sPLA2-IIA: potentiell biomarkör för bakterieinfektion hos patienter med neutropen feber?

Örebro universitet Läkarprogrammet Kandidatuppsats 15 hp Juni 2017

sPLA

2

-IIA: potentiell biomarkör för

bakterieinfektion hos patienter med neutropen

feber?

_____________________________________

Version 2

Författare: Hanne Gustafsson Handledare: Erik Ahlstrand MD, PhD Laboratoriehandledare: Filip Branzell, BMA

S

AMMANFATTNING

Bakgrund: Neutropen feber är ett vanligt tillstånd hos cytostatikabehandlade patienter med

hematologiska maligniteter och kan ha steril eller infektiös genes. På grund av att neutropen feber förknippas med hög mortalitet och eftersom att lämpliga biomarkörer, för att tidigt urskilja

patienter med bakteriell genes till feber, saknas behandlas alla i dagsläget med

bredspektrumantibiotika vid diagnos av neutropen feber. C-reaktivt protein (CRP) och

procalcitonin (PCT) används kliniskt men kan inte säkert skilja patienter med bakteriell infektion från dem utan. Fosfolipas-A2 typ IIA (sPLA2-IIA) är en markör som visat sig effektiv vid

identifiering av bakterieinfektion hos immunokompetenta men har ännu inte testats på neutropena patienter.

Syfte: Jämföra sPLA2-IIA i förhållande till CRP och PCT med avseende på hur bra de var på att

skilja infekterade från ej infekterade patienter med neutropen feber för att på sikt kunna optimera och begränsa användning av antibiotika.

Metoder: Plasmaprover från 14 patienter med neutropen feber från två tillfällen analyserades

avseende CRP, PCT och sPLA2-IIA. sPLA2-IIA-koncentration bestämdes med enzyme linked

immunosorbent assay (ELISA). Proverna från patienterna med påvisbar infektion jämfördes mot dem utan påvisbar infektion för respektive markör.

Resultat: sPLA2-IIA kunde inte signifikant skilja gruppen med påvisbar infektion från gruppen

utan. Dessutom låg medianen för gruppen utan påvisbar infektion högre än för gruppen med infektion vid feberprovet för sPLA2-IIA.

Slutsats: sPLA2-IIA är sannolikt ingen potentiell biomarkör för neutropena patienter i avseende

att skilja patienter med infektion från dem med feber av annan orsak. Det finns sannolikt inget intresse att replikera studien på en större studiepopulation.

F

ÖRKORTNINGAR

CRP- C-reaktivt protein PCT- Procalcitonin

sPLA2-IIA- Utsöndrat (eng. secreted) fosfolipas A2 typ IIA

ELISA- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ASCT- Autolog stamcellstransplantation HSCT- Hematopoetisk stamcellstransplantation NF- Neutropen feber

FUO- Fever of unkown origin, feber av okänt ursprung USÖ- Universitetssjukhuset Örebro

CVK- Central venkateter

I

NNEHÅLLSFÖRTECKNING

1 Inledning ... 1

1.1 Neutropen feber och FUO ... 1

1.2 Infektion och Diagnostik ... 2

1.3 Mortalitet och resistens ... 3

1.4 Infektionsmarkörer hos Neutropena patienter ... 3

1.5 Syfte ... 4

2 Material och metod ... 4

2.1 Studiepopulation ... 4

2.2 Identifiering av infektion ... 5

2.3 Insamling och beredning av prover ... 5

2.4 ELISA för påvisande av sPLA2-aktivitet i plasma ... 6

2.5 Databeräkning och Statistisk analys ... 7

2.6 Etiska överväganden ... 8

3 Resultat ... 8

4 Diskussion ... 14

1

1 I

NLEDNING

1.1 N

FUO

Patienter med hematologiska maligniteter löper ökad risk att drabbas av allvarliga infektioner (1) till följd av flera immunosuppresiva mekanismer. Maligniteter kan i sig själva störa

immunsystemets reaktion mot en infektion (2) och utbredning av maligna celler i benmärgen kan undertrycka bildning av hematopoetiska celler vilket kan orsaka neutropeni (3). Vidare är

cytostatikabehandling ofta starkt immunosuppresiv (2), och kan också orsaka neutropeni (4). Cytostatika kan även orsaka hud- och slemhinneskador vilket ökar risken för invasiva infektioner (1). Neutropeni efter cytostatikabehandling innebär en extrem känslighet för mikroorganismer vilket kan orsaka fatala infektioner (4).

Autolog stamcellstransplantation (ASCT) är en typ av hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) (5) som är indicerat vid flera hematologiska tillstånd. Stamceller från benmärg skördas för att sedan återinföras till blodet efter kemoterapi. ASCT möjliggör behandling med cytostatika i mycket höga doser (6) som annars hade varit uttalat toxiskt för benmärgen (7). Stamcellerna genererar nya blodceller från benmärgen, men under de första veckorna efter HSCT är

leukocyttalet lågt (6). Alla patienter blir immunsupprimerade i efterloppet av behandlingen, med störningar i både cellmedierat och humoralt försvar (8). Bakterieinfektion är en av de vanligaste komplikationerna efter HSCT (9) och infektionsrisken beror framförallt av neutropeni och slemhinneskador (8). Graden och durationen av neutropeni korrelerar till infektionsrisken (10). Bakteriella agens finns oftast i patientens egen hud- eller tarmflora (1). Gastrointestinal mukosit efter kemoterapi utgör ofta inkörsport för opportunistiska mikroorganismer som får möjlighet att etablera infektion. Slemhinneskador kan också uppstå på grund av andra iatrogena orsaker, t.ex. skadad hudbarriär på grund av en central venös infart (11).

Patienter med neutropeni som drabbas av infektion uppvisar oftast feber som första och ibland enda symptom (12). Feber och neutropeni benämns neutropen feber (NF) och definieras som granulocyter i blod <0,5 x 109/L och en temperatur ˃ 38,5˚ alternativt ˃ 38˚ vid minst två tillfällen under en 12-timmarsperiod (1). NF är en betydande komplikation efter intensiv kemoterapi (13) och tillståndet drabbar fler än 80 % av hematologiska cancerpatienter (14).

2 Feber vid neutropeni är dock inte ett specifikt tecken på infektion utan kan bero av fler olika mekanismer (15). Tumörcellskada efter kemoterapi kan orsaka en steril inflammation i kroppen ledande till stegring av både kroppstemperatur och akutfasprotein i blodet vilket gör att en eventuell infektion blir svårare att upptäcka (3). Andra orsaker till feber är bland annat

administrering av andra läkemedel eller blod (4), svampinfektion (15), eller uppkomst av akut graft versus host disease efter allogen HSCT (16). I fler än 50 % av fallen av NF kan den bakomliggande genesen inte påvisas (17), men fler än hälften anses ha en bakomliggande infektion (11,13). Feber utan kliniskt eller mikrobiologiskt stöd på infektion benämns fever of unkown origin (feber av okänt ursprung, FUO) (12).

1.2 I

D

De vanligaste typerna av infektion efter HSCT är bakteriemi, pneumoni och gastrointestinal infektion (9). Bakteriemi är en mycket allvarlig komplikation hos patienter med

behandlingsrelaterad neutropeni och associeras med livshotande tillstånd som septisk chock och multiorgansvikt (18). Bland patienter med NF kan bakteriemi påvisas hos 23-40 % (1,2,19–21). I dagsläget saknas metoder för att säkert särskilja patienter med tidig bakteriell infektion från icke-infekterade patienter (11). Diagnosen bakteriemi ställs traditionellt baserat på en positiv

blododling vilket anses vara den säkraste metoden trots flera begränsningar, den är bland annat tidskrävande (22) och har låg sensitivitet (23). Även radiologiska metoder är bristfälliga när det gäller att identifiera infektion för att fastställa feberorsaken (24).

Klassiska symptom på inflammation är ofta mer subtila eller till och med frånvarande vid neutropeni. Många patienter saknar en typisk klinisk bild på infektion (11), t.ex. föreligger bakteriemi ofta utan påtagligt infektionsfokus (1). Infektionsförloppet kan dessutom gå mycket snabbt hos neutropena patienter (11) och på kort tid få dödlig utgång utan behandling (25). På grund av att diagnostiken av eventuell infektion vid neutropeni är komplicerad behandlas alla patienter empiriskt med bredspektrumantibiotika vid tillkomst av feber (11). I enlighet med internationella riktlinjer görs detta oavsett om infektion kan påvisas eller inte (26). Angreppsättet syftar till att motverka morbiditet och mortalitet till följd av bakterieinfektion fram till att svar från odlingar eller andra undersökningar är tillgängliga för ett mer riktat antibiotikaval (22). Att starta antibiotikabehandling hos patienter med icke-infektiös feber innebär dock en del

3 konsekvenser såsom behandlingsineffektivitet, ökade kostnader, ökad toxicitet samt risk för resistensutveckling (27).

1.3 M

Trots tidig administrering av bredspektrumantibiotika associeras NF med betydande morbiditet, mortalitet och höga kostnader (28). De flesta som erhåller antibiotika förbättras kliniskt men en liten grupp patienter utvecklar ändå septisk chock (29). Mortaliteten har visats vara cirka tio procent, men varierar med antalet komorbida tillstånd, eventuellt infektiöst agens samt

ursprunglig hematologisk diagnos. Mortaliteten kan till viss del förklaras av ökad resistens mot antibiotika bland de bakterier som orsakar infektion efter HSCT (9). Ett test som snabbt kan urskilja de med infektion bland patienter vid diagnos av NF är därför efterfrågat inom den

hematologiska cancervården och skulle både underlätta behandling samt bidra till undvikandet av resistensutveckling.

1.4 I

N

Många biomarkörer har undersökts i hopp om att kunna underlätta diagnostiken av infektioner vid NF (4). De infektionsmarkörer som används hos neutropena patienter har begränsad validitet (15). Den vanligaste markören är akutfasproteinet C-reaktivt protein (CRP). CRP är förhöjt i nästintill alla fall av mikrobiell infektion men har visats ha låg specificitet (30) och sensitivitet (22) hos denna patientgrupp. Procalcitonin (PCT) är en nyare markör som har visats vara förhöjd vid sepsis och systemisk infektion (31). PCT har dock visats ha låg sensitivitet hos neutropena patienter (22).

Wennerås et al. (3) tittade på 139 olika markörers förmåga att identifiera infektion hos patienter med NF. Enligt deras resultat var PCT den bästa markören för ändamålet medan CRP var något sämre. Dock kunde inte någon av de 139 markörerna enskilt särskilja patienter med infektiös orsak till feber från patienter med FUO.

Fosfolipas A2 typ IIA (sPLA2-IIA) är ett enzym som hydrolyserar komponenter i cellmembran,

vilket bildar arakidonsyra som i sin tur bildar flera proinflammatoriska metaboliter. I en nyligen publicerad studie av Tan et al. (32) undersöktes sPLA2-IIA:s roll som biomarkör vid

4 patienter med misstänkt sepsis. Studien visade att sPLA2-IIA var effektiv både för

sepsisscreening och för att avgöra om bakterieinfektion föreligger eller ej. sPLA2-IIA har dock

inte prövats som infektionsmarkör hos neutropena patienter.

1.5 S

Syftet med denna studie var att jämföra sPLA2-IIA i förhållande till CRP och PCT hos patienter

med neutropen feber med avseende på deras förmåga att tidigt skilja patienter med påvisbar bakterieinfektion från patienter med FUO. På lång sikt är syftet att kunna minska onödig användning av antibiotika. Denna studie utgör en pilotstudie till en större studie där det

övergripande syftet är att utreda ifall nya biomarkörer och mikrobiologiska metoder kan bidra till att förbättra diagnostik och behandling av neutropen feber.

2 M

ATERIAL OCH METOD

Denna studie utgör en pilotstudie inom den större studien: ”Neutropen feber hos patienter med hematologiska maligniteter - studier kring förbättrad diagnostik av infektiösa orsaker samt studier av bakomliggande mekanistiska samband”. Denna pilotstudie har, genom att vara en del i

originalstudien, erhållit etiskt godkännande från Regionala Etikprövningsnämnden, Uppsala (DNR 20015–142, 2015-05-15).

2.1 S

23 patienter (˃ 18 år) rekryterades prospektivt under slutenvård vid Hematologiska sektionen på Universitetssjukhuset i Örebro (USÖ) mellan oktober 2015 och december 2016. Samtliga patienter var planerade för ASCT. Utifrån denna population identifierades patienter som

utvecklade NF (granulocyter i blod <0,5 x 109/L och en temperatur ˃ 38,5˚ alternativt ˃ 38˚ vid minst två tillfällen under en 12-timmarsperiod (1)) under vårdtiden. De patienter som utvecklade NF inkluderades i pilotstudien efter identifiering genom retrospektiv journalgenomgång.

Alla patienter erhöll både skriftlig och muntlig information, varpå de lämnade skriftligt samtycke till att delta. Alla patienter informerades om att de var berättigade att upphöra sitt deltagande utan vidare förklaring.

5

2.2 I

Efter identifiering av NF indelades patienterna i två grupper baserat på om de hade en påvisbar infektion eller ej. Vid diagnos av NF utfördes odlingar på perifert blod, blod från central venkateter (CVK) och urin samt lungröntgen för påvisande av eventuell pneumoni. Vid eventuella sår utfördes även odlingar på material från dessa och vid fokala symptom utfördes riktade undersökningar för att fastställa eventuell infektion. Analyser utfördes vid sektionen för Klinisk bakteriologi och virologi respektive Röntgen vid USÖ.

Patienter med positiv odling med agens som bedömdes som patogent i samband med tillkomst av feber indelades i gruppen ”påvisbar infektion”. Likaså bedömdes tecken på nyligen tillkomna infiltrat på lungröntgen i samband med tillkomst av feber som påvisbar infektion. Patienter med NF som saknade mikrobiologiskt eller radiologisk påvisbar infektion indelades i gruppen ”ej påvisbar infektion”.

2.3 I

Under behandlingstiden utfördes provtagning före start av cytostatikabehandling, vid diagnos av NF samt varje morgon under slutenvård på grund av NF, dock längst under 7 dagar. Vid varje provtagningstillfälle togs 2 plasmarör à 10 ml och 1 serumrör à 6 ml. Blod togs både från CVK och perifert. Provrören frystes ner i 3 st 3 ml EDTA-rör, 1 st 6 ml EDTA-rör och 1 st 6 ml serumrör utan tillsats. Samtliga prover förvarades i – 80 grader Celsius.

I denna pilotstudie analyserades 2 plasmaprov, 3 ml EDTA-rör, per patient, provet som togs i samband med diagnos av NF (feberprovet) samt provet som togs den första morgonen efter tillkomst av feber (dag-1-prov). Alla analyser utfördes på plasma-EDTA. Mätning av CRP och PCT utfördes på sektionen för Laboratoriemedicin, Klinisk kemi på USÖ. CRP mättes med lateximmunanalys (Multigent CRP Vario) (Abbott, Weisbaden, Germany). PCT mättes med elektrokemiluminiscensimmnanalys (Elecsys BRAHMS PCT) (Roche, Mannheim, Germany). sPLA2-IIA analyserades med enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) som utfördes på

6

2.4 ELISA

PLA2-

För att kvantifiera sPLA2-koncentrationen i plasma användes sPLA2 (human Type IIA) ELISA kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), en sandwich-ELISA med två antikroppar som utfördes enligt tillverkarens anvisningar. Samtliga delar i ELISA-förpackning förvarades nedfryst i -80 grader och upptinades i rumstemperatur precis innan utförandet. ELISA-plattan (Item No. 401382) bestod av 96 brunnar klädda med en monoklonal antikropp, specifik för sPLA2IIA som

reagerade med sPLA2-IIA vid tillsats av plasma. En andra antikropp upptäckte bundet sPLA2-IIA

och ett konjugerat enzym genererade färg vid tillsats av substrat. Den optiska densiteten korrelerade till den totala mängden sPLA2-IIA i brunnen.

sPLA2 (recombinant human Type IIA) (Bulk Standard 10 ng/ml) (Cayman Chemical, Item No.

401384) späddes enligt schema för bildning av åtta standardprover med kända koncentrationer analyt (se Tabell 1 nedan). Värdena för optisk densitet för respektive koncentration fördes in i ett diagram och bildade en linjär standardkurva som användes som referens för analys av

plasmaproverna.

Tabell 1: Spädning av standardprover för bildande av standardkurva

Standardprov (SP)

Koncentration sPLA2-IIA

Utförande

SP1 2000 pg/ml 800 µl ELISA Buffer + 200 µl Bulk standard

SP2 1000 pg/ml 500 µl ELISA Buffer + 500 µl av prov SP1

SP3 500 pg/ml 500 µl ELISA Buffer + 500 µl av prov SP2

SP4 250 pg/ml 500 µl ELISA Buffer + 500 µl av prov SP3

SP5 125 pg/ml 500 µl ELISA Buffer + 500 µl av prov SP4

SP6 62,5 pg/ml 500 µl ELISA Buffer + 500 µl av prov SP5

SP7 31,3 pg/ml 500 µl ELISA Buffer + 500 µl av prov SP6

7 Medföljande buffrar späddes inför utförandet. 10 ml ELISA Buffer Concentrate (10X) (Cayman Chemical, Item No. 400060) blandades med 90 ml MilliQ-vatten®. 5 ml Wash Buffer

Concentrate (400X) (Cayman Chemical, Item No. 400062) späddes till en total volym av två liter med MilliQ-vatten® varpå 1 ml Polysorbate 20 (Cayman Chemical, Item no. 400035) tillsattes. De två utspädda koncentraten användes direkt efter beredning.

Anti-sPLA2 (human Type IIA) HRP Conjugate (Cayman Chemical, Item No. 401381)

(monokonal antikropp från mus) levererades koncentrerad (10 X). 1,2 ml koncentrat späddes i 10,8 ml ELISA Buffer. Plasmaproverna späddes 1:20 med ELISA Buffer.

100 µl utspädd standard- eller plasmaprov pipetterades till varje brunn. Varje standardprov pipetterades i två brunnar och varje plasmaprov i tre brunnar. Plattan täcktes med plastfilm (96-Well cover sheet, Item No. 400012) och inkuberades i två timmar i rumstemperatur på ett skakbord i 450 varv per minut varpå brunnarna tvättades maskinellt fyra gånger med Wash Buffer. 100 µl Anti-sPLA2 (human Type IIA) HRP Conjugate (Cayman Chemical, Item No.

401381) tillsattes till varje brunn. Plattan täcktes med plastfilm och inkuberades i rumstemperatur i ytterligare en timme på ett skakbord i 450 varv per minut varpå brunnarna tvättades ytterligare fyra gånger. 100 µl TMB (3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine) Substrate Solution (Cayman Chemical, Item No. 400074) tillsattes till varje brunn varpå plattan inkuberades övertäckt i 30 minuter i rumstemperatur i mörker. 100 µl HRP Stop Solution (Cayman Chemical, Item No. 10011355) tillsattes till varje brunn vilket genererade gul färg. Samtliga brunnar avlästes spektrofotometriskt vid en våglängd av 450 nm. sPLA2-IIA-koncentrationen i varje plasmaprov jämfördes sedan mot

standardkurvan i Excel med hjälp av ELISA (Immunometric/Sandwich) Analysis Tools (Cayman Chemicals, Ann Arbour, MI, USA).

2.5 D

S

All data analyserades i IBM (SPSS Statistics, IBM, Armonk, NY, USA). Mätvärdena för CRP, PCT och sPLA2-IIA kunde antas vara normalfördelade hos en större population, varför oparat T-test användes för statistikberäkning.

8

2.6 E

Patientdata behandlades konfidentiellt genom att varje patient erhöll ett studienummer.

Patientprov märktes med en specifik kod, där en av sifforna var studienumret. Kodnyckeln, det dokument där studienumret kopplas till personnumret och namn, har förvarats inlåst för att garantera patienternas sekretess.

Blodprovtagningstillfällena gjordes i samband med blodprover tagna enligt klinisk rutin och bedömdes inte innebära någon ytterligare risk eller obehag för patienterna.

3 R

ESULTAT

Av de 23 patienterna exkluderades patienter som inte utvecklade NF under vårdtiden (n=8). Totalt 15 patienter ingick därför i studiepopulationen för pilotstudien. En patient föll bort på grund av avsaknad av både feberprov och dag-1-prov. Fyra patienter saknade ett av två prov. Tabell 2: Generella patientkaraktäristika

CRP från feberprovet gav ett medianvärde på 78,3 mg/L hos de utan påvisbar infektion och 140,5 mg/L hos de med påvisbar infektion (se figur 1 nedan). Dag 1 var motsvarande siffror 81,4 samt 128,6 mg/L (se figur 2 nedan). Medianvärdet skiljde mest mellan de två grupperna vid

feberprovet medan skillnaden var något mindre vid dag ett. Statistisk signifikans saknades mellan grupperna både för feberprovet (p=0,31) och för dag-1-provet (p=0,83).

Patienter- n 15

Ålder - medelvärde (intervall) 63 (44-72)

Hematologisk diagnos- n (%)

Myelom 13 (93)

Monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS)

1 (7)

Infektion- n (%)

Påvisbar infektion 6 (43)

9 Figur 2: Boxplot för CRP-värden (mg/L) dagen efter diagnos av neutropen feber för respektive grupp. Boxen representerar medianen samt 1:a och 3:e kvartilen.

Figur 1: Boxplot för CRP-värden (mg/L) vid diagnos av neutropen feber för respektive grupp. Boxen representerar medianen samt 1:a och 3:e kvartilen.

CR

P

CRP vid diagnos av neutropen feber

10 För PCT var medianvärdet vid feberprovet 0,10 µg/L hos de utan påvisbar infektion och 0,14 µg/L hos de med påvisbar infektion (se figur 3 nedan). För dag 1-provet var respektive värden 0,15 och 0,24 µg/L (se figur 4 nedan). Värdet steg till dag 1 för båda grupperna. Ökningen var större i gruppen med påvisbar infektion än hos dem utan infektion. Differensen mellan

medianvärdet i respektive grupp var 0,09 vid feberprovet och 0,13 vid dag-1-provet. Dag-1-provet gav en större skillnad mellan grupperna sett till medianvärdet. Statistisk signifikans saknades mellan grupperna för feberprovet (p=0,97) och dag-1-provet (p=0,47).

Figur 3: Boxplot för PCT-värden (µg/L) vid diagnos av neutropen feber för respektive grupp. Boxen representerar medianen samt 1:a och 3:e kvartilen.

P

CT

11 För sPLA2-IIA låg medianvärdet för feberprovet på 19,4 µg/L för gruppen med påvisbar

infektion jämfört med 33,2 µg/L för gruppen utan påvisbar infektion (se figur 5 nedan), vid dag 1 var motsvarande siffror 34,5 respektive 27,5 µg/L (se figur 6 nedan). För feberprovet var

förhållandet mellan grupperna omvänt, medianvärdet för gruppen utan påvisbar infektion var högre än medianvärdet för gruppen med påvisbar infektion. Statistisk signifikans saknades även för sPLA2-IIA både vid feberprovet (p=0,63) och för dag-1-provet (P=0,72).

Figur 4: Boxplot för PCT-värden (µg/L) dagen efter diagnos av neutropen feber för respektive grupp. Boxen representerar medianen samt 1:a och 3:e kvartilen.

12 Figur 6: Boxplot för sPLA2-IIA-värden (µg/L) dagen efter diagnos av neutropen feber för respektive grupp. Boxen representerar medianen samt 1:a och 3:e kvartilen.

Figur 5: Boxplot för sPLA2-IIA-värden (µg/L) vid diagnos av neutropen feber för respektive grupp. Boxen representerar medianen samt 1:a och 3:e kvartilen.

sPL

A2

-II

A

sPLA2-IIA vid diagnos av neutropen feber

13 Förändringen av sPLA2-IIA i µg/L mellan feberprovet och dag-1-provet var större inom gruppen

med påvisbar infektion jämfört med gruppen utan påvisbar infektion (se figur 7 nedan). Inom gruppen med påvisbar infektion ökade mätvärdet mellan de två proven för alla patienter. Inom gruppen utan påvisbar infektion ökade värdet för några patienter, minskade för andra och för några skedde i princip ingen förändring mellan de två provtagningstillfällena. Statistisk signifikans saknades mellan grupperna (p= 0,11).

Patienterna i gruppen med påvisbar infektion hade påvisbar bakteremi (n=1), misstänkt pneumoni (n=1) samt positiv odling från blod från kateterspets på CVK (n=4). Patienten med bakteremi uppmätte CRP-värden på 6,7 och 14 mg/L för feberprovet respektive dag-1-provet. Motsvarande värden var 0,26 och 0,24 µg/L för PCT samt 7,2 och 9,0 µg/L för sPLA2-IIA.

Figur 7: Förändringen av sPLA2-IIA-värden mellan feberprovet och dag-1-provet för samtliga patienter i respektive grupp.

14

4 D

ISKUSSION

Ett stort antal biomarkörer har testats på neutropena patienter i syfte att skilja infektion från FUO som orsak till feber. CRP och PCT är etablerade biomarkörer, men saknar förmåga att säkert identifiera infektion vid NF medan sPLA2-IIA hittills bara undersökts på immunokompetenta.

Enligt denna studie verkar CRP vara den biomarkör som bäst skiljer gruppen med påvisbar infektion från gruppen utan påvisbar infektion sett till skillnaden i medianvärde mellan de två grupperna. Skillnaden är dock inte signifikant och spridningen av mätvärdena är stor, vilket ses tydligt i Figur 1, där flera mätvärden blivit outliers. Ett diagram för en för syftet optimal

biomarkör hade visat två helt åtskilda grupper där samtliga värden håller sig inom två åtskilda spann vilket hade möjliggjort en enkel gränsdragning mellan grupperna. Ett enskilt mätvärde skulle på så sätt kunna placera en patient i en av de två grupperna och med säkerhet fastställa antingen infektion eller FUO. De två gruppernas spann av mätvärden för CRP är näst intill samma, vilket innebär att ett enskilt värde ka tillhöra båda grupperna. CRP kan därför inte anses vara en pålitlig markör för att skilja de två grupperna åt enligt vår studie. I en liknande studie av Lilienfeld-Toal et al. (30) mättes CRP på prover tagna dagen efter tillkomst av feber. Mätvärdena var högre hos de med infektion, men ingen statistisk signifikans fanns mellan grupperna, vilket är i linje med de resultat som erhölls i vår studie. I en studie av Richter et al. (26) saknades också signifikant skillnad för CRP mellan grupperna vid diagnos av NF och vid dag 1. De kunde dock påvisa statistisk signifikans för provet taget två dagar efter diagnos av NF. Stigning av CRP vid infektion verkar alltså släpa efter, varför CRP inte med säkerhet kan skilja grupperna åt direkt efter diagnos NF. Det är rimligt att anta att även vår studie skulle kunna påvisa signifikant skillnad för CRP mellan grupperna om prover tagna senare efter diagnostillfället använts.

Eftersom antibiotika ska sättas in direkt vid tillkomst av NF efterfrågas en markör som kan skilja grupperna på feberprovet, därför använde vår studie enbart de två tidigaste tagna proverna. Statistisk signifikans skulle möjligen också kunna påvisas om studien utförts på en större population. Att påvisa statistisk signifikans innebär dock inte att markören är optimal, det mest önskvärda är en markör som ger helt åtskilda grupper.

PCT visade sig vara något sämre än CRP på att skilja infekterade patienter från dem utan påvisbar infektion och uppvisar samma brister som CRP. Statistisk signifikans saknades mellan grupperna, spridningen av värden var stor och diagrammen gav flera outliers. I ovan nämnda

15 studie av Richter et al. (26) undersöktes även PCT. PCT kunde skilja grupperna åt med

signifikans först på den fjärde dagen efter diagnos av NF. Det är rimligt att även här anta att p-värdet skulle förbättras om prover togs senare efter diagnos av NF. I studien av Lilienfeld-Toal et al. (30) kunde PCT dock identifiera bakteriemi redan från dag-1-provet. I vår studie inkluderades inte enbart patienter med bakteriemi, vilket kan vara en orsak till de olika resultaten eftersom det är rimligt att anta att olika typer av infektioner är olika lätta att identifiera. Studier där PCT mäts på prover från diagnostillfället av NF visar dock att PCT inte kan skilja grupperna åt (33–35). Även här skulle det vara möjligt att statistisk signifikans skulle kunna påvisas om

studiepopulationen var större.

I enlighet med studien av Wennerås et al. (3) och ovan nämnda studier kan varken CRP eller PCT enskilt och med säkerhet skilja patienter med infektion från patienter med steril inflammation. Mätvärdena i de två grupperna överlappar i stor utsträckning och utgör en stor begränsning för markörerna i kliniken. Tidigare studier har visat att PCT är en något bättre markör än CRP på neutropena patienter för att tidigt skilja gruppen med infektion från gruppen med FUO (3,30,36), framförallt vid allvarliga infektioner (13). Att vår studie visar att CRP är bättre kan bero på att studiepopulationen är liten, en större population skulle kunna ge andra resultat. Det bör även tas i beaktning att fyra mätvärden saknades, vilket ytterligare minskade datamängden och kan ha påverkat resultaten.

För sPLA2-IIA var medianvärdet högre för gruppen utan påvisbar infektion än för gruppen med

påvisbar infektion vid feberprovet i motsats till CRP och PCT samt dag-1-provet för sPLA2-IIA.

Detta tyder på att sPLA2-IIA sannolikt inte är en lämplig biomarkör för att påvisa infektion hos

neutropena patienter. Dessutom ses en stor spridning av värden även för sPLA2-IIA och de två

grupperna överlappar varandra i stor utsträckning. Detta indikerar ytterligare att dess roll som infektionsmarkör är begränsad och det är inte sannolikt att utförandet kommer att replikeras på en större population eftersom resultaten troligen inte kommer att förbättras. Även om statistisk signifikans skulle uppmätas mellan grupperna med en större studiepopulation skulle grupperna med största sannolikhet ändå överlappa varandra och därmed begränsa sPLA2-IIA:s validitet som

markör hos neutropena patienter.

Resultaten av sPLA2-IIA är sannolikt inte påverkade av metodfel i samband med ELISA

16 från tillverkaren. sPLA2-IIA-värden från analys av plasmaproverna liknade dessutom de värden

som Tan et al. erhöll i sin studie av sPLA2-IIA (32), vilket ytterligare stärker antagandet om att

ELISA utfördes korrekt. Det bör dock tas i beaktande att proverna upptinades inför mätningen av CRP och PCT för att sedan frysas och upptinas igen inför utförandet av ELISA. Enligt

tillverkarens anvisningar skulle ELISA utföras på proverna direkt efter insamling, alternativt direkt efter upptining från -80 grader. Det är oklart huruvida avvikandet från denna

rekommendation skulle påverka resultaten av ELISA.

Trots att sPLA2-IIA inte uppvisar de egenskaper som krävs av en bra biomarkör för ändamålet

stiger ändå värdet från feberprovet till dag-1-provet mer i gruppen med påvisbar infektion (se figur 7). Detta indikerar att sPLA2-IIA ändå korrelerar med infektion, även om statistisk

signifikans saknades. Det förändrar dock inte att sPLA2-IIA inte kan antas vara en bra markör för

att skilja patienter åt eftersom spridningen inom båda grupperna är stor. Dessutom indikerar detta att stigningen av sPLA2-IIA vid infektion släpar, i likhet med CRP, vilket gör sPLA2-IIA mindre

intressant som biomarkör hos denna patientgrupp.

I gruppen med påvisbar infektion hade en patient påvisbar bakteremi. Patientens CRP- och sPLA2-IIA-värden låg under den första kvartilen vid båda provtagningstillfällena vilket inte

indikerar att CRP eller sPLA2-IIA skulle vara bättre på att skilja patienter med bakteremi från

dem utan påvisbar infektion jämfört med analys av alla typer av infektioner. PCT-värdet för bakteriemipatienten låg ovan medianvärdet vid feberprovet och var lika med medianvärdet vid dag-1-provet. Detta indikerar att PCT skulle kunna skilja patienter med bakteremi från dem utan infektion bättre än om gruppen med infektion innehåller alla typer av infektioner, vilket skulle kunna gå i linje med ovan nämnda studier av PCT (26,30). Det krävs dock en större

studiepopulation med flera bakteremipatienter för att kunna dra några slutsatser kring huruvida sPLA2-IIA skulle kunna vara en användbar biomarkör för att skilja patienter med bakteremi från

dem utan påvisbar infektion.

En begränsning i metoden är det faktum att infektion är svår att påvisa med dagens

mikrobiologiska, kliniska och radiologiska metoder (24). Det innebär att patienter med infektion kan hamna i gruppen utan påvisbar infektion och på så sätt påverka resultaten. Till dess att bättre metoder för att påvisa infektion hos neutropena patienter upptäckts är detta en oundviklig felkälla i studier kring infektion hos denna patientgrupp.

17 Sammanfattningsvis indikerar resultaten att sPLA2-IIA troligtvis inte har en funktion som

biomarkör för bakteriell infektion hos patienter med neutropen feber. sPLA2-IIA uppvisar inte de

egenskaper som krävs av en bra infektionsmarkör i denna patientgrupp. Spridningen av

mätvärdena är stor och grupperna överlappar varandra. CRP visade sig vara den bästa markören, följt av PCT och sPLA2-IIA. Ingen av markörerna kunde dock ensam skilja de två grupperna åt

på ett tillförlitligt sätt. Sökandet efter en mer användbar biomarkör på neutropena patienter än dagens konventionella markörer behöver fortsätta.

18

5 R

EFERENSER

1. Gahrton G, Juliusson G. Blodets sjukdomar: lärobok i hematologi. Lund: Studentlitteratur; 2012. 93-94 s.

2. Nørgaard M, Larsson H, Pedersen G, Schønheyder HC, Sørensen HT. Risk of bacteraemia and mortality in patients with haematological malignancies. Clin Microbiol Infect. mars 2006;12(3):217– 23.

3. Wennerås C, Hagberg L, Andersson R, Hynsjö L, Lindahl A, Okroj M, m.fl. Distinct Inflammatory Mediator Patterns Characterize Infectious and Sterile Systemic Inflammation in Febrile Neutropenic Hematology Patients. PLOS ONE. mars 2014;9(3):e92319.

4. Giamarellos-Bourboulis EJ, Grecka P, Poulakou G, Anargyrou K, Katsilambros N, Giamarellou H. Assessment of Procalcitonin as a Diagnostic Marker of Underlying Infection in Patients with Febrile Neutropenia. Clin Infect Dis. 15 juni 2001;32(12):1718–25.

5. Gratwohl A, Baldomero H, Aljurf M, Pasquini MC, Bouzas LF, Yoshimi A, m.fl. Hematopoietic stem cell transplantation A Global Perspective. JAMA J Am Med Assoc. 28 april

2010;303(16):1617–24.

6. Autolog stamcellstransplantation [Internet]. Sahlgrenska Universitetssjukhuset. 2015 [citerad 29 mars 2017]. Tillgänglig vid: https://www.sahlgrenska.se/w/a/autolog-stamcellstransplantation/ 7. Print MCS. Overview [Internet]. Mayo Clinic. [citerad 30 mars 2017]. Tillgänglig vid:

http://www.mayoclinic.org/tests-procedures/autologous-stem-cell-transplant/gnc-20248048 8. Tomblyn M, Chiller T, Einsele H, Gress R, Sepkowitz K, Storek J, m.fl. Guidelines for Preventing

Infectious Complications among Hematopoietic Cell Transplant Recipients: A Global Perspective. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. oktober 2009;15(10):1143– 238.

9. Balletto E, Mikulska M. Bacterial Infections in Hematopoietic Stem Cell Transplant Recipients. Mediterr J Hematol Infect Dis [Internet]. 01 juli 2015 [citerad 29 mars 2017];7(1). Tillgänglig vid: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4500472/

10. Bodey GP, Buckley M, Sathe YS, Freireich EJ. Quantitative relationships between circulating leukocytes and infection in patients with acute leukemia. Ann Intern Med. februari 1966;64(2):328– 40.

11. Hughes WT, Armstrong D, Bodey GP, Bow EJ, Brown AE, Calandra T, m.fl. 2002 Guidelines for the Use of Antimicrobial Agents in Neutropenic Patients with Cancer. Clin Infect Dis. 15 mars 2002;34(6):730–51.

12. Link H, Böhme A, Cornely OA, Höffken K, Kellner O, Kern WV, m.fl. Antimicrobial therapy of unexplained fever in neutropenic patients. Ann Hematol. 01 oktober 2003;82(2):S105–17.

13. Aimoto M, Koh H, Katayama T, Okamura H, Yoshimura T, Koh S, m.fl. Diagnostic performance of serum high-sensitivity procalcitonin and serum C-reactive protein tests for detecting bacterial infection in febrile neutropenia. Infection. 01 december 2014;42(6):971–9.

19 14. Klastersky J. Management of Fever in Neutropenic Patients with Different Risks of Complications.

Clin Infect Dis. 15 juli 2004;39(Supplement_1):S32–7.

15. Gac A-C, Parienti J-J, Chantepie S, Fradin S, Le Coutour X, Leclercq R, m.fl. Dynamics of

procalcitonin and bacteremia in neutropenic adults with acute myeloid leukemia. Leuk Res. oktober 2011;35(10):1294–6.

16. Prat C, Sancho JM, Domínguez J, Xicoy B, Giménez M, Ferrà C, m.fl. Evaluation of procalcitonin, neopterin, C-reactive protein, IL-6 and IL-8 as a diagnostic marker of infection in patients with febrile neutropenia. Leuk Lymphoma. 01 januari 2008;49(9):1752–61.

17. Neuburger S, Maschmeyer G. Update on management of infections in cancer and stem cell transplant patients. Ann Hematol. 01 juni 2006;85(6):345–56.

18. Penack O, Rempf P, Eisenblätter M, Stroux A, Wagner J, Thiel E, m.fl. Bloodstream infections in neutropenic patients: early detection of pathogens and directed antimicrobial therapy due to surveillance blood cultures. Ann Oncol. 01 november 2007;18(11):1870–4.

19. Klastersky J, Ameye L, Maertens J, Georgala A, Muanza F, Aoun M, m.fl. Bacteraemia in febrile neutropenic cancer patients. Int J Antimicrob Agents. november 2007;30 Suppl 1:S51-59. 20. Viscoli C, Cometta A, Kern WV, Bock R, Paesmans M, Crokaert F, m.fl. Piperacillin-tazobactam

monotherapy in high-risk febrile and neutropenic cancer patients. Clin Microbiol Infect Off Publ Eur Soc Clin Microbiol Infect Dis. mars 2006;12(3):212–6.

21. Aust C, Tolfvenstam T, Broliden K, Ljungman P, Kalin M, Giske CG, m.fl. Bacteremia in Swedish hematological patients with febrile neutropenia: Bacterial spectrum and antimicrobial resistance patterns. Scand J Infect Dis. 01 april 2013;45(4):285–91.

22. Stoma I, Karpov I, Uss A, Rummo O, Milanovich N, Iskrov I. Diagnostic value of sepsis biomarkers in hematopoietic stem cell transplant recipients in a condition of high prevalence of gram-negative pathogens. Hematol Oncol Stem Cell Ther. mars 2017;10(1):15–21.

23. Peters RP, van Agtmael MA, Danner SA, Savelkoul PH, Vandenbroucke-Grauls CM. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect Dis. december 2004;4(12):751–60.

24. Giamarellou H, Giamarellos-Bourboulis EJ, Repoussis P, Galani L, Anagnostopoulos N, Grecka P, m.fl. Potential use of procalcitonin as a diagnostic criterion in febrile neutropenia: experience from a multicentre study. Clin Microbiol Infect. 01 juli 2004;10(7):628–33.

25. Póvoa P, Souza-Dantas VC, Soares M, Salluh JI. C-reactive protein in critically ill cancer patients with sepsis: influence of neutropenia. Crit Care. 2011;15:R129.

26. Richter ME, Neugebauer S, Engelmann F, Hagel S, Ludewig K, Rosée PL, m.fl. Biomarker candidates for the detection of an infectious etiology of febrile neutropenia. Infection. 01 april 2016;44(2):175–86.

27. Póvoa P, Coelho L, Almeida E, Fernandes A, Mealha R, Moreira P, m.fl. Early identification of intensive care unit-acquired infections with daily monitoring of C-reactive protein: a prospective observational study. Crit Care. 2006;10(2):R63.

20 28. Kuderer NM, Dale DC, Crawford J, Cosler LE, Lyman GH. Mortality, morbidity, and cost

associated with febrile neutropenia in adult cancer patients. Cancer. 15 maj 2006;106(10):2258–66. 29. Chan SM, Chadwick J, Young DL, Holmes E, Gotlib J. Intensive serial biomarker profiling for the

prediction of neutropenic fever in patients with hematologic malignancies undergoing

chemotherapy: a pilot study. Hematol Rep [Internet]. 23 juni 2014 [citerad 13 april 2017];6(2). Tillgänglig vid: http://www.pagepress.org/journals/index.php/hr/article/view/5466

30. Lilienfeld-Toal M von, Dietrich MP, Glasmacher A, Lehmann L, Breig P, Hahn C, m.fl. Markers of bacteremia in febrile neutropenic patients with hematological malignancies: procalcitonin and IL-6 are more reliable than C-reactive protein. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 01 juli 2004;23(7):539– 44.

31. Whang KT, Steinwald PM, White JC, Nylen ES, Snider RH, Simon GL, m.fl. Serum Calcitonin Precursors in Sepsis and Systemic Inflammation. J Clin Endocrinol Metab. 01 september 1998;83(9):3296–301.

32. Tan TL, Ahmad NS, Nasuruddin DN, Ithnin A, Arifin KT, Zaini IZ, m.fl. CD64 and Group II Secretory Phospholipase A2 (sPLA2-IIA) as Biomarkers for Distinguishing Adult Sepsis and Bacterial Infections in the Emergency Department. PLOS ONE. mars 2016;11(3):e0152065. 33. Svaldi M, Hirber J, Lanthaler A i., Mayr O, Faes S, Peer E, m.fl. Procalcitonin-reduced sensitivity

and specificity in heavily leucopenic and immunosuppressed patients. Br J Haematol. 01 oktober 2001;115(1):53–7.

34. Procalcitonin: A Diagnostic Marker of Bacterial Infection in Neutropenic Cancer Patients with Fever? Infection. 01 december 2000;28(6):398–400.

35. Robinson JO, Lamoth F, Bally F, Knaup M, Calandra T, Marchetti O. Monitoring Procalcitonin in Febrile Neutropenia: What Is Its Utility for Initial Diagnosis of Infection and Reassessment in Persistent Fever? PLOS ONE. april 2011;6(4):e18886.

36. Massaro KS, Costa SF, Leone C, Chamone DA. Procalcitonin (PCT) and C-reactive Protein (CRP) as severe systemic infection markers in febrile neutropenic adults. BMC Infect Dis. 22 november 2007;7:137.