodnı́ch materiálů, které vykazujı́ velmi malé rozměry byla ke stanovenı́ vybraných mechanických vlastnostı́ zvolena nanoindentace.
Měřenı́ tvrdosti bylo realizováno na přı́stroji Nanoindentation tester (NHT) od spo-lečnosti CSM-instruments v Laboratoři oddělenı́ přı́pravy a analýzy nanostruktur.
Přı́stroj byl vybaven hlavicı́ pro měřenı́ nanotvrdosti (nanoindentor) a mikrotvrdosti (mikroindentor - Vickersův indentor). Pro účely této diplomové práce byla využita hlavice pro měřenı́ nanotvrdosti, která byla osazena diamantovým hrotem o velikosti 1, 5 µms vrcholovým úhlem 65°03' - metoda dle Berkoviche. Přı́stroj dále disponoval přesnou snı́macı́ kamerou pro možnost vytvářenı́ fotogra iı́ provedených indentacı́.
Vzorek (viz podkap. č. 3.1.1) byl upnut do svěracı́ch čelistı́, které byly upevněny k po-hyblivému loži umožňujı́cı́ přesný pohyb (0, 25 µm) ve třech osách.
Diamantový hrot ve tvaru třı́stranného jehlanu byl volen z důvodu jeho velikosti a z důvodu eliminace vady vzniklé tzv. střı́škovitostı́ měřicı́ch hrotů, která se může skytovat např. u měřenı́ dle Vickerse. Střı́ška je površka vzniklá nedokonalým vy-broušenı́m hrotu indentoru sestávajı́cı́ho se ze čtyř ploch (Vickersův indentor - čtyř-boký jehlan). Berkovichův trojčtyř-boký jehlan je dı́ky své geometrii apriori této vady zbaven. Dalšı́ důvod pro volbu Berkovičova indentoru byla skutečnost, že se jedná
o velmi malý indentor a tudı́ž vhodný pro indentaci nanokompozitnı́ch biostruktur.
Tohoto hrotu bylo využito při zjišťovánı́ mechanických vlastnostı́ - tvrdostı́ při zkou-mánı́ všech vybraných biologických struktur (zubů - viz [16], lidské kosti - viz [10]).
Příprava vzorků pro měření mechanických vlastností
Přı́prava vzorků pro měřenı́ nanotvrdosti byla zmı́něna již na začátku kapitoly č. 3.1.1 a byla shodná pro všechny zkoumané biokompozitnı́ struktury (kosti, zuby atd.).
Nastavení parametrů měření mechanických vlastností hovězí kosti
Nastavenı́ měřicı́ch parametrů byl prováděno s ohledem na tvrdost zkoumaného vzor-ku a podobnost s nastavenı́m vyplývajı́cı́ z literárnı́ch zdrojů zabývajı́cı́ se danou pro-blematikou. Tyto postupy lze zobecnit pro všechna měřenı́ mechanických vlastnostı́
daných biologických struktur (viz dále).
Poněvadž kost byla v porovnánı́ s dalšı́mi zkoumanými strukturami relativně měkčı́
strukturou byla volena maximálnı́ zatı́ženı́ 100 mN s rychlostı́ zatěžovánı́ a odlehčo-vánı́ 490 mN/min, délka výdrže 15 s a rychlostı́ změny hodnoty zatı́ženı́ 10 Hz.
Před každou sériı́ vpichů byl proveden kalibračnı́ vpich s přesně de inovanými para-metry nastavenı́.
Aby nedocházelo k ovlivňovánı́ vpichů (reziduálnı́ napětı́ a efekt zpevněnı́) byly po-zice jednotlivých vpichů vzájemně vzdáleny 80 popř. 100 µm (dle [18]). Tento postup byl aplikován pro všechny struktury.
Nastavení parametrů měření mechanických vlastností lidského zubu
Biokompozitnı́ struktura zubu je považována za nejtvrdšı́ strukturu v lidské těle a z tohoto důvodu bylo voleno vyššı́ zatı́ženı́ než-li u kosti. Jednalo se o maximálnı́ za-tı́ženı́ 250 mN, rychlostı́ zatěžovánı́ a odlehčovánı́ 490 mN/min, délce výdrže 15 s a rychlostı́ změny hodnoty zatı́ženı́ 10 Hz.
Rovněž jako u kosti i zde probı́hala kalibrace před každou sériı́ indentacı́.
Nastavení parametrů měření mechanických vlastností krabího krunýře a lastury Na biologické struktury založené na bázi CaCO3byl zvoleny shodné parametry, které
se s ohledem na tvrdost krunýře a lastury nelišily od parametrů měřenı́ pro lidský zub tj. maximálnı́ zatı́ženı́ 250 mN, rychlost zatěžovánı́ a odlehčovánı́ 490 mN/min, délka výdrže 15 s a rychlost změny hodnoty zatı́ženı́ 10 Hz.