Utbyte av xylen till Tissue Clear
som avparaffineringsmedel vid
diagnostik
av
endometrioid
carcinom med DNA-ploidi
HUVUDOMRÅDE: Biomedicinsk Laboratorievetenskap FÖRFATTARE: Rebecka Fridén och Therese Sandberg
HANDLEDARE: Hanna Andersson, Anette Nilsson Bowers, Emma Carlsson, Nataliya Vytrva JÖNKÖPING 2020 Maj
Sammanfattning
Flödescytometrisk analys av ploiditeten används vid diagnostisering av endometriecancer. DNA-ploidi reflekterar cellcykeln och avgör om tumörens cellpopulationen är diploid eller aneuploid, där aneuploiditet förknippas med sämre prognos. Vid analys av paraffininbäddat vävnadsmaterial används avparaffineringsmedlet xylen, vars toxiska egenskaper försämrar arbetsmiljön på laboratoriet. Den har en stark och obehaglig lukt som kan orsaka illamående och yrsel. Syftet med studien var att undersöka om xylen kan ersättas med xylensubstitutet Tissue Clear, ett isoparaffinskt kolväte som är mindre toxiskt. Studien omfattade paraffininbäddad humanvävnad från endometrioid carcinom (n=20), både diploid (n=15) och aneuploid (n=5) vävnad, som avparaffinerades med xylen respektive Tissue Clear innan DNA-ploidi utfördes. Eventuella skillnader inom de flödescytometriska parametrarna % CV-diploid, % S-fas, % debris och DI-aneuploid undersöktes och vid statistisk analys kunde ingen signifikant skillnad ses på samtliga parametrar. Eftersom analysen utförs sällan i rutin är antalet prover i studien relativt stor, trots att detta kan anses vara en liten kvantitet. Av dessa var endast 25 % av proverna aneuploida. Att en patient uppvisar aneuploiditet är ovanligt och därför ansågs även denna mängd som tillräckligt stor. Studien visar att avparaffinering med Tissue Clear är ekvivalent med xylen och därmed kan Tissue Clear ersätta xylen oavsett om vävnaden är diploid eller aneuploid.
Summary
Exchange xylene to Tissue Clear as deparaffinization agent in DNA ploidy analysis of endometrial carcinoma samples
DNA ploidy is used for endometrial cancer diagnosis. It reflects the cell cycle and determines whether the cell population in tumors is diploid or aneuploid. When analyzing paraffin embedded tissues xylene can be used for deparaffinization, whose toxicity impairs the laboratory´s work environment. Its strong and unpleasant smell can cause nausea and dizziness. The aim of this study was to investigate if xylene can be replaced with Tissue Clear, an isoparaffinic hydrocarbon that is less toxic. The study included paraffin embedded human tissues from endometrioid carcinoma (n=20), both diploid (n=15) and aneuploid (n=5), deparaffinized with xylene or Tissue Clear before DNA ploidy was performed. Potential differences between the parameters % CV-diploid, % S-phase, % debris and DI-aneuploid were statistically examined and showed no significant differences. The sample amount in this study might be considered low, though it is relatively high since the analysis is rarely performed routinely. Among these only 25 % were aneuploid. Patients showing aneuploidy is rare and the amount was therefore considered to be sufficient as well. The study shows that deparaffinization with Tissue Clear generates equivalent results as for xylene and can thereby replace xylene regardless if the tissue is diploid or aneuploid. Keywords: xylene substitute, endometrial cancer, flow cytometry, aneuploidy, diploidy
Innehållsförteckning
1. Inledning ... 1
2. Bakgrund ... 1
2.1 Endometriecancer ... 1
2.1.1 Cancerutveckling till följd av genetiska mutationer ... 1
2.1.2 Histopatologisk klassificering och stadieindelning ... 2
2.2 Flödescytometri ... 2
2.2.1 Metodprincip DNA-ploidi ... 3
2.3 Användning av xylen ... 3
2.3.1 Xylens toxiska effekter ... 3
2.3.2 Utbyte av xylen till Tissue Clear ... 4
3. Syfte ... 4
4. Material och metod ... 4
4.1 Studiedesign och vävnadsmaterial ... 4
4.2 Snittning ... 4
4.3 Avparaffinering enligt Schuttes metod ... 5
4.3.1 Xylen ... 5
4.3.2 Tissue Clear ... 5
4.4 Infärgning enligt Vindeløvs metod ... 5
4.5 Analys med flödescytometri ... 5
4.6 Statistisk analys ... 6 4.7 Etiska överväganden ... 7
5. Resultat ... 7
6. Diskussion ... 9
6.1 Resultatdiskussion... 9 6.2 Metoddiskussion... 10 6.3 Vidare forskning ... 117. Slutsatser ... 12
8. Omnämnanden... 12
9. Referenser ... 13
10. Bilagor ... 15
1
1. Inledning
Vid diagnostik av endometriecancer kan flödescytometrisk DNA-ploidi användas. Analysen beskriver antalet homologa kromosomuppsättningar som finns i en cell, vilket kan ge information om en tumör är aneuploid eller diploid, vilket är kan användas som underlag vid prognostisering. Cellkärnan färgas in med fluorokromen propidiumjodid, där mängden DNA i cellkärnan är direkt proportionell mot den uppmätta fluorescensen. Analysen kan utföras på paraffininbäddade vävnadsprover, men för att kunna mäta mängden DNA i cellerna måste de först frigöras genom avparaffinering (1, 2). På laboratoriemedicin på länssjukhuset Ryhov i Jönköping används xylen som avparaffineringsmedel vid DNA-ploidi. Xylen är ett toxiskt ämne som på flera sätt kan orsaka allvarlig skada vid inkorrekt hantering. Den har en obehagligt stark lukt och kan vid inandning orsaka andningssvårigheter, yrsel och huvudvärk (3). För att undvika de risker som hantering av xylen medför bör det bytas ut till ett mildare alternativ. Dock krävs det att det nya ämnet ger ett likvärdigt resultat vid avparaffinering. Ett alternativ till xylen är Tissue-Tek® Tissue Clear® Xylene Substitute (Sakura Finetek Europé B.V, Nederländerna). Tillverkaren hävdar att deras produkt är ekvivalent med xylen och eftersom Tissue Clear (TC) är mindre toxiskt än xylen medför utbytet högre säkerhet och därmed bättre arbetsmiljö för laboratoriepersonalen (4).
En studie för att undersöka om TC kan ersätta xylen har tidigare genomförts på länssjukhuset Ryhov i Jönköping. Studien visade att användning av TC på diploid vävnad ger likvärdiga resultat som vid användning av xylen. Dock påvisades signifikant skillnad i resultat mellan TC och xylen på aneuploid vävnad. Studien omfattades av fyra diploida och två aneuploida patientprover och för att kunna applicera resultatet i rutin krävs det att en mer omfattande studie genomförs på en större mängd prover, inklusive fler prover med aneuploid vävnad. Eftersom analys av DNA-ploidi används för att påvisa bland annat diploid och aneuploid endometrievävnad genomförs denna studie för att undersöka om ett likvärdigt resultat vid avparaffinering kan erhållas på båda typerna (5).
2. Bakgrund
2.1 Endometriecancer
Endometriecancer är den vanligaste gynekologiska tumören i industrialiserade länder, varav den femte vanligaste cancerformen hos kvinnor. Utveckling av endometriecancer kan följa två olika vägar, där typ I är östrogenberoende och kan relateras till livsstilsfaktorer, såsom ökad förekomst av obesitas och det metabola syndromet. Typ II är icke-östrogenberoende vars prevalens ökar parallellt med en åldrande befolkning (6). Denna studie omfattar typ I-tumörer, vilket är endometrioida carcinom som motsvarar ungefär 80 % av cancerfallen. De flesta typ I-tumörer är högt differentierade och begränsade till uterus vilket resulterar i en god prognos för patienterna i jämförelse med patienter med typ II-tumörer. Det senare är papillära serösa carcinom vars sämre prognos associeras med progressiv tillväxt och högre risk för metastaser. Typ I-tumörer drabbar oftast kvinnor i pre- eller perimenopaus medan typ II drabbar de i postmenopaus (6, 7).
2.1.1 Cancerutveckling till följd av genetiska mutationer
Cancerceller kännetecknas av ohämmad celltillväxt, vilket indikerar på att den normala cellcykeln rubbats. Detta är ett resultat av olika typer av mutationer på generna, vilket i sin tur kan ge upphov till genomisk instabilitet och utveckling av cancer. Dessa mutationer kan delas in i två olika kategorier. Den ena kategorin beror på mitotiska fel med antingen förlust eller tillförsel av kromosomer eller kromosompar, så kallade genomiska mutationer. Den andra beror på kromosomala mutationer, exempelvis translokation av genetiskt material mellan två olika kromosomer som på så sätt förändrar kromosomuppsättningen. Ett förekommande tillstånd hos cancerceller är aneuploidi, vilket innebär att antalet kromosomer avviker från de normala diploida cellerna (2).
Cellcykeln är noga kontrollerad och reglerad av bland annat onkogener och tumörsuppressorgener. Detta hindrar att celler med stora DNA-skador eller skadliga mutationer fortsätter att dela sig genom att reparera mutationerna eller inducerar apoptos. Onkogenerna initierar DNA-syntesen (förflyttar cellen från G1 till S-fasen i cellcykeln) eller mitosen (förflyttar cellen från G2 till M-fasen), se Figur 1. Generna hindrar även apoptos. Vid mutation i onkogener orsakas avvikande aktivitet hos de bildade proteinerna vilket främjar tumörutveckling. Tumörsuppressorgener hindrar celltillväxt genom att
2
motverka förflyttning av cellen från G1- och G2-fasen. Dessutom kan de reparera skadat DNA eller inducera apoptos, men vid mutation minskar deras funktion (8). När dessa gener i cancercellerna drabbas av mutationer kan genomisk instabilitet och aneuploidi orsakas. I tumörer mäts ploiditet med hjälp av DNA-ploidiindex (DI) för att avgöra förekomst av aneuploida eller diploida celler, vilket indirekt reflekterar nivån på genomisk instabilitet och hur aggressiv tumören är. Analys av DI speglar den genomsnittliga mängden DNA i tumörcellerna eftersom DNA-ploiditet beskriver antalet homologa kromosomuppsättningar. Indexet har betydelse vid prognostisering av bland annat endometriecancer eftersom ett DNA-innehåll som är aneuploid förknippas med sämre prognos. Analysen jämför patientens cellpopulation med en normal diploid cellpopulation (2). Därmed är majoriteten av somatiska celler diploida eftersom de normalt befinner sig i vilofasen utanför cellcykeln (G0) (9).
Figur 1. Cellcykelns olika faser (8). Modercellen delar sig vid mitosen (M) till två dotterceller som innehåller varsin diploid kromosomuppsättning och som i sin tur tillväxer (G1) för att sedan genomgå DNA-replikation (S) som resulterar i två diploida kromosomuppsättningar (G2). Majoriteten av somatiska celler är dock inaktiva och lämnar G1-fasen för att befinna sig i vilofasen (G0) där de förblir diploida (visas ej i figuren).
2.1.2 Histopatologisk klassificering och stadieindelning
Vid misstanke om förändringar i endometrievävnaden kan prover tas i form av endometriebiopsi eller abrasio. Vid biopsi tas en del av vävnaden bort och vid abrasio skrapas slemhinnan. I studien användes abrasio men även resektat, vilket innebär att en del av organet avlägsnas. Om endometriecancer bekräftats vid mikroskopisk undersökning av provtyperna sker klassificering av cancern för att prognostisera cancerutvecklingen. Den viktigaste prognostiska faktorn i Sverige är stadieindelning av cancern enligt International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) som dessutom styr behandlingen (10). Förutom stadieindelning enligt FIGO baseras prognosen på vilken histologisk tumörtyp som identifierats vid mikroskopisk granskning. Den baseras också på DI eftersom en aneuploid cellpopulation förknippas med en sämre prognos (2).
2.2 Flödescytometri
Flödescytometri är en metod där enstaka celler mäts genom att de flödar i en vätskeström mot en detektor. Det kan tillämpas på flera typer av provmaterial, såsom perifert blod, cerebrospinalvätska och biopsier. Innan analys i flödescytometern förbehandlas provet för att isolera cellerna av intresse och binds därefter till fluorescent-märkta antikroppar. I instrumentet blandas de med en cellfri bärarvätska och flödar med hjälp av hydrodynamisk fokusering mot en laser. Fluoroforen bunden till cellerna kommer vid passering av lasern excitera laserns energi vid en given våglängd för att därefter emittera det vid en längre våglängd i form av fluorescens. Det emitterade ljuset detekteras av ett optiskt system som är känslig för flertalet våglängder, vilket tillåter att flera olika markörer kan detekteras samtidigt. Informationen bearbetas sedan av en mjukvara som presenterar den i olika grafer som visar cellpopulationens storlek och fördelning (11).
3 2.2.1 Metodprincip DNA-ploidi
För att bestämma DNA-innehållet och därmed DNA-ploiditeten i maligna endometriecancerceller kan flödescytometri användas. DNA-innehållet mäts i en suspension med tumörcellkärnor bundna till fluorokromen propidiumjodid (PI) och mätningen baseras på mängden fluorescerande ljus som kärnorna emitterar, vilket reflekterar motsvarande mängd DNA inuti (2). Suspensionen förbereds enligt Vindeløvs metod och den omfattas av en trypsin- och sperminlösning som lyserar membran och cytoskelett samtidigt som kärnorna stabiliseras. Därefter tillsätts en trypsininhibitor som gör att kärnorna förblir stabila när PI slutligen tillsätts (12). Det detekterade ljuset som kärnorna emitterar bearbetas av en mjukvara och presenteras i ett histogram där alla kärnor med motsvarande DNA-kvantitet bildar en topp i histogrammet. I ett histogram med normala somatiska celler representeras den största toppen av diploida celler i G1- eller G0-fasen, vilket beror på att majoriteten av cellerna normalt befinner sig i dessa faser. En minoritet genomgår dock celldelning i G2- och M-fasen och representeras av en mindre topp, se Figur 2 (2). Är cellpopulationen istället aneuploid kommer detta presenteras med flera G0/G1-toppar i histogrammet. För att avgöra om en tumör är diploid eller aneuploid beräknas DI genom att dividera andelen DNA-innehåll i G0/G1-fasen i tumörcellerna med andelen DNA i en diploid kontrollpopulation (2, 13).
Figur 2. DNA-ploidi relaterat till cellcykeln. Histogrammet illustrerar normala somatiska celler relaterat till vilken fas i cellcykeln cellerna befinner sig i. X-axeln representeras av DNA-innehållet i cellpopulationen och y-axeln antalet detekterade cellkärnor (2).
2.3 Användning av xylen
Xylen används frekvent inom histologi och cytologi. Det förekommer inom flera olika användningsområden, bland annat som klarningsmedel när vävnadsmaterial förbereds inför impregnering med paraffin efter dehydreringsprocessen genom att avlägsna alkoholrester. Det används även som avparaffineringsmedel när paraffin avlägsnas från vävnadssnitt innan färgning samt vid montering av objektsglas (14, 15). Ett annat användningsområde för xylen är inför flödescytometrisk analys med DNA-ploidi där Schuttes metod tillämpas. Metoden inleds med ett avparaffineringssteg där xylenet används för att kunna frigöra de paraffininbäddade cellkärnorna. Den omfattar dessutom ett rehydreringssteg samt ett lyseringssteg med trypsin (1).
2.3.1 Xylens toxiska effekter
Xylen har använts inom histopatologi i över tre decennier. Det är en billig och välbeprövad produkt som finns tillgänglig hos flera återförsäljare och är därmed lätt att få tag på. Fördelarna med xylen är att avlägsna alkohol från vävnad snabbt samtidigt som vävnaden lämnas transparant, vilket är önskvärt (15-17). Däremot är det en komplicerad kemikalie att handskas med eftersom den är märkt med faropiktogrammen brandfarlig, skadlig och hälsofarlig. Exponering av dess vätska, ånga och damm kan resultera i flertalet hälsofarliga konsekvenser, vilka kan ge permanenta skador. Xylen kan vid kontakt ge reaktioner som irriterad eller skadad hud och vid lång eller upprepad exponering kan det ge skador på hörselorganen. Vid förtäring kan xylen ge bestående skador på nervsystemet och om det kommer ner i lungorna kan det till och med vara dödligt. Slutligen kan inandning av dess ånga ge besvär som huvudvärk, yrsel och andningsbesvär (3).
4 2.3.2 Utbyte av xylen till Tissue Clear
På grund av xylens toxiska egenskaper har många studier och försök genomförts för att kunna ersätta den mot andra lösningar som är mindre hälso- och miljöfarliga, detta med mer eller mindre framgång. Vissa alternativ, såsom lösningar baserade på olja, har inga hälsofarliga egenskaper men kräver däremot längre verkningstid, vilket skulle fördröja svarstiden väsentligt. Andra alternativ såsom lösningar baserade på bensen, limonen och toluen skadar istället vävnadsproverna (17).Det har dessutom kommersiellt utvecklats flertalet xylensubstitut bestående av isoparaffiniska kolväten som påstås kunna ersätta xylen samtidigt som liknande resultat erhålls. Det finns en summering där olika undersökningar gjorts på flertalet isoparaffinska kolväten. Resultatet från denna summering visar bland annat att isoparaffinska kolväten har mycket låg akut toxicitet och är nästintill giftfri vid inandning och hudkontakt (18). Ett alternativ på isoparaffinskt kolväte är Tissue-Tek® Tissue Clear® Xylene Substitute (TC) (Sakura Finetek Europé B.V, Nederländerna). Enligt tillverkaren är TC i jämförelse med xylen mindre hälso- och miljöfarlig vid kortvarigt bruk eftersom TC inte irriterar huden eller mucosan. Det innebär att handskydd eller kroppsskydd inte krävs vid kortvarig exponering av TC i relation till xylen där skydden ska användas oavsett exponeringstid. TC är dessutom luktfri och mindre lättantändlig än xylen (4, 19). Det finns inga studier som bekräftar vad tillverkaren hävdar om sin produkt. Däremot finns det studier som jämför xylen med andra isoparaffinska kolväten och som motiverar ett utbyte från xylen till isoparaffinska kolväten med att de är mindre hälsofarliga. Exempelvis är den isoparaffinska kolväte-baserade föreningen UltraClearTM mindre toxisk och mindre lättantändlig (20), vilket TC också
är. Sammantaget är TC mindre skadligt och mer skonsam att arbeta med och gör den således till ett säkrare alternativ än xylen, vilket förbättrar arbetsmiljön på laboratoriet (3, 4).
3. Syfte
Syftet med denna studie var att undersöka om Tissue Clear kan ersätta xylen som avparaffineringsmedel vid flödescytometrisk DNA-ploidi av endometrioid carcinom.
4. Material och metod
4.1 Studiedesign och vävnadsmaterial
Studien genomfördes på laboratoriemedicin på länssjukhuset Ryhov i Jönköping. Vävnadsmaterialet som användes i studien var formaldehydfixerad och paraffininbäddad samt utgjordes av humant endometrium (n=20). Av dessa förekom både diploid (n=15) och aneuploid (n=5) vävnad som var av provtyp abrasio (n=12) eller uterusresektat (n=8). Materialet valdes ut och erhölls från personal på Ryhov. Inklusionskriterier för studien var att paraffinklossarna utgjordes av endometrioid carcinom som ej skulle brukas för vidare diagnostik. Exklusionskriterier innefattade utvalda vävnader som bedömdes ha otillräckligt med material eftersom studien krävde att den paraffininbäddade vävnaden kunde generera två snitt med tjockleken 50 µm och ett snitt med 4 µm. Dessutom exkluderades prover som vid tidigare analys haft svårtolkade histogram som krävt extern granskning.
Vid laborativt utförande benämndes proverna med Patologisk-anatomisk diagnos-nummer (PAD-nummer), men innan statistiska beräkningar utfördes kodades pr0verna om. Proverna tilldelades varsin siffra som motsvarade deras identitet. Siffran i kombination med X (xylen) eller TC (Tissue Clear) motsvarade provet och dess avparaffineringsmedel, exempelvis 1X och 1TC representerade samma prov men med olika avparaffineringsmedel. Dessutom betecknades provtyperna uterusresektat och abrasio med :r respektive :a, exempelvis 1X:a och 2TC:r.
4.2 Snittning
För varje nytt prov användes DNA AWAY (Thermo Scientific, Waltham, USA) runt arbetsytan och på redskapen för att eliminera oönskat DNA och DNAser. Tumörområdet på klossen markerades genom ristning enligt instruktioner från patolog. För respektive paraffininbäddad vävnadskloss snittades tre snitt med hjälp av en mikrotom HM355S (Thermo Fisher Scientfic), först två snitt med tjockleken 50 µm och därefter ett kontrollsnitt på 4 µm. De tjockare snitten lades ner i separata koniska glasrör, ett rör avsett för avparaffinering med xylen och ett för TC. Respektive kontrollsnitt på 4 µm lades på objektsglas (Thermo Fisher Scientific) och placerades i instrumentet HE 600 (Roche Diagnostics AB, Solna, Sverige). I instrumentet avparaffinerades och rehydrerades snittet för att sedan färgas med
5
hematoxylin och eosin. Färgintensitetinställningen H4 användes för kärninfärgning med Harris hematoxylin (Roche Diagnostics) och E8 för cytoplasmainfärgning med eosin (Roche Diagnostics). Inställning A2 användes för syredifferentiering. Snittet dehydrerades och ett objektglas monterades med Pertex (Histolab products AB, Askim, Sverige). Glaset undersöktes av patolog för att kontrollera att den maligna vävnaden inte snittats bort helt, för att på så sätt säkerställa att vävnaden som analysen utfördes på bestod av endometrioid carcinom.
4.3 Avparaffinering enligt Schuttes metod
4.3.1 XylenI rör avsedda för avparaffinering med xylen tillsattes 5 ml xylen (Histolab Products AB) för att sedan skakas med vortex yellowline (IKA® Works inc, Wilmington, USA) med inställningen 550 rpm under en timme. Xylenet avlägsnades och processen upprepades en gång till. Vävnadsbitarna rehydrerades genom tillsatts av 5 ml 99,5 % etanol i respektive provrör. De skakades med inställningen 600 rpm i tio sekunder, sedimenterade i tio minuter och därefter avlägsnades etanolen. Rehydreringen fortsattes på samma sätt med alkoholer i minskande koncentration: 95 %, 70 % samt 40 % och slutligen avjoniserat vatten. Innan vattnet pipetterades av centrifugerades proverna med kraften 250 x g i två minuter. Alkoholen ersattes helt genom att ytterligare 5 ml avjoniserat vatten tillsattes och proverna skakades i tio sekunder med inställningen 600 rpm för att sedan sedimentera i tio minuter. Proverna centrifugerades med 700 x g i tio minuter och vattnet avlägsnades återigen. En stocklösning bereddes innehållandes 500 mg (3,4 mM) Trisodiumcitrate x 2H2O, 500 µl (0,1 %) Nonident P 40, 261 mg (1,5 mM) Spermine tetetrachloride, 30,2 mg (0,5 mM) TRIS och 500 ml avjoniserat vatten, där reagenserna vägdes upp och blandades samt att pH justerades till 7,6. En 0,25 % trypsinlösning bereddes genom att späda 500 ml stocklösning med 1,25 g trypsin. Till respektive rör tillsattes 1,8 ml trypsinlösning och rören inkuberades i 37 °C på skak, Unimax 2010 (Heidolph Instruments, Schwabach, Tyskland), med inställningen 125 rpm i 41 ± 1 timmar.
4.3.2 Tissue Clear
Vid avparaffinering med TC gjordes avsteg från Schuttes metod för att erhålla ekvivalent resultat med xylen. Provrören avsedda för TC förvärmdes i en inkubator med temperaturen 58 °C i 15 minuter, vilket har utvärderats i en tidigare studie på laboratoriet (5). Dessutom tillsattes 5 ml TC istället för xylen. Fortsättningsvis utfördes avparaffinering enligt Schuttes metod, beskriven i föregående stycke.
4.4 Infärgning enligt Vindeløvs metod
Rören vortexades kraftigt i fem sekunder innan suspensionen aspirerades upp och ner 5-10 gånger i en spruta med en kanyl. Suspensionen filtrerades igenom ett 50 m nylonfilter ner i 5 ml FACS-rör (BD Biosciences, San Jose, USA). Rören centrifugerades med 700 x g i 10 minuter. Till FACS-rören tillsattes 250 µl lösning A, bestående av Trypsin in Spermine Tetrahydrochloride Detergent buffert. Rören inkuberades i 10 minuter i rumstemperatur och blandades genom att de rullades mellan handflatorna. Sedan tillsattes 200 µl av lösning B, bestående av RNAse A and Trypsin inhibitor in Spermine buffert, till rören och inkuberades i 10 minuter i rumstemperatur. Lösning C, bestående av Propidium Iodide (0,04%) in Spermine buffert, tinades upp och 200 µL tillsattes direkt till rören. Rören vortexades försiktigt och inkuberades mörkt i kyl (5 °C) i 15 minuter. Alla infärgningsreagenser kom från kitet BD Cycletest™ Plus DNA Reagent Kit (BD Biosciences).
4.5 Analys med flödescytometri
En daglig kvalitetskontroll av flödescytometern BD FACScantoTM (BD Bioscience) utfördes enligt rutin och dess optiska detektering av PI godkändes. Därefter vortexades provrören och sattes in i instrumentet för datainsamling i programmet BD FACSDiva version 8.0.1. För varje prov standardiserades den diploida populationstoppen G0/G1 i histogrammet till omkring kanal 50 genom manuell justering av PI-detektorspänningen och flödeshastigheten justerades till 100–500 events/sekund.
Datafilerna innehållande histogram tolkades i ModFit LT 5.0 (Verity Software House, Topsham, USA). En autoanalys för att bedöma utseendet på respektive histogram genomfördes och en lämplig mall, baserat på riktlinjer från Svensk Förening För Flödescytometri (21), valdes därefter ut beroende på om provet var diploid eller aneuploid. Ett prov som var diploid representerades av ett histogram med en cellcykel bestående av en hög topp i G0/G1-fasen. Ett prov som var aneuploid representerades av två cellcykler med två höga toppar, en diploid respektive en aneuploid topp i G0-/G1-fasen, se Figur 3. Utifrån programmet erhölls ploidistatus och ett värde på DI, % S-fas, % CV-diploid och % debris, se
6
definition i Tabell 1. Värdet på DI reflekterade ploidistatusen där DI 1,00 klassificerades till diploid och DI< eller >1,00 klassificerades till aneuploid (22).
Figur 3. Tolkning av histogram i ModFit LT 5.0 vid analys av DNA-ploidi. Antalet räknade cellkärnor (Number) presenteras på y-axeln och fluorescenskanal för detektering av PI (PI-A) på x-axeln. Histogram a) illustrerar diploiditet med en cellcykel och en hög röd topp i Go/G1-fasen vid kanal 50 och en lägre röd topp i G2/M-fasen vid kanal 100. Aneuploiditet illustreras i histogram b) med två cellcykler, där de diploida topparna återfinns i rött och aneuploida topparna i gult. Det streckade området representerar S-fasen.
Tabell 1. Definition av parametrar vars värden erhålls vid tolkning av histogram i ModFit 5.0 från analys av DNA-ploiditet (22).
Parameter Definition
% S-fas Representerar andelen analyserade cellkärnor som är i cellcykelns S-fas.
% CV-diploid Variationskoefficienten (CV) ger ett värde på spridningen av den diploida toppen Go/G1 i histogrammet. Ju lägre CV-diploid desto bättre kvalité på resultatet.
% Debris Andelen oidentifierat material som detektorn ej kan tolka, exempelvis sönderskurna kärnor och kvarvarande paraffin.
DI (DNA-index) DI fås när andelen DNA-innehåll i G0/G1-fasen i tumörcellerna divideras med andelen DNA i en diploid kontrollpopulation. DI reflekterar DNA-ploiditeten i en cellpopulation, d.v.s. diploid eller aneuploid.
4.6 Statistisk analys
De statistiska beräkningarna genomfördes i programmet IBM SPSS Statistics version 26 (IBM, New York, USA). Det inleddes med normalfördelningstestet Kolmogorov-Smirnov för att avgöra om värdena var normalfördelade, vilket val av lämpligt test baserades på. I alla analyser jämfördes xylen med TC som avparaffineringsmedel för respektive parameter. Endast hos de aneuploida proverna analyserades DI-aneuploid. Vid analys av samtliga prover valdes ett parametriskt oberoende t-test för parametrarna % CV-diploid, % debris och DI-aneuploid med signifikansnivån p≤0,05. Med avseende på % S-fas valdes ett icke-parametriskt oberoende t-test (Mann-Whitney U test) med samma signifikansnivå.
7
Vid undersökning av eventuell statistisk skillnad kopplad till provtyp genomfördes en separat analys av abrasio- respektive uterusresektat-prover med signifikansnivån p≤0,05. Med avseende på provtyp abrasio valdes ett parametriskt oberoende t-test för samtliga parametrar. För uterusresektat valdes samma test för samtliga parametrar, exklusive % debris där ett icke-parametriskt oberoende t-test (Mann-Whitney U test) valdes. Vid undersökning av eventuell statistisk skillnad inom gruppen med de aneuploida vävnadsproverna genomfördes ett parametriskt oberoende t-test för samtliga parametrar.
4.7 Etiska överväganden
Vävnadsmaterialen omfattades av biobankslagen vilket innebär att patienterna har gett sitt medgivande till att materialen kan användas till forskning och utbildning. I studien avidentifierades proverna och anonymiteten garanterades genom att provernas PAD-nummer kodades om i rapporten. Det innebär att proverna inte kan spåras tillbaka till patienten. Materialet skulle inte brukas för vidare vård och behandling. Dessutom har en etisk egengranskning vid Hälsohögskolan i Jönköping genomförts tillsammans med vetenskaplig handledare för att avgöra om det förelåg några etiska hinder. I den framkom det att studien inte bedömdes som en fara för individers hälsa, integritet och säkerhet, se bilaga 1.
5. Resultat
Patologen godkände alla kontrollsnitt vilket innebar att allt vävnadsmaterial som analyserats vid DNA-ploidi kunde inkluderas i resultatet. Totalt analyserades 20 prover, varav en fjärdedel var aneuploida. Enligt normalfördelningstestet var samtliga parametrar, exklusive % S-fas, normalfördelade. Vid jämförelse mellan avparaffinering med xylen versus TC i de oberoende t-testen påvisades ingen signifikant skillnad för samtliga parametrar (% S-fas, % CV-diploid, % debris och DI-aneuploid). Patientprov 7TC:r och 7X:r påvisade extremvärdena 19,01 respektive 20,23 % för parametern % S-fas och dess CV-värden var 2,64 respektive 2,63 %, se bilaga 2. De erhållna medelvärdena och standardavvikelserna för samtliga parametrar, exklusive % S-fas, återfinns i Tabell 2. Medianen och kvartilavståndet för parametern % S-fas återfinns i Tabell 3.
Vid jämförelse av avparaffineringsmedel kopplad till provtyp abrasio observerades ingen signifikant skillnad för samtliga parametrar (% S-fas, % CV-diploid, % debris och DI-aneuploid). Alla var normalfördelade och utav tolv abrasio var fyra prover aneuploida. Likaså påvisades ingen signifikant skillnad med avseende på uterusresektat för parametrarna % S-fas, % CV-diploid och % debris. Signifikant skillnad för parametern DI-aneuploid erhölls inte till följd av att endast ett av åtta uterusresektat var aneuploid. Dessutom var alla parametrar förutom % debris normalfördelade. De erhållna medelvärdena och standardavvikelserna för de normalfördelade parametrarna beträffande respektive provtyp anges i Tabell 2. Dessutom återfinns medianen och kvartilavståndet för parametern % debris beträffande provtyp uterusresektat i Tabell 3.
Det observerades ingen signifikant skillnad mellan xylen och TC för samtliga parametrar (% S-fas, % CV-diploid, % debris och DI-aneuploid) vid jämförelse inom gruppen med de fem aneuploida vävnadsproverna. Alla var normalfördelade och de erhållna medelvärdena och standardavvikelserna anges i Tabell 2.
8
Tabell 2. Medelvärde och standardavvikelse (m ± st.avvikelse) för respektive normalfördelad parameter vid statistisk jämförelse mellan avparaffinering med xylen respektive Tissue Clear beträffande samtliga prover (n=20), provtyp abrasio (n=12), provtyp uterusresektat (n=8) och aneuploid vävnad (n=5). Skillnaden i medelvärde mellan xylen och Tissue Clear anges i procentenheter för samtliga parametrar, exklusive DI-aneuploid där värdet anges i indexenheter. Inga värden erhålls vid icke-normalfördelning (Icke-nf).
Parameter % S-fas % CV-diploid % debris DI-aneuploid
Samtliga prover
Xylen Icke-nf 3,74 ± 0,88 26,97 ± 3,63 1,57 ± 0,30
Tissue Clear Icke-nf 3,73 ± 0,92 27,73 ± 3,79 1,56 ±0,30
Skillnad i medelvärde Icke-nf 0,01 -0,76 0,01
Abrasio Xylen 6,70 ± 3,58 3,54 ± 0,89 26,60 ± 2,81 1,69 ± 0,17* Tissue Clear 6,44 ± 3,23 3,47 ± 0,77 27,28 ± 3,56 1,68 ± 0,18* Skillnad i medelvärde 0,26 0,07 -0,68 0,01 Uterusresektat Xylen 8,99 ± 6,11 4,04 ± 0,85 Icke-nf 1,09**
Tissue Clear 8,26 ± 6,34 4,11 ± 1,04 Icke-nf 1,10**
Skillnad i medelvärde 0,73 -0,07 Icke-nf -0,01
Aneuploid vävnad
Xylen 9,09 ± 4,23 3,20 ± 0,95 26,81 ± 2,81 1,57 ± 0,30
Tissue Clear 7,45 ± 4,97 2,98 ± 0,30 28,40 ± 2,18 1,56 ± 0,30
Skillnad i medelvärde 1,64 0,22 -1,59 0,01
* Innefattar endast fyra av tolv abrasio-prover
** Innefattar endast ett prov vilket ej genererar standardavvikelse
Tabell 3. Median och kvartilavstånd (med, kvartilavstånd) för den icke-normalfördelade parametern % S-fas beträffande samtliga prover (n=20) och % debris beträffande provtyp uterusresektat (n=8) vid statistisk jämförelse mellan avparaffinering med xylen respektive Tissue Clear. Skillnaden i median mellan xylen och Tissue Clear anges i procentenheter. Inga värden erhålls vid normalfördelning (Nf).
Parameter % S-fas % debris
Samtliga prover Xylen 5,68, 4,25–10,52 Nf Tissue Clear 5,95, 3,49–9,39 Nf Skillnad i median -0,27 Nf Uterusresektat Xylen Nf 28,56, 25,08–31,64 Tissue Clear Nf 28,87, 21,48–30,89 Skillnad i median Nf -0,31
9
6. Diskussion
Syftet var att undersöka om Tissue Clear kunde ersätta xylen som avparaffineringsmedel av endometrioid carcinom vid analys av DNA-ploiditet. Studien genomfördes med anledning av att förbättra arbetsmiljön på laboratoriemedicin på länssjukhuset Ryhov i Jönköping, där xylen används i rutindiagnostiken. Detta genom att begränsa exponeringen för xylen på grund av dess toxiska egenskaper. Förutom statistiska analyser på samtliga prover undersöktes eventuella skillnader inom provtyperna abrasio respektive uterusresektat samt mellan DI-värdena för de aneuploida proverna. I resultatet observerades ingen signifikant skillnad mellan avparaffinering med xylen respektive TC med avseende på alla analyserade parametrar. Detta indikerar på att ett likvärdigt resultat med xylen erhålls med TC.
6.1 Resultatdiskussion
DNA-ploidi är en välutvecklad metod som är utprovad för xylen och har sedan 1984 varit det dominerande avparaffineringsmedlet. Med åren har dock flertalet substitut tillverkats, bland annat de isoparaffinska kolväteföreningarna TC och UltraClearTM, för att undvika xylens hälsofarliga effekter.
Inom histopatologi finns flera studier som utvärderar ett utbyte av xylen vid klarning och avparaffinering av vävnadsmaterial som är avsedda att placeras på glas och färgas in. Klarning med UltraClearTM har exempelvis konstaterats vara lika effektivt som xylen (14, 17). Däremot finns inga
vetenskapligt publicerade studier på ett utbyte av xylen i samband med ploidi. Eftersom DNA-ploidi är en metod utprövad för xylen måste ett likvärdigt resultat efter avparaffineringen med TC erhållas för att kunna ersätta xylen. Det innebär att ingen signifikant skillnad mellan värdena på respektive parameter ska erhållas. Resultatet indikerade på att både % CV-diploid och % S-fas, som laboratoriet svarar ut till kund, är tillförlitligt med TC som avparaffineringsmedel. Vid statistisk analys av samtliga prover erhölls ingen signifikant skillnad på parametrarna. Medelvärdet för % CV-diploid skiljer sig med 0,01 procentenheter och medianen för % S-fas med 0,27 procentenheter mellan TC och xylen, vilket är mycket små skillnader. Liknande resultat ses även gällande statistisk analys av de olika provtyperna som analyserades: abrasio och uterusresektat, se Tabell 2 och 3.
På patientprov 7 erhölls extremvärden på % S-fas. Att dessa värden var höga i jämförelse med medianen för samtliga patientprover, se Tabell 3, innebär att patientprovet innehöll många cellkärnor som genomgick DNA-replikation (22), vilket kan bero på en individuell biologisk variation. Även CV-värdena, som är baserade på alla detekterade diploida cellkärnor i proverna, överensstämmer och bekräftar att de erhållna extremvärdena på % S-fas beror den individuella variationen (23). Syftet med studien var att undersöka eventuella skillnader mellan TC och xylen och därmed jämfördes medelvärdena eller medianen mellan de två grupperna. Att extremvärden erhölls har en påverkan, men den är lika stor i båda grupperna vilket medför att värdena på % S-fas för patientprov 7 var acceptabla. I rutindiagnostik svaras inte % debris ut till kund, dock utvärderades värdet i denna studie. Det ansågs relevant eftersom debris delvis beror på hur pass effektiv avparaffineringen är, men även mängden sönderskurna kärnor (24). Det blir därmed en viktig faktor att utvärdera om skillnader förekommer mellan TC och xylen. Ingen signifikant skillnad i % debris kunde observeras men vid jämförelse är det procentuellt högre debris för TC, 0,76 procentenheter vid analys av samtliga prover och 0,68 respektive 0,31 procentenheter för abrasio respektive uterusresektat, se Tabell 2 och 3. Att beakta är dock att en större variation hos denna parameter kan framgå, gentemot de andra, eftersom det inte är möjligt att förutse hur många cellkärnor som blir sönderskurna vid snittning. Skillnaden i debris översteg sammantaget inte 0,76 procentenheter och att värdena på % debris blev så pass lika är en utav de faktorer som indikerar på att TC är ett fungerande substitut till xylen som avparaffineringsmedel. De diploida proverna erhåller alltid ett konstant DI-värde på 1,00 och det blir därmed irrelevant att göra en statistisk jämförelse mellan de diploida DI-värdena. För de aneuploida proverna kan värdet variera eftersom DI antar värden som är < eller >1,00 (22). Det blir således intressant att undersöka om skillnader i detta värde framgår mellan avparaffinering med TC respektive xylen. Ingen signifikant skillnad kunde dock ses mellan de aneuploida provernas DI-värden. Medelvärdet för DI-aneuploid skiljer sig endast med 0,01 procentenheter oberoende om jämförelse gjordes mellan samtliga prover eller inom provtyperna, se Tabell 2. Eftersom DNA-ploidi påvisar både diploid och aneuploid endometrievävnad krävs ett ekvivalent resultat på båda typerna för att kunna ersätta xylen med TC. I den tidigare studien som genomfördes på laboratoriemedicin på Ryhov i Jönköping erhölls ett ekvivalent resultat mellan TC och xylen på diploid men inte aneuploid vävnad (5). Det blir därmed
10
relevant att i denna studie undersöka förekomst av eventuell skillnad inom gruppen med aneuploida prover med anledning av att båda studierna använder samma metod. Resultatet påvisade ingen signifikant skillnad, vilket indikerar att avparaffinering med TC även fungerar på aneuploida proverna.
6.2 Metoddiskussion
De paraffininbäddade snitten avsedda för avparaffinering med TC förvärmdes i 58 °C i 15 minuter innan avparaffinering för att erhålla ett ekvivalent resultat med xylen. Detta är ett avsteg från Schuttes metod (1) som en tidigare studie vid laboratoriet utvärderat. I studien jämfördes avparaffinering med TC med eller utan förvärmning och resultatet indikerade att om snittet förvärmdes genererades ett analysresultat som var ekvivalent med avparaffinering med xylen (5). Att använda TC som avparaffineringsmedel medför därmed ett ytterligare moment i provprepareringen, i en metod som redan har många och tidskrävande moment. Däremot är detta inget moment som kräver mer tid än att inkubera proverna i värmeskåp och under de 15 minuterna kan tid ägnas åt annat arbete. Dessutom är TC att föredra beträffande dess betydligt mindre toxiska egenskaper jämfört med xylen och därför är förvärmningen i sammanhanget en mindre företeelse. Inandning av xylens ånga kan ge huvudvärk, yrsel och andningsbesvär men även bestående skador på hörselorganen (3), vilket försämrar arbetsmiljön i jämförelse med TC. För övrigt är det ingen skillnad i metoden om TC används som avparaffineringsmedel istället för xylen, vilket skulle göra ett utbyte enkelt att applicera i rutinverksamheten.
Vid analys av DNA-ploidi fås ett procentuellt värde på debris, vilket beskriver andelen oidentifierat material i patientprovet som passerar detektorn. Detta uppkommer när flödescytometern inte kan tolka söndersnittade cellkärnor och benämner det därmed som debris. Det kan också uppstå om en större mängd paraffin medföljer snittet, vilket kan ske vid snittningen eller på grund av otillräcklig avparaffinering. Att få ett lågt debris-värde är önskvärt och för att optimera detta vidtogs flera åtgärder. Bland annat snittades tjocka snitt på 50 µm för att öka chanserna till att en större andel hela cellkärnor erhölls gentemot mängden sönderskurna cellkärnor. Dessutom ristades omkringliggande paraffin bort innan snittning med anledning av att erhålla minimalt med paraffin tillsammans med snittet (24). Lika mycket paraffin avlägsnades för snitten oavsett om de avparaffinerades med xylen eller TC eftersom de erhölls från samma ristade område på den paraffininbäddade vävnadsklossen. Det är dock inte möjligt att förutse hur många sönderskurna cellkärnor respektive snitt har och därför förekommer det en oförutsägbar variation av sönderskurna kärnor mellan avparaffineringsmedlen. Bortsett från denna variation anses eventuell skillnad i debris mellan avparaffineringsmedlen som otillräcklig avparaffinering eftersom de nämnda åtgärderna vidtogs oavsett om materialet skulle avparaffineras med xylen eller TC. Således kunde det procentuella värdet på debris användas, om signifikant skillnad hade förekommit, för att dra en slutsats om vilket medel som var mest effektivt.
I rutindiagnostik utförs DNA-ploidi på abrasio, vilket är en prognostisk analys eftersom aneuploiditet förknippas med sämre prognos. Resektat är ett mer invasivt ingrepp för patienten än abrasio men det förekommer att enstaka resektat också analyseras i rutin. I denna studie förekommer båda provtyperna och en jämförelse mellan xylen och TC kopplad till provtyp ansågs relevant för att kunna tillämpa resultatet i rutindiagnostiken. Dels på grund av att båda provtyperna förekommer dels med anledning av att det oftast är sparsamt med material i abrasio jämfört med resektat. Resektat innehåller oftast en större mängd cellkärnor eftersom den består av solid vävnad. En större mängd är önskvärt eftersom det är en viktig faktor att det finns tillräckligt med cellkärnor som flödescytometern kan detektera för att kunna svara ut ett pålitligt provsvar till kund (Personlig kommunikation S Svensson 2020-05-06) (2). Att därmed endast använda abrasio i studien skulle inte varit representativt ifall ett lågt antal kärnor detekteras, trots faktumet att det generellt förekommer fler abrasio-prover i rutindiagnostik. Det var därför viktigt att undersöka om det förekom signifikant skillnad kopplad till provtyp ifall skillnad förekom hos den ena men inte den andra provtypen. I resultatet observerades ingen signifikant skillnad kopplad till provtyp.
En begränsning med denna studie är att resultatet som erhölls inte jämfördes med tidigare analysresultat på patientproverna för att avgöra om resultaten överensstämmer, vilket hade medfört högre validitet på resultatet. Anledningen till att detta inte genomfördes berodde på att några patientprover erhöll lågt antal detekterade cellkärnor i jämförelse med tidigare analys på proverna. Det här är begripligt eftersom tumörområdet i paraffinklossen inte är homogent fördelat. Snitt som analyserades i denna studie representerade tumörområdet i slutet av respektive paraffinkloss där det finns mindre material i jämförelse med snitt som tagits i början av respektive paraffinkloss till tidigare
11
analys. Därmed förekom det mindre tumörmaterial i denna studie vilket inte hade ingivit en rättvis bedömning vid jämförelse med tidigare resultat. Som tidigare nämnt är det en viktig faktor att tillräckligt med cellkärnor detekteras för att ett pålitligt resultat ska erhållas. I många fall var det dock inte möjligt på grund av nämnd orsak, särskilt med avseende på abrasio som redan innehåller sparsamt med material. Det som blev viktigt i studien var därmed att antalet celler stämde överens mellan analys av prov avparaffinerat med xylen respektive TC, vilket det gjorde i samtliga fall.
En studie på 20 patientprover kan anses vara en liten kvantitet, men i sammanhanget är det ett stort antal prover eftersom laboratoriemedicin på Ryhov i Jönköping utför cirka 60 DNA-ploidi-analyser/år. Att det är en analys som utförs sällan medför att det finns begränsat med material att tillgå för att genomföra studien. Dessutom begränsades antalet prover ytterligare till följd av att prover som tidigare haft svårtolkade histogram och prover med för lite material för att kunna generera tillräckligt många snitt som studien krävde exkluderades. Trots detta hade en större mängd prover genererat högre trovärdighet i resultatet, men eftersom studien utfördes under en bestämd tidsplan med begränsad tid hade analys av fler prover ur ett tidsmässigt perspektiv inte varit genomförbart. Antalet aneuploida prover utgjorde endast 25 % av det totala antalet prover i studien. Med tanke på att den tidigare studien på laboratoriet erhöll en signifikant skillnad på aneuploid vävnad (n=2) borde denna studie omfattat fler aneuploida prover. Detta med anledning av att erhålla högre trovärdighet i resultatet av de aneuploida proverna. Dock har antalet aneuploida prover ökat i kvantitet gentemot den tidigare studien (5). Att en patient uppvisar aneuploiditet är enligt Simonetti et al. (25) mycket ovanligt oavsett vävnadstyp och att finna prover från en patient med endometrioid carcinom som uppvisar aneuploiditet är därför mycket svårt. Enligt metodansvarig (Personlig kommunikation A Nilsson Bowers 2020-04-28) är endast 10-20 % av de cirka 60 analyser som utförs per år på laboratoriemedicin på Ryhov i Jönköping aneuploida. Därmed fanns det svårigheter att finna aneuploid vävnad i biobanken eftersom det var få samt att de flesta av dessa prover tidigare uppvisat svårtolkade histogram, vilket var ett av studiens exklusionskriterier. Trots detta erhölls fem patientprover som tidigare diagnostiserats som aneuploida. Detta antal ansåg diagnostiserande patolog och metodansvarig (Personlig kommunikation N Vytrya och A Nilsson Bowers 2020-04-20) vara tillräckligt eftersom aneuploid vävnad är ovanligt i rutindiagnostiken.
6.3 Vidare forskning
Denna studie kan göra det möjligt att implementera avparaffinering med TC på laboratoriemedicin på Ryhov i Jönköping, med anledning av att ingen signifikant skillnad mellan TC och xylen erhölls. För laboratoriemedicin på Ryhov innebär detta att ett utbyte kan utvärderas genom att en successiv övergång till TC kan påbörjas. Detta genom att respektive prov analyseras med båda avparaffineringsmedlen under en längre tidsperiod, vilket medför att en större provmängd analyseras samtidigt som patientsäkerheten garanteras innan eventuell implementering genomförs. Om ingen signifikant skillnad mellan xylen och TC kvarstår ligger därmed en utökad provmängd till grund för utbytet. Enligt metodansvarig och diagnostiserande patolog var antalet prover tillräckligt för laboratoriet på Ryhov, men för att kunna applicera resultatet inom andra laboratorieverksamheter kan ett större underlag med liknande studier krävas. Detta för att öka tillförlitligheten med användandet av TC istället för xylen.
Studien har endast genomförts på endometriecancerceller men DNA-ploidi kan även användas på andra typer av vävnadsceller (22). Exempelvis på paraffininbäddade prostatacancerceller där analysen kan användas som underlag vid prognostisering av prostatacancer (26). Studien kan därmed inte garantera att resultatet kan appliceras på annan vävnad, men den kan användas som underlag till att undersöka om en ny metod med TC kan upprättas. Om fortsatta studier på fler vävnadstyper med en större provmängd genomförs kan det medföra att ett utbyte av xylen till TC även kan appliceras på analys av DNA-ploiditet hos andra vävnadstyper.
Xylen används inte bara som avparaffineringsmedel, utan kan också användas som klarningsreagens inom histopatologi. Ett utbyte kan dessutom vara aktuellt i detta sammanhang eftersom personal utsätts för xylenets hälsofarliga risker även här. Inom detta område finns det studier som utvärderat ett utbyte till andra isoparaffinska kolväten, bland annat UltraClearTM (14, 17), men inte med avseende på TC.
Eftersom tillverkaren hävdar att TC är ett xylensubstitut (19) borde det kunna implementeras inom detta område också. Denna studie erhöll ingen signifikant skillnad på avparaffinering mellan TC och xylen vilket innebär att ett utbyte som klarningsreagens kan vara möjlig. Studien kan användas som underlag
12
vid vidare forskning på TC som klarningsreagens men eftersom TC utvärderades som avparaffineringsmedel i denna studie krävs det att vidare forskning på användning av TC vid klarning genomförs.
7. Slutsatser
Resultatet i studien tyder på att Tissue Clear är ekvivalent med xylen vid avparaffinering av endometrioid carcinom, såväl på diploid som på aneuploid vävnad. Detta isoparaffinska kolväte har få och milda toxiska egenskaper och är dessutom okomplicerad att handskas med. Därmed kan xylen med sina hälsofarliga nackdelar fördelaktigt ersättas vid flödescytometrisk analys av DNA-ploiditet. Vid användning av Tissue Clear som avparaffineringsmedel kan ett tillförlitligt resultat erhållas samtidigt som det blir en bättre arbetsmiljö på laboratoriet.
8. Omnämnanden
Vi vill rikta ett stort tack till vår metodhandledare Anette Nilsson Bowers för hennes behjälplighet vid det praktiska arbetet och stora engagemang att driva denna studie framåt. Vi tackar ävenNataliya Vytrva för att hon snabbt kunde bedöma kontrollsnitten och Hanna Andersson för stöttning vid snittningen. Vi vill dessutom tacka vår vetenskapliga handledare Emma Carlsson för hennes betydelsefulla hjälp i vårt vetenskapliga skrivande. Tack till er alla som med er expertis hjälpt oss göra denna studie både möjlig och intressant. Ni har varit väl tillmötesgående och hjälpsamma. Tack!
13
9. Referenser
1. Schutte B, Reynders MM, Bosman FT, Blijham GH. Flow cytometric determination of DNA ploidy level in nuclei isolated from paraffin-embedded tissue. Cytometry. 1985;6(1):26-30.
2. Mauland KK, Wik E, Salvesen HB. Clinical value of DNA content assessment in endometrial cancer. Cytometry Part B, Clinical Cytometry. 2014;86(3):154-63.
3. Histolab Products AB. Säkerhetsdatablad Xylen Sverige: Histolab Products AB 2015 [cited 2020 03-03].
Available from:
http://histolab.e-line.nu/sv/nya_e-line/Kemikalier/Dehydrering_Clearing/Xylen_1_L?id=02070.
4. Sakura Finetek Europe B.V. Safety data sheet Tissue-Tek Tissue Clear Netherlands: Sakura Finetek Europe B.V; 2016 [cited 2020 03-03]. Available from: https://www.sakura.eu/customer-support/Safety-Data-Sheets.
5. Ahlgren H, Genberg M. Avparaffinering med Xylen versus Tissue-clear för vävnadsmaterial vid flödescytometrisk analys av DNA ploidi. [Examensarbete]. In press 2017.
6. Morice P, Leary A, Creutzberg C, Abu-Rustum N, Darai E. Endometrial cancer. Lancet. 2016;387(10023):1094-108.
7. Rubin E, Reisner HM. Essentials of Rubin's pathology. 6th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2014.
8. Buckingham L. Molecular diagnostics : fundamentals, methods, and clinical applications. 3rd ed. Philadelphia: F.A. Davis Company; 2019.
9. Tachibana K-EK, Gonzalez MA, Coleman N. Cell-cycle-dependent regulation of DNA replication and its relevance to cancer pathology. The Journal Of Pathology. 2005;205(2):123-9.
10. Regionala cancercentrum i samverkan. Nationellt vårdprogram Endometriecancer Version 1.3 Sverige: Regionala cancercentrum i samverkan; 2020 [cited 2020 03-04]. Available from: https://www.cancercentrum.se/globalassets/cancerdiagnoser/gynekologi/livmoderkroppscancer/vardp rogram/nationellt-vardprogram-endometriecancer.pdf.
11. Jahan-Tigh RR, Ryan C, Obermoser G, Schwarzenberger K. Flow cytometry. J Invest Dermatol. 2012;132(10):1-6.
12. Vindeløv LL, Christensen IJ, Nissen NI. A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 1983;3(5):323-7.
13. Nunez R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Current issues in molecular biology. 2001;3(3):67-70.
14. Kunhua W, Chuming F, Tao L, Yanmei Y, Xin Y, Xiaoming Z, et al. A novel non-toxic xylene substitute (SBO) for histology. Afr J Tradit Complement Altern Med. 2012;9(1):43-9.
15. Histolab Products AB. Xylen 1 L Sverige: HistoLab; 2020 [cited 2020 03-03]. Available from: http://histolab.e-line.nu/en/nya_e-line/Chemicals/Dehydrering_Clearing/Xylen_1_L?id=02070.
16. Aydin I, Yorukoglu K, Cingoz S, Agilkaya S. The effect of the alternative solutions to formaldehyde and xylene on tissue processing. Indian J Pathol Microbiol. 2013;56(3):221-30.
17. Alwahaibi N, Aljaradi S, Alazri H. Alternative to xylene as a clearing agent in histopathology. J Lab Physicians. 2018;10(2):189-93.
18. Mullin LS, Ader AW, Daughtrey WC, Frost DZ, Greenwood MR. Toxicology update isoparaffinic hydrocarbons: a summary of physical properties, toxicity studies and human exposure data. Journal of applied toxicology : JAT. 1990;10(2):135-42.
19. Sakura Finetek Europe B.V. Tissue-Tek® Tissue Clear® Xylene Substitute Netherlands: Sakura Finetek
Europe B.V,; 2020 [cited 2020 03-03]. Available from:
https://www.sakura.eu/Solutions/Processing/Tissue-Clear-Xylene-Substitute.
20. Alwahaibi NY, Aldughaishi SH. A substitute to xylene in deparaffinization and clearing prior to coverslipping in histopathology. Journal of laboratory physicians. 2019;11(2):118-22.
21. Svensk Förening för Flödescytometri. Guidelines från Svensk Förening för Flödescytometri Sverige: Svensk Förening för Flödescytometri,; 2010 [cited 2020 04-28]. Available from: http://www.sfff.se. 22. Ormerod MG TB, Giarretti W. DNA Consensus in Flow Cytometry. Analytical Cellular Pathology. 1998;17:103-10.
23. Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E. Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin. 9, editor. Lund: Studentlitteratur; 2012.
24. Darzynkiewicz Z. Critical aspects in analysis of cellular DNA content. Current protocols in cytometry. 2011;Chapter 7:Unit 7.2.
25. Simonetti G, Bruno S, Padella A, Tenti E, Martinelli G. Aneuploidy: Cancer strength or vulnerability? International journal of cancer. 2019;144(1):8-25.
14
26. Shankey TV, Jin JK, Dougherty S, Flanigan RC, Graham S, Pyle JM. DNA ploidy and proliferation heterogeneity in human prostate cancers. Cytometry. 1995;21(1):30-9.
15
10. Bilagor
Bilaga 1
19 Bilaga 2
Insamlad data från analys av provmaterial
Tabell 4. Insamlad data från flödescytometrisk DNA-ploidi av endometrioid carcinom (n=20) avparaffinerad med xylen (X) respektive Tissue Clear (TC). Vävnadsmaterialet bestod av abrasio (a, n=12) samt uterusresektat (r, n=8) och parametrarna % S-fas, % CV-diploid och % debris erhölls.
Providentitet % S-fas % CV-diploid % debris
Xylen
1X:a
5,70 2,34 29,712X:r
15,46 4,10 21,483X:a
6,32 3,55 23,854X:a
2,93 3,33 31,235X:r
10,52 4,89 30,896X:a
5,62 4,44 25,037X:r
20,23 2,64 19,598X:a
3,66 4,96 27,959X:r
2,82 3,72 28,7310X:r
8,24 5,01 33,5411X:a
3,26 3,37 27,8012X:r
3,97 4,80 26,8713X:a
4,65 3,95 24,4714X:r
5,65 3,92 30,6915X:r
5,01 3,21 28,3816X:a
4,25 2,57 25,4117X:a
7,91 3,78 23,5218X:a
10,57 2,60 27,9619X:a
11,80 4,84 22,6320X:a
13,80 2,76 29,69 Tissue Clear 1TC:a 5,95 2,38 31,73 2TC:r 15,39 3,92 25,08 3TC:r 5,94 3,74 22,79 4TC:a 3,44 3,15 28,09 5TC:r 11,22 4,29 33,46 6TC:a 7,02 4,38 32,29 7TC:r 19,01 2,63 19,89 8TC:a 3,49 4,92 27,72 9TC:r 3,02 3,88 31,12 10TC:r 6,98 5,90 28,93 11TC:a 2,71 3,28 25,87 12TC:r 3,61 5,15 28,80 13TC:a 4,99 4,31 24,06 14TC:r 5,50 3,99 31,64 15TC:r 1,35 3,12 28,43 16TC:a 3,31 2,76 26,03 17TC:a 7,84 3,71 21,17 18TC:a 9,39 2,62 28,64 19TC:a 9,87 3,39 27,10 20TC:a 13,36 3,02 31,8220
Tabell 5. Insamlad data på DI-aneuploid för de aneuploida proverna (n=5) bestående av endometrioid carcinom som avparaffinerades med xylen (X) respektive Tissue Clear (TC). Vävnadsmaterialet bestod av abrasio (a, n=12) samt uterusresektat (r, n=8).
Providentitet DI-aneuploid Xylen 15X:r 1,09 16X:a 1,81 18X:a 1,60 19X:a 1,49 20X:a 1,84 Tissue Clear 15TC:r 1,10 16TC:a 1,81 18TC:a 1,60 19TC:a 1,47 20TC:a 1,84
