Validering av Dako Omnis Ready-to-Use-antikroppar vid rutinfärgning av Mismatch repair generna MLH1, MSH2, MSH6 och PMS2 vid immunohistokemisk cancerdiagnostik

Validering av Dako Omnis

Ready-to-Use-antikroppar vid rutinfärgning av Mismatch repair

generna MLH1, MSH2, MSH6 och PMS2 vid

immunohistokemisk cancerdiagnostik

Validation of Dako Omnis Ready-to-Use

antibodies in routine staining of the Mismatch

repair genes MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 in

immunohistochemical cancer diagnosis

Författare: Sofia Källhagen

Vårterminen 2021

Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap

Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng

Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet.

Handledare: Christina Karlsson, Universitetslektor, Örebro Universitet Fredrika Gustafsson, legitimerad Biomedicinsk analytiker, Universitetssjukhuset Örebro

Anna-Lena Ohlson, Legitimerad Biomedicinsk analytiker, Universitetssjukhuset Örebro

ABSTRACT

Vid cancerdiagnostisering av Lynch syndrom används immunohistokemisk färgning för undersökning av eventuell defekt hos mismatch repair-generna MLH1, MSH2, MSH6 och PMS2. Färgningen använder sig av antikroppar som undersöker om cellkärnor i vävnad har intakta eller förlorade proteinuttryck hos respektive gen. Syftet med studien var att utföra en antikroppsvalidering för att granska om de nuvarande Dako Link Ready-to-Use-antikropparna (Link RTU) och koncentrerade antikroppen Dako PMS2 1:40 kunde bytas ut till Dako Omnis Ready-to-Use-antikroppar (Omnis RTU). Omnis RTU-antikropparna är optimerade för det automatiserade analysinstrumentet Dako Omnis som används vid patologavdelning på Universitetssjukhuset Örebro. Tolv vävnader med colorektalcancer och två externa positiva kontroller färgades med samtliga antikroppar för respektive gen och en jämförelse mellan Link RTU samt Dako PMS2 1:40 gjordes mot Omnis RTU-antikropparna. De nya

färgningarna med Omnis RTU bedömdes som sämre, likvärdig eller bättre infärgad. Om antikroppen färgade rätt målceller och med stark färgintensitet bedömdes den och

motsvarande protokoll som godkänd. Resultatet visade att Omnis RTU för MLH1 gav en förbättrad färgning. Omnis RTU för MSH2 gav i majoritet en förbättrad färgning med något mer bakgrundsfärg än önskvärt. Omnis RTU för MSH6 gav en svagare infärgning i

majoriteten av fallen och Omnis RTU för PMS2 gav i majoritet en förbättrad färgning, men med för mycket bakgrundsfärg. Slutsatsen var att Omnis RTU för MSH6 och PMS2 kräver vidare optimering av protokoll innan de används i laboratoriets rutinfärgning. Protokollet för Omnis RTU för MSH2 kan behöva en mindre justering för minskad bakgrundsfärg och Omnis RTU för MLH1 fungerar väl med det nuvarande protokollet.

ABSTRACT

Immunohistochemistry staining is used in diagnostics of Lynch Syndrome to investigate possible defects in the mismatch repair genes MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2. Antibodies is used to examine whether cell nuclei in cancer tissue have intact or loss of protein expression in said genes. The aim of the study was to perform an antibody validation to examine if the current Dako Link Ready-to-Use antibodies (Link RTU) and the concentrated PMS2 antibody can be replaced with Dako Omnis Ready-to-Use antibodies (Omnis RTU) that are optimized for the analytical instrument Dako Omnis, which is used in Universitetssjukhuset Örebro. Twelve tissues with colorectal cancer and two external positive controls was stained with all antibodies for each gene. A comparison was done between the old antibodies and Omnis RTU, where Omnis RTU was judged to be worse, equivalent or better. The antibody and used protocol were approved of laboratory use if it stained the target cells with a strong intensity. The results showed that Omnis RTU MLH1 had an improved staining. Omnis RTU MSH2 had in majority an improved staining, but with slightly more background staining than preferred. Omnis RTU MSH6 had in majority a weak staining while Omnis RTU PMS2 had an improved staining but with too much background staining. The conclusion was that the protocols for Omnis RTU MSH6 and PMS2 needed further optimization before laboratory use. The protocol for Omnis RTU MSH2 may need a minor adjustment to reduce background staining, while Omnis RTU MLH1 works well with the current protocol.

Keywords: Lynch syndrome, colorectal cancer, mismatch repair, immunohistochemistry, antibody.

FÖRKORTNINGSLISTA

AR – Antigen retrieval CRC – Colorektalcancer DAB - 3,3′-Diaminobenzidine

FFPE – Formalinfixerade paraffininbäddade vävnader IHC – Immunohistokemi LS – Lynch Syndrom MMR – Mismatch repair MSI -Mikrosatellitinstabilitet MSS – Mikrosatellitstabilitet MLH – MutL homolog MSH -MutS homolog

PMS – Postmeotic Segregation Increased RTU – Ready-to-Use antikroppar

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

3. MATERIAL OCH METOD ... 10

3.1 Datainsamling och förbehandling av vävnadspreparat ... 10

3.2 Testmetod - Immunohistokemi ... 10 3.3 Kontroller ... 11 3.4 Utvärdering av infärgning ... 12 3.5 Etiskt övervägande ... 12 4. RESULTAT ... 13 4.1 MLH1 ... 13 4.2 MSH2 ... 13 4.3 MSH6 ... 14 4.4 PMS2 ... 15 5. DISKUSSION ... 17 5.1 Tolkning av resultat ... 17

5.2 Styrkor och svagheter ... 18

5.3 Klinisk relevans ... 19

6. SLUTSATS... 20

7. TACK ... 21

8. REFERENSER ... 22

1. INTRODUKTION

1.1 Colorektalcancer

Colorektal cancer (CRC) är den tredje vanligaste cancerformen i Sverige, där ungefär 5000 individer årligen diagnostiseras med sjukdomen. Livstidsrisken att drabbas av CRC är 5% och trots insatt behandling efter diagnos avlider nästan 50% i sjukdomen. 80% av de

diagnostiserade CRC-fallen uppstår av sporadiska mutationer och ses vanligtvis hos patienter över 65 år. Minst 10 % av de diagnostiserade CRC anses orsakas av genetiska faktorer. Orsaken bakom de ärftliga fallen av CRC är för det mesta okänd, men ca 2 – 4 % anses bero på Lynch syndrom (LS) (1).

1.2 Lynch syndrom

Lynch syndrom, tidigare Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer, är ett hereditärt autosomal dominant cancersyndrom som är associerad med en kraftigt ökad livstidsrisk för utveckling av cancer med en tidigare cancerdebut än normalpopulationen. Ca 1/1000 – 1/2000 individer beräknas drabbas av sjukdomen. På grund av dess hereditära karaktär har individer med LS 50% risk att föra vidare sjukdomsanlagen till sina barn med en sjukdomspenetrans runt 80 – 90%. LS är en av de vanligaste ärftliga multitumörsyndromen, där anlagsbärare beräknas ha en livstidsrisk för att insjukna i CRC mellan 54 – 74 % hos män och 30 – 52 % hos kvinnor. LS ger även en ökad risk för flertalet maligniteter, hos kvinnor ses främst en förhöjd livstidsrisk för insjuknande av ovarial- och endometriecancer (40 – 60%) där LS står för ca 1 – 5% av de totala endometriecancerfallen. Syndromet ger även en ökad risk för tunntarms-, urinvägs-, ventrikel- och gallblåsecancer (1, 2, 3).

LS orsakas av mutationer i eller i nära anslutning till generna som kodar för DNA-reparationssystemet Mismatch repair (MMR). De vanligaste generna som orsakar

cancersyndromet är generna MutL Homolog 1 (MLH1), MutS Homolog 2 (MSH2), MutS Homolog 6 (MSH6) och Postmeiotic Segregation Increased 2 (PMS2). Individer med MLH1-mutation tros löpa en större risk att insjukna i CRC jämfört med MSH2- och

MSH6-mutationsbärare. Generellt tenderar MSH6-mutationsbärare ha en senare debut av LS-associerade tumörer, undantag endometriecancer, jämfört med bärare av MLH1- och MSH2-mutationer. PMS2-mutation tros vara förenat med en lägre risk för CRC samt ett senare insjuknande jämfört med de andra mutationerna (2).

1.3 Mismatch repair-systemet

MMR-systemet är ett DNA-reparationssystem som vid replikationen av DNA upptäcker och reparerar felaktiga insertioner, deletioner och basparningar – så kallade

basparsmissförhållanden – hos den nyligen syntetiserade strängen. En del av DNA-polymerasets funktion är att korrekturläsa den syntetiserad strängen, men ibland kan en felaktig korrekturläsning ske så att vissa felaktigheter kvarstår efter syntetiseringen. Det kan även uppstå insertion-deletion-loopar eller nicks i den ena eller i båda strängarna som interfererar med replikationen. Missförhållandet kan medföra en förvrängning av

dubbelhelixens struktur, vilket i sin tur kan leda till minskad genetisk stabilitet hos cellen som kan leda till försämrad cellfunktion och risk för cancerutveckling (4).

MMR använder sig av reparationsproteiner för att bilda ett MMR-komplex, varvid MSH2, MSH6, MLH1 och PMS2 agerar huvudproteiner i processen. Proteinerna bildar

heterodimerer, där MSH2/MSH6 bildar heterodimeren MutS-α och MLH1/PMS2 bildar MutL-α. MutS-α är en del av det större komplexet MutS medan MutL-α är en del av MutL. Reparationsprocessen initieras av MutS som upptäcker basparsmissförhållandet i den

syntetiserade strängen och bildar ett komplex med MutL och MutH. MutH aktiveras av MutL och består av endonukleaser som klyver av den muterade delen av strängen. MutL binder in till strängen och transporterar bort det avklippta partiet med hjälp av MutS,

enkelsträngsbindande proteiner och helikas. Därefter kommer DNA-polymeras återigen syntetisera strängen med korrekta nukleotider, varvid DNA-ligas fogar samman strängen (se figur 1) (3, 4).

Figur 1. Mismatch repair-systemet upptäcker felaktiga basparningar (svarta nukleotider) i den nyligen syntetiserade strängen (toppsträngen) med hjälp av MutS homolog och binder in till strängen med Mut L homolog. Mut L aktiverar Mut H som består av endonukleaser och klipper bort den muterade delen som sedan transporteras bort med hjälp av

enkelsträngsbindande proteiner (SSB), helikas och MutS. Sist syntetiserar DNA-polymeras en ny sträng med rätt nukleotider som binds samman med ligas (5).

Då MutS-α och MutL-α är beroende av varandra för att skapa ett funktionellt MMR blir systemet defekt om den ena heterodimeren tappar sin funktionalitet. Ett defekt MMR-system kännetecknas av att regioner av DNA får en så kallad mikrosattelitinstabilitet (MSI) som uppstår när MMR-proteinerna inte längre kan korrigera felaktiga basparningar (1, 3).

1.4 Mikrosatellitinstabilitet

Mikrosatelliter är sekvensuppreningar av DNA vid kodande och icke-kodande regioner och består vanligtvis av mono- och dinukleotidupprepningar eller av ett större antal.

Upprepningarna kan leda till att DNA-polymeraset glider på DNA strängen vid reparationen så att ett så kallat ”DNA polymerase slippage” sker, vilket resulterar i att den nya,

syntetiserade strängen får temporära insertion-deletion-loopar. Looparna känns vanligtvis igen av MMR-systemet och DNA repareras, där mikrosatellitfragmenten då kallas för mikrosatellitstabila (MSS). När MMR-proteinerna inte fungerar normalt uppstår ett flertal spontana mutationer över hela genomet som skapar starkt polymorfa mikrosatelliter som är mikrosatellitinstabila. MSI är en molekylär mutatorfentoyp som ger anlag för genetisk

hypermutabilitet och har en stark benägenhet att orsaka fel vid replikationen. Vid MSI kvarstår insertion-deletion-looparna och det uppstår frameshift-mutationer. Frameshift-mutationerna kan i sin tur ge upphov till nonsensmutationer i ett senare skede i replikationen, vilket kan leda till en produktion av icke-funktionella proteiner (6).

1.5 Mutationsanalys

Immunohistokemi (IHC) och molekylärgenetisk analys utförs för att undersöka förekomst av MSI. IHC är en metod som används för att bestämma uttrycket av biomarkörer i vävnad via färgning med antikroppar. Tumörbiopsier tas för att undersöka vilken heterodimer som

eventuellt är defekt, varvid IHC kan tyda olika utfall av proteinuttryck. Om alla proteinuttryck färgas tyder det på att tumören är MSS som innebär att båda heterodimererna (MSH2/MSH6 och MLH1/PMS2) är intakta. Om ett proteinuttryck inte färgas kallas det för förlust och antyder att minst en MMR-gen är defekt. Vid förlust av MLH1-proteinuttryck ses även en förlust av PMS2, vilket orsakas på grund av dess heterodimerstruktur. Förlust av MLH1 och PMS2 tyder på en defekt MLH1-gen. Vid förlust av PMS2 är enbart PMS2-genen defekt. Förlust av MSH2 och MSH6 indikerar en defekt MSH2-gen, medan förlust av MSH6 tyder på en defekt MSH6-gen (se tabell 1 och figur 2) (1, 7).

Tabell 1. Immunohistokemisk tolkning av mismatch repair-proteinerna MutL Homolog 1 (MLH1), Postmeotic Segregation Increased 2 (PMS2), MutS Homolog 2 (MSH2) och MutS Homolog 6 (MSH6) uttryck vid utredning av Lynch syndrom. Förlust av proteinuttryck indikerar en defekt gen och mikrosatellitinstabilitet i den undersökande cellen.

Proteinuttryck MLH1 PMS2 MSH2 MSH6 Tolkning + + + + Mikrosatellitstabilitet - - + + Defekt MLH1-gen + - + + Defekt PMS2-gen + + - - Defekt MSH2-gen + + + - Defekt MSH6-gen + = Intakt proteinuttryck - = Förlust av proteinuttryck

Figur 2. Colon adenocarcinom färgat med immunohistokemi. Bild A visar intakt

proteinuttryck mot MutS Homolog 2 (MSH2) som ses med en måttlig till stark färgning av cellkärnan i stromala- och neoplastiska celler. Bild B visar förlust av proteinuttryck mot MSH2. Neoplastiska celler visar ingen cellkärnsfärgning, medan omkringliggande stromala celler visar en intakt och måttlig färgning av cellkärnan (8).

1.6 Immunohistokemisk analys

Vid IHC används vanligtvis formalinfixerade och paraffininbäddade vävnader (FFPE). Det finns två huvudmetoder, direkt- och indirekt metod. Vid indirekt metod används vanligtvis antigen retrieval, primär antikropp, endogent enzymblock, linkermolekyl, märkt sekundär antikropp och kromogensubstrat. Slutligen görs en motfärgning. Mellan varje steg sker ett flertal tvättcykler med wash buffer eller destillerat vatten för att skölja bort överflödiga reagenser och antikroppar (se figur 3) (8).

Figur 3. Visualisering av immunohistokemisk färgning (IHC). Vävnaden avparaffineras och hydreras. Endogent enzymblock kan tillsättas före eller efter den primära antikroppen och hämmar ospecifik färgning. Antigen retrieval genomförs för att få fram antigenen i vävnaden. Den primära antikroppen tillsätts och binder in till sitt mål-antigen (röd cirkel).

Linkermolekylen tillsätts och hjälper till att amplifiera signalen från den primära antikroppen genom att bilda ett konjugat med den sekundära antikroppen. Den sekundära antikroppen bär på en dextranpolymer märkt med enzymer. Ett kromogensubstrat tillsätts som reagerar med enzymet och ger en färgutfällning vid antigenet. Färgutfällningen kan sedan ses

mikroskopiskt och påvisar att antigenuttrycket finns närvarande i vävnaden (9). IHC initieras med antigen retrieval (AR). Vid användning av FFPE-vävnader finns

molekylära modifieringar hos vävnadens proteiner till följd av tvärbindningar mellan formalin och protein. Det medför en helt eller delvis förlorad förmåga hos den primära antikroppen att reagera med antigen. Omvandling till proteinets ursprungliga molekylstruktur kan göras exempelvis med värmeinducerad AR. Värmeinducerad AR hydrolyserar och bryter tvärbindningarna vid upphettning över 100° C. Studier har visat att en bibehållen

vävnadsmorfologi sker i större grad vid upphettning till 90° C under en längre tidsperiod, än vid kort upphettning till 100° C och får en ökad effekt vid närvaro av vatten. Den optimala kombinationen av värme och inkubationstid varierar mellan olika antigen. Val av AR-lösning baseras på primärantikroppen då dess funktionalitet påverkas starkt av AR-lösningens pH.

Utöver pH bör faktorer såsom molaritet, innehåll och koncentration av retrieval buffert tas i beaktning (10).

Valet av primär antikropp baseras på fixeringsprocessen, typ av vävnad, AR-metod,

applikationsområdet samt vilket detektionssystem och vilka reagenser som används vid IHC. Det kräver optimering, validering och verifiering av både antikropp och protokoll. Att få en skarp, intensiv färgning är av högsta prioritet, men bakgrundsfärg kan uppstå om inte protokollet är tillräckligt optimerat. På grund av komplexiteten i att identifiera den mest lämpliga antikroppen väljer många laboratorium att använda sig av Ready-to-Use-antikroppar (RTU). Det är möjligt att införskaffa RTU-antikroppar som är färdigkalibrerade och

validerade för specifika detektionssystem och som inkluderar ett optimerat protokoll från tillverkaren. RTU-antikroppar kräver dock fortfarande validering och verifiering för att se att de fungerar optimalt för den fixeringsprocess som laboratoriet använder, men utesluter stegen att identifiera en lämplig AR-metod, antikroppstitrering och val av detektionssystem - något som fortfarande krävs vid användning av en koncentrerad antikropp (8).

Den primära antikroppen behöver också ha hög sensitivitet och specificitet för att uppnå god färgningskvalité. Monoklonala antikroppar används vanligtvis för att uppnå de kriterierna. Monoklonala antikroppar från samma klon är identiska med varandra genom idotyp, där varje antikropp har en specificitet och en affinitet. Hög specificitet medför ibland att antikroppen även har en låg affinitet, vilket inte är önskvärt då låg affinitet följaktligen minskar

antikroppens sensitivitet. Polyklonala antikroppar från kanin har vanligtvis en hög affinitet, men brister i specificitet då de inriktar sig på flera olika epitoper. Nyligen har monoklonala kanin-antikroppar introduceras till IHC. Viss forskning indikerar på att kaninens

immunsystem har en bättre igenkänning av humana antigener än mus-antikroppar. Kanin-antikroppar i kombination med den höga specificiteten hos monoklonala Kanin-antikroppar kan leda till en förbättrad affinitet, men som ändå behåller den höga specificiteten (8).

Endogent enzymblock tillsätts före eller efter den primära antikroppen för att förhindra falskt positiva resultat som kan uppkomma vid tillsatts av kromogensubstrat. Om cellens egna enzymer liknar detektionssystemets enzymer kan de störa resultatet och i vissa fall ta över signaleringen från det eftersökande antigenet. De två vanligaste enzymerna som används inom IHC för att skapa kromogensignaler är pepparrotsperoxidas och alkalisk fosfatas. De

finns naturligt i cellerna och produceras via endogena aktiviteter. Enzymblocket hämmar aktiviteten och används för att motverka den ospecifika färgningen (11).

För att få en ökad visualisering av slutresultatet kan en så kallad linkermolekyl tillsättas innan den sekundära antikroppen. En linkermolekyl detekterar och binder in till den konstanta delen av den primära antikroppen och amplifierar dess signal. Linkern bildar ett konjugat med den sekundära antikroppen, vilket resulterar i att fler sekundära antikroppar kan tillsättas till antikroppskomplexet. Den sekundära antikroppen bär på en märkt dextranpolymer som bär ett flertal enzymmolekyler, vanligtvis pepparrotsperoxidas. När kromogensubstratet tillsätts kommer det reagera med enzymmolekylen så att en färgreaktion sker. Inom IHC används vanligtvis kromogenen 3,3′-Diaminobenzidine (DAB). DAB oxideras av väteperoxid som katalyseras av pepparrotsperoxidas. Den oxiderade formen av DAB ger en brun färgutfällning vid platsen av reaktionen. Motfärgning med hematoxylin utförs för att visualisera alla

cellkärnor och den generella vävnadsstrukturen, ett steg som är nödvändigt för att navigera och särskilja vävnaderna och antigenen från varandra. Preparatet dehydreras och monteras med monteringsglas innan undersökning i ljusmikroskop (8).

1.7 Preanalytiska faktorer

Vid biopsitagning ska vävnaden fixeras i formalin i minst tjugofyra timmar innan

dehydrering. Fixeringstiden varierar beroende på vävnadens tjocklek och volym, där större volymer kan kräva flera dagars fixering. Det är av stor vikt att fixering påbörjas direkt efter borttagningen eftersom fixeringen bevarar vävnadsstrukturen och förhindrar autolys av vävnad. Ju senare fixeringen sker, desto sämre kvalité kommer slutresultatet få. Efter fixeringen utvärderas vävnaden makroskopiskt av patolog varvid denne skär ut utvalda, representativa vävnadsbitar. Ju längre vävnaden har blivit fixerad, desto mindre är risken för mekaniska skador vid utskärningen. Vävnadsbitarna placeras i märkta klossar och dehydreras. God dehydrering är en förutsättning för paraffinbäddning, bibehållen morfologi, minskad risk för autolys orsakad av vatten samt mekanisk skada vid snittning (8).

2. Syfte

2.1 Bakgrund

På patologavdelningen i Universitetssjukhus Örebro används IHC-analysinstrumentet Dako Omnis vid histopatologisk diagnosisering av LS. I dagsläget används Dako Link RTU-antikroppar till MLH1, MSH2 och MSH6 som är optimerade för analysinstrumentet Autostainer Link, samt en koncentrerad antikropp för PMS2 som kräver manuella- och tidskrävande spädningssteg innan färgning och kan orsaka spädningsfel. De nuvarande antikropparna önskas bytas ut till Dako Omnis RTU-antikroppar, då de inte behöver spädas och som är färdigoptimerade för Dako Omnis-instrumentet.

2.2 Frågeställning

Färgar Dako Omnis RTU-antikroppar för MLH1, MSH2, MSH6 och PMS2 rätt målprotein och färgar de målproteinet likvärdigt eller bättre än Dako Link RTU- och

3. MATERIAL OCH METOD

3.1 Datainsamling och förbehandling av vävnadspreparat

Tolv FFPE-colonvävnadspreparat valdes ut baserat på tidigare kända fall av CRC, varvid åtta vävnader innehöll tumörer med känd MSI och fyra vävnader med känd MSS. Om stora dehydreringsartefakter fanns exkluderades vävnaden, varav en vävnad exkluderades. FFPE-vävnaderna fixerades i 10 % formalin i minst 24 timmar innan dehydrering. Preparaten snittades i sektioner på 4 μm och monterades på immunohistokemiglas. Glasen inkuberades i värmeskåp i 60°C i 60 minuter. Efter svalning placerades glasen i kylskåp tills IHC

genomfördes. Efter IHC monterades täckglas inför mikroskopisk bedömning och digital scanning med Pannoramic 250 digital scanner (3D HISTECH Ltd., Budapest, Ungern). Mikroskopering utfördes av patolog på patologavdelningen USÖ samt av biomedicinsk analytikerstudent från Örebro Universitet.

3.2 Testmetod - Immunohistokemi

Samtliga immunfärgningar gjordes i EnVision FLEX visualiseringssystem på det automatiserade immunfärgningsinstrumentet Dako Omnis (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien, USA). Åtta olika snitt för respektive preparat färgades in med varsin primär antikropp (Link MLH1, Link MSH2, Link MSH6 och PMS2 1:40, Omnis MLH1, Omnis MSH2, Omnis MSH6 och Omnis PMS2). Antikroppen PMS2 1:40 späddes 1:40 till en slutkoncentration på 9,42 μg/mL innan användning. Preparaten genomgick AR med högt pH. Motfärgning med hematoxylin utfördes. Samtliga antikroppar, reagenser och kit som

användes var från Agilent (Santa Clara, Kalifornien, USA).

Samtliga antikroppar (se tabell 2) färgades enligt individuella protokoll där gemensamma reagenser och inkubationstider användes vid AR, endogent enzymblock, kromogensubstrat och motfärgning. De primära antikroppsreagenserna och inkubationstiderna varierande mellan protokollen. Samtliga protokoll använde sig av samma reagens för den märkta polymeren med en variation på inkubationstid. Antalet linkermolekyler som användes skiljde sig åt mellan protokollen. För Link antikropparna användes en linker, medan Omnis RTU-antikropparna samt PMS2 1:40 användes två. Antalet tvättcykler skiljde sig även åt mellan protokollen. För att ta del av de fullständiga protokollen se bilaga.

Tabell 2. Antikroppsreagenser och protokoll som användes vid immunohistokemisk färgning av mismatch repair generna MutL Homolg 1 (MLH1), MutS Homolog 2 (MSH2), MutS Homolog 6 (MSH6) och Postmeotic Segregation Increased 2 (PMS2) på analysinstrumentet Dako Omnis (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien, USA).

Primär antikroppsreagens Förkortning Klon Koncentration Protokoll Dako Link Ready-to-Use FLEX

Monoklonal mus anti-human MLH1

Link MLH1 ES05 Okänd MLH1AS

Dako Omnis Ready-to-Use FLEX Monoklonal mus anti-human MLH1

Omnis MLH1

ES05 3,4 μg/mL MLH1 IHC GA079

Dako Monoklonal anti-human PMS2 PMS2 1:40 EP51 9,42 μg/mL PSM2OMN Dako Omnis Ready-to-Use FLEX

Monoklonal kanin anti-human PMS2

Omnis PMS2 EP51 31 μg/mL PMS2 IHC GA087

Dako Link Ready-to-Use FLEX Monoklonal mus anti-human MSH2

Link MSH2 FE11 Okänd MSH2AS

Dako Omnis Ready-to-Use FLEX Monoklonal mus anti-human MSH2

Omnis MSH2

FE11 0,75 μg/mL MSH2 IHC GA085

Dako Link Ready-to-Use FLEX Monoklonal kanin anti-human MSH6

Link MSH6 EP49 Okänd MSH6AS

Dako Omnis Ready-to-Use FLEX Monoklonal kanin anti-human MSH6

Omnis MSH6

EP49 0,18 μg/mL MSH6 IHC GA086

3.3 Kontroller

Externa positiva kontroller i form av frisk colon- och tonsillvävnad användes. Den externa kontrollen utfördes för att observera att rätt målproteiner färgades in och att proteinuttryck kunde ses hos samtliga cellkärnor som fanns i preparaten. De interna positiva kontrollerna bestod av CRC-vävnadernas benigna eller normala epitelceller, lymfocyter och stromala celler. De negativa kontrollerna bestod av de maligna cellerna hos CRC-vävnaderna med MSI. Efter studiens slutförande kommer kvalitetskontroller skickas till det externa

kontrollprogrammet NordiQC för att kontrollera att infärgningarna håller samma standard som hos andra laboratorium.

3.4 Utvärdering av infärgning

Infärgningarna utvärderades mikroskopiskt av två bedömare som bedömde om Omnis antikropparna färgade vävnaderna bättre, sämre eller likvärdigt jämfört med Link RTU-antikropparna och PMS2 1:40, där betyget sämre kunde motiveras som för svagt eller för starkt färgat. Varje infärgning av Omnis RTU-antikropparna bedömdes som antingen

godkänd eller ej godkänd. Ett godkänt resultat innebär att antikroppen färgar rätt målantigen med tillräcklig intensitet för att protokollet anses kunna användas vid rutinfärgning, medan ej godkänt innebär att protokollet behöver optimeras innan användning.

Vid bedömning utvärderades hela vävnaden. Partier med nekros och fixeringsartefakter undveks. Vid intakt proteinuttryck gav samtliga antikroppar en kärninfärgning som skulle vara entydiga och ha samma totala färgintensitet som de interna positiva kontrollerna. Om fokal färgning sågs betraktades vävnaden som intakt om färgningen var kontinuerlig i flertalet körtlar, samt om färgningen var likvärdig eller starkare än de interna positiva kontrollerna. De interna positiva kontrollerna skulle ha en måttlig till stark kärnfärgning för att anses vara godkända. Vid färgning av benign colonvävnad skulle en måttlig till stark färgreaktion visas i basala epitelceller och en svag till måttlig färgreaktion i luminala epitelceller, stromala celler och glatt muskulatur. För MSH6 och PMS2 skulle en måttlig till stark färgning ses i germinal centrum i lymfnoder. Vid bedömning av tonsillvävnad vid samtliga antikroppar skulle en måttlig till stark färgreaktion ses i celler i germinal centrum. B- och T-celler i mantelzonen skulle uppvisa en svag till måttlig färgreaktion. Vid förlust av proteinuttryck skulle ingen eller näst intill ingen kärnfärgning ses i maligna celler. Om fokal färgning sågs, ansågs vävnaden ha förlust av proteinuttryck om färgning enbart sågs i en ensam körtel, färgade diskontinuerlig i ett flertal körtlar eller färgade med en svagare intensitet än de positiva kontrollerna (1, 12).

3.5 Etiskt övervägande

De gastro-intestinala vävnaderna som användes i studien pseudonymiserades. I förenlighet med Biobanklagen har patienterna vid provtagningstillfället tillfrågats och godkänt

4. RESULTAT

4.1 MLH1

Vid infärgning av MLH1 färgade Omnis MLH1 samtliga 11 vävnadsfall bättre än den

nuvarande Link-antikroppen (se figur 4). De externa och interna positiva kontrollerna färgade in rätt målceller och de externa kontrollerna fick en bättre infärgning. Förlust av

proteinuttryck kunde ses vid sju av åtta MSI-fall hos både Omnis och Link RTU-antikroppen. Antikroppen blev godkänd på samtliga CRC-fall.

Figur 4. Immunohistokemisk infärgning av proteinuttryck MLH1 i cellkärnan hos

colonvävnad. Bild A och C visar färgning med Dako Link Ready-to-Use MLH1-antikropp och bild B och D visar färgning med Dako Omnis Ready-to-Use MLH1-antikropp. Grön markering i samtliga bilder ses en brun färg där MLH1 uttrycks i cellkärnor hos stromala celler och lymfocyter. I de röda markeringarna ses förlust av proteinuttryck i de maligna cellkärnorna. Bild B har en mycket starkare brun kärninfärgning och har mer bakgrundsfärg än bild A. I bild D ses en måttligt starkare infärgning av cellkärnorna än i bild C.

4.2 MSH2

Vid infärgning av MSH2 färgade Omnis MSH2 in nio fall bättre än Link MSH2 och två av fallen färgades in likvärdigt mellan de båda antikropparna (se figur 5). De interna positiva kontrollerna blev godkända och de externa positiva kontrollerna färgade in rätt målceller. Av de externa positiva kontrollerna blev colonpreparatet bättre infärgat och godkänd.

godkänd. För mycket bakgrundsfärg kunde även ses i ett av CRC-fallen. Samtliga 11 fall som färgats med Omnis MSH2 blev godkända. Förlust av proteinuttryck kunde ses vid tre av de åtta MSI-fallen hos både Omnis RTU- och Link RTU-antikroppen.

Figur 5. Immunohistokemisk infärgning av proteinuttryck MSH2 i cellkärnan hos

colonvävnad. Bild A och C visar färgning med Dako Link Ready-to-Use MSH2-antikropp och bild B och D visar färgning med Dako Omnis Ready-to-Use MSH2-antikropp. I samtliga bilder ses en brun färg där MSH2 uttrycks i cellkärnor hos friska celler markerat med grön ruta. I bild A och B i orange ruta markeras maligna celler som påvisar proteinuttryck av MSH2. Bild B visar en likvärdig kärnfärgning jämfört med bild A, men har mer

bakgrundsfärg. Bild D har en bättre kärnfärgning än bild C. De röda rutorna visar förlust av proteinuttryck i maligna cellkärnor.

4.3 MSH6

Vid infärgning av MSH6 färgade Omnis MSH6 ett preparat bättre än Link MSH6. Fyra av CRC-fallen färgades in likvärdigt medan sex av fallen färgades sämre. Av de sämre färgade fallen skedde en svagare infärgning med den undersökande antikroppen, där ett av fallen även hade en för svag intern positiv kontroll för att anses vara godkänd (se figur 6). På de externa positiva kontrollerna färgades rätt målceller in, men fick en för svag färgintensitet. Ingen av de externa positiva kontrollerna blev godkända, medan 8 av de 11 CRC-fallen blev godkända.

Förlust av proteinuttryck kunde ses i tre av MSI-fallen hos både Omnis och Link RTU-antikroppen.

Figur 6. Immunohistokemisk infärgning av proteinuttryck MSH6 i cellkärnan hos

colonvävnad. Bild A och C visar färgning med Dako Link Ready-to-Use MSH6-antikropp och bild B och D visar färgning med Dako Omnis Ready-to-Use MSH6-antikropp. I samtliga bilder ses en brun färg där MSH6 uttrycks i cellkärnor hos friska celler markerat med grön ruta. Den röda rutan i bild A och B visar maligna celler med förlust av proteinuttryck, medan i samtliga bilder visar cellkärnorna i grön ruta intakt uttryck. Bild B visar en mycket svagare kärnfärgning jämfört med bild A i de friska cellerna och är inte godkänd. Den orangea rutan i bild D och C visar maligna celler med intakt proteinuttryck. Bild D har en svagare kärnfärg än bild C, men ger fortfarande en stark färgning och är godkänd.

4.4 PMS2

Vid infärgning av PMS2 färgade Omnis PMS2 fem av de elva CRC-fallen bättre än med PMS2 1:40. Fyra av fallen färgades in likvärdigt, medan två av dem färgades in sämre med en svagare färgintensitet. I flera av CRC-fallen kunde en stark bakgrundsfärgning ses, men i jämförelse med den nuvarande antikroppen PMS 1:40 var bakgrundsfärgen i de flesta fall mindre intensiv (se figur 7). De externa positiva kontrollerna färgade in rätt målceller. Av kontrollerna blev colonpreparatet likvärdigt färgat, men bedömdes som ej godkänd då både Omnis PMS2 och PMS2 1:40 färgade in målcellerna för svagt. Tonsillkontrollen fick en

svagare infärgning med Omnis PMS2, men bedömdes ändå som godkänd. Av CRC-fallen blev 11 godkända med Omnis PMS2 och förlust av proteinuttryck kunde ses i sju av MSI-fallen hos både Omnis RTU- och PMS2 1:40-antikroppen.

Figur 7. Immunohistokemisk infärgning av proteinuttryck PMS2 i cellkärnan hos

colonvävnad. Bild A och C visar färgning med Dako Link Ready-to-Use PMS2 antikropp och bild B och D visar färgning med Dako Omnis Ready-to-Use PMS2 antikropp. I samtliga bilder ses en brun färg där PMS2 uttrycks i cellkärnor hos friska celler markerat med grön ruta. Den röda rutan i bild A och B visar maligna celler med förlust av proteinuttryck, medan i samtliga bilder visar cellkärnorna i grön ruta intakt uttryck. Bild B visar en svagare

kärnfärgning i de friska cellerna jämfört med bild A. Bild A har en högre bakgrundsfärg än bild B. Den orangea rutan i bild D och C visar maligna celler med intakt proteinuttryck. Bild D har en svagare färg än bild C, men färgar fortfarande starkt. Bild D har mindre

5. DISKUSSION

5.1 Tolkning av resultat

Av de fyra undersökta antikropparna anses Omnis MLH1 och MLH2 vara godkända inför rutinfärgning efter validering. Färgningen med Omnis MLH1 gav en klar förbättring i färgintensitet jämfört med Link MLH1 och ansågs vara den bättre färgningen av båda bedömarna. Den godkändes i alla CRC-fall och kontroller, vilket talar för att det protokoll som användes var väl optimerat för laboratoriets pre-analytiska steg och analysinstrumentet. Studien resultat antyder att antikroppen sannolikt är pålitlig och bör fungera väl i

rutinfärgning. Vid färgning av proteinet MSH2 sågs en god förbättring av färgintensiteten i nio av de elva CRC-fallen med Omnis MSH2 och likvärdig färgning med Link MSH2 i resterande fall. Vid samtliga preparat godkändes antikroppen, med ett undantag på en extern kontroll som blev underkänd till följd av för mycket bakgrundsfärg. Ytterligare en färgning fick mer bakgrundsfärg än önskvärt, så en eventuell justering av protokollet skulle kunna göras för att försöka minska bakgrundsfärgningen.

I samtliga fall sågs en svagare infärgning vid användning av Omnis RTU MSH6, trots detta ansågs åtta fall av 11 uppfylla kriterierna för att anses vara godkända. Men en intern- och en extern positiv kontroll var så pass svaga att de inte blev godkända, vilket inte är önskvärt. På grund av för svag infärgning behöver protokollet för Omnis RTU MSH6 optimeras för att uppnå en starkare färgintensitet. Vid undersökning av Omnis RTU PMS2 sågs en förbättring i färgintensitet i majoriteten av färgningarna jämfört med PMS2 1:40. Enbart två fall färgades svagare och alla CRC-fall blev godkända. Det stora problemet som sågs för både Omnis PMS2 och PMS2 1:40 var att de gav för mycket bakgrundsfärg i alla vävnadspreparat. Den ena externa positiva kontrollen var inte godkänd på grund av detta. Med Omnis PMS2 sågs en förbättring med minskad bakgrundsfärg, men för att få en ännu bättre visualisering av

cellkärnorna och klarare färgning hade en optimering av protokollet varit önskvärt. Ett fortsatt arbete för att utveckla bra protokoll för MSH6 och PMS2 bör göras. Vid

optimering av protokoll krävs identifiering av var i IHC-processen färgningen fallerar. Vid svag färgning kan optimering ske för att få en starkare färgning främst genom att förlänga inkubationstiden eller koncentrationen av den primära antikroppen, då det kan ge fler antigen-antikroppsreaktioner. Att minska tiden för endogent enzymblock kan också vara ett alternativ,

då antigen-sites kan maskeras vid längre tidsperioder. Ett till alternativ kan vara att minska inkubationstiden eller koncentrationen av den sekundära antikroppen. En hög koncentration av den sekundära antikroppen kan ge mer bakgrundsfärg, men en extremt hög koncentration kan ge motsatta effekt och minska antigendetektionen. Så genom att sänka koncentrationen kan det resultera i en starkare infärgning. För att optimera ett protokoll för att minska bakgrundsfärgningen kan som tidigare nämnt en minskad inkubation av den sekundära antikroppen ske om koncentrationen är för hög. Det första valet är dock att minska inkubationstiden eller koncentrationen av den primära antikroppen, då en mindre

inkubationstid leder till att färre antigen-antikroppsreaktioner sker. Att öka tidsperioden med endogent enzymblock kan också vara ett alternativ, då det kan ge en minskad risk för

ospecifik färgning om endogent material finns kvar i preparatet (14).

5.2 Styrkor och svagheter

Studien har visat att rätt målproteiner färgas in, där majoriteten av fallen har färgats med goda resultat. En styrka i studien är metoden. IHC är en relativt enkel och billig analysmetod i jämförelse med andra molekylära analyser, där undersökningen kan göras på samma material som den ursprungliga patologisk-anatomisk diagnosen. Diagnostisering via IHC ger även ett snabbt analyssvar, då de flesta sjukhus kan utföra IHC medan färre har möjligheten att utföra molekylära analyser på plats. Ytterligare en styrka är att det inte finns några uppenbara jävsförhållanden i studien, då det är önskvärt för bedömarna att hitta den bästa antikroppen för att underlätta patologernas arbeten. Ett bättre färgat preparat leder till en enklare

diagnostik och minskar risken för att preparatet behöver färgas om på grund av bristande färgningskvalité. Ett bättre färgat preparat leder förhoppningsvis också till en ökad patientsäkerhet till följd av den underlättade diagnostiken.

Att undersöka fler vävnadspreparat hade varit att föredra för att få en säkrare mätning av antikroppens pålitlighet. En del av preparaten hade dehydreringsartefakter, därför skulle ett större urval och bättre kvalité på vävnader medfört en mer säker testning av antikropparna. Studien avancerade vidare till patientfall trots att inte alla externa positiva kontroller godkändes för alla antikroppsreagenser – ett val som baserats på tidsbrist. Att ha optimerat antikroppskontrollen tills alla kontroller godkändes hade varit att föredra. Vid efterföljande studier skulle fler observatörer kunna användas samt skulle en blindad studie kunna

antikroppen ska vara bättre än den gamla, kan en blindad studie möjligtvis undvika bias. Viktigt att ha i beaktning vid IHC är att förlust av proteinuttryck inte nödvändigtvis behöver innebära att en patient har en LS-orsakad tumör, då förlust av proteinuttryck enbart tyder på att antigenet inte finns närvarande i vävnaden. För att vara garanterad att förlusten orsakas av LS bör en komplettering med molekylärgenetisk analys genomföras vid fynd av defekt MMR.

5.3 Klinisk relevans

En förbättrad kvalité på immunohistokemiska färgningar leder till en enklare undersökning för patolog. Det kan innebära en bättre möjlighet att diagnostisera och att arbetsbördan minskas då undersökningen tar mindre tid. Att använda sig av RTU-antikroppar som är optimerade för ett specifikt analysinstrument ger en större försäkran att analysen genomförs på ett korrekt sätt och kan underlätta den preanalytiska processen för laboratoriepersonal då tidskrävande manuella spädningssteg försvinner.

6. SLUTSATS

Omnis-antikropparna färgar in rätt målceller i de undersökande fallen och kan i framtiden vara ett fullgott eller bättre alternativ än Link-antikropparna. En variation i färgintensitet finns mellan Omnis-antikropparna, där Omnis MLH1 och MSH2 bör vara redo för rutinfärgning i verksamheten medan vidare optimering av protokoll för Omnis MSH6 och PMS2 föreslås genomföras.

7. TACK

Ett stort tack till mina handledare från Örebro Universitet och från patologilaboratoriet USÖ samt all personal på patologiavdelningen USÖ som varit delaktiga i uppsatsen. Er vägledning och trevliga bemötande var till stor hjälp under skrivandet och gav mycket värdefull

8. REFERENSER

1. Regionalt Cancer Centrum. Vårdprogram för Hereditär Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC) [Internet]. Lund: Onkologiskt centrum; 2005. [Citerad 2021 mars 27] Hämtad från:

https://cancercentrum.se/globalassets/cancerdiagnoser/tjock--och-andtarm-anal/syd/vardprogr-hnpcc-2005.pdf

2. Von Salomé J, Boonstra PS, Karimi M, Silander G, Stenmark-Askmalm M, Gebre-Medhin S, et al. Genetic anticipation in Swedish Lynch syndrome families. PLoS Genet. 2017; 13(10).

3. Kheirelseid EAH, Miller N, Chang KH, Curran C, Hennessey E, Sheehan M, et al. Mismatch repair protein expression in colorectal cancer. J Gastrointest Oncol. 2013; 4(4): 397–408.

4. Vilar E, Gruber SB. Microsatellite instability in colorectal cancer—the stable evidence. Nat Rev Clin Oncol. 2010; 7(3): 153–62.

5. Buckingham L. Molecular diagnostics: fundamentals, methods, and clinical applications. Third edition. Philadelphia: F.A. Davis Company; 2019.

6. Nojadeh JN, Sharif SB, Sakhinia E. Microsatellite instability in colorectal cancer. EXCLI J. 2018; 17: 159-168.

7. Remo A, Fassan M, Lanza G. Immunohistochemical evaluation of mismatch repair proteins in colorectal carcinoma: The AIFEG/GIPAD proposal. Pathologica. 2016; 108: 104-109.

8. DakoDenmark A/S. Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Agilent Technologies Inc.; 2013.

9. Sino Biological. Immunohistochemistry (IHC) Protocols [Internet]. Beijing: Sino Biological; 2021 [Citerad 2021 maj 8]. Hämtad från:

https://www.sinobiological.com/category/ihc-protocol

10. Krenacs L, Krenacs T, Stelkovics E, Raffeld M. Heat-Induced Antigen Retrieval for Immunohistochemical Reactions in Routinely Processed Paraffin Sections. Methods Mol Biol. 2010; 588: 103–119.

11. Kim SW, Roh J, Park CS. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. J Pathol Transl Med. 2016; 50(6): 411–418.

12. Agilent Dako. FLEX Ready-to-Use Atlas of Controls. First Edition. USA: Agilent Technologies Inc.; 2020.

13. Thermofisher Scientific. IHC Troubleshooting Guide [Internet]. USA: Thermofisher Scientific; 2021 [Citerad 2021 april 27]. Hämtad från:

https://www.thermofisher.com/se/en/home/life-science/protein-biology/protein-

9. BILAGA

Tabell 1. Jämförelse av protokoll PMS2AS och PMS2 IHC GA087.

Protokoll Moment Delmoment Reagens Temperatur

°C Inkubationstid Cykel PMS2AS PMS2 IHC GA087 Avvaxning Tvåfas avvaxning IHC Tvätt IHC Clearify Clearing Agent Transportvätska: DI vatten DI vatten 25 Topp: 10 sekunder Botten: 1 minut 5 sekunder 1 1 X X X X Target

retrieval Target retrieval IHC EnV FLEX TRS, High pH Kylvätska: DI vatten 97 30 minuter X X Färgning Tvätt Primär antikropp Tvätt Endogent enzymblock Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Märkt polymer Tvätt Tvätt Tvätt Tvätt Substrat – kromogen Wash buffer PMS2 1:40 PMS2 Wash buffer EnV FLEX Peroxidase-Blocking Reagent Wash buffer EnV FLEX+ Rabbit LINKER Wash buffer EnV FLEX+ Mouse LINKER Wash buffer EnV FLEX/HRP Wash buffer Wash buffer DI vatten DI vatten Wash buffer EnV FLEX Substrate 2:40 minuter 22:30 minuter 20 minuter 2 minuter 3 minuter 2 minuter 10 minuter 2 minuter 10 minuter 2 minuter 20 minuter 2 minuter 2 minuter 31 sekunder 15 minuter 2 minuter 2 10 10 10 10 10 10 1 1 10 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Tvätt Tvätt Tvätt Working Solution Wash buffer DI vatten Wash buffer 5 minuter 2 minuter 31 sekunder 2 minuter 10 1 10 X X X X X X X X Motfärgning Motfärgning Tvätt Tvätt Dako Hematoxylin DI vatten Wash buffer 3 minuter 2 minuter 2 minuter 10 10 X X X X X X

Tabell 2. Jämförelse av protokoll MLH1AS och MLH1 IHC GA079.

Protokoll Moment Delmoment Reagens Temperatur

°C Inkubationstid Cykel MLH1AS MLH1 IHC GA079 Avvaxning Tvåfas avvaxning IHC Tvätt IHC Clearify Clearing Agent Transportvätska: DI vatten DI vatten 25 Topp: 10 sekunder Botten: 1 minut 5 sekunder 1 1 X X X X Target

retrieval Target retrieval IHC EnV FLEX TRS, High pH Kylvätska: DI vatten 97 30 minuter X X Färgning Tvätt Primär antikropp Tvätt Tvätt Endogent enzymblock Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Wash buffer MLH1 RTU MLH1 Wash buffer Wash buffer EnV FLEX Peroxidase-Blocking Reagent Wash buffer EnV FLEX+ Mouse LINKER Wash buffer EnV FLEX+ Rabbit LINKER Wash buffer 2:40 minuter 30 minuter 25 minuter 2 minuter 2 minuter 3 minuter 2 minuter 10 minuter 2 minuter 10 minuter 2 minuter 2 10 10 10 10 10 X X X X X X X X X X X X X X X X X

Märkt polymer Tvätt Tvätt Tvätt Tvätt Substrat – kromogen Tvätt Tvätt Tvätt EnV FLEX/HRP Wash buffer Wash buffer DI vatten Wash buffer EnV FLEX Substrate Working Solution Wash buffer DI vatten Wash buffer 30 minuter 20 minuter 2 minuter 2 minuter 31 sekunder 2 minuter 5 minuter 2 minuter 31 sekunder 2 minuter 10 10 1 10 10 1 10 X X X X X X X X X X X X X X X X X X Motfärgning Motfärgning Tvätt Tvätt Dako Hematoxylin DI vatten Wash buffer 3 minuter 2 minuter 2 minuter 10 10 X X X X X X

Tabell 3. Jämförelse av protokoll MSH2AS och MSH2 IHC GA085.

Protokoll Moment Delmoment Reagens Temperatur

°C Inkubationstid Cykel MSH2AS MSH2 IHC GA085 Avvaxning Tvåfas avvaxning IHC Tvätt IHC Clearify Clearing Agent Transportvätska: DI vatten DI vatten 25 Topp: 10 sekunder Botten: 1 minut 5 sekunder 1 1 X X X X Target

retrieval Target retrieval IHC EnV FLEX TRS, High pH Kylvätska: DI vatten 97 30 minuter X X Färgning Tvätt Primär antikropp Tvätt Endogent enzymblock Wash buffer MSH2 RTU MSH2 Wash buffer EnV FLEX Peroxidase-2:40 minuter 25 minuter 20 minuter 2 minuter 3 minuter 2 10 X X X X X X X X

Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Märkt polymer Tvätt Tvätt Tvätt Tvätt Substrat – kromogen Tvätt Tvätt Tvätt Blocking Reagent Wash buffer EnV FLEX+ Mouse LINKER Wash buffer EnV FLEX+ Rabbit LINKER Wash buffer EnV FLEX/HRP Wash buffer Wash buffer DI vatten Wash buffer EnV FLEX Substrate Working Solution Wash buffer DI vatten Wash buffer 2 minuter 10 minuter 2 minuter 10 minuter 2 minuter 20 minuter 2 minuter 2 minuter 31 sekunder 2 minuter 5 minuter 2 minuter 31 sekunder 2 minuter 10 10 10 10 10 1 10 10 1 10 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Motfärgning Motfärgning Tvätt Tvätt Dako Hematoxylin DI vatten Wash buffer 3 minuter 2 minuter 2 minuter 10 10 X X X X X X

Tabell 4. Jämförelse av protokoll MSH6AS och MSH6 IHC GA086.

Protokoll Moment Delmoment Reagens Temperatur

°C Inkubationstid Cykel MSH6AS MSH6 IHC GA086 Avvaxning Tvåfas avvaxning IHC Tvätt IHC Clearify Clearing Agent Transportvätska: DI vatten DI vatten 25 Topp: 10 sekunder Botten: 1 minut 5 sekunder 1 1 X X X X

Target

retrieval Target retrieval IHC EnV FLEX TRS, High pH Kylvätska: DI vatten 97 30 minuter X X Färgning Tvätt Primär antikropp Tvätt Endogent enzymblock Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Sekundär antikropp Tvätt Märkt polymer Tvätt Tvätt Tvätt Tvätt Substrat – kromogen Tvätt Tvätt Tvätt Wash buffer MSH6 RTU MSH6 Wash buffer EnV FLEX Peroxidase-Blocking Reagent Wash buffer EnV FLEX+ Rabbit LINKER Wash buffer EnV FLEX+ Mouse LINKER Wash buffer EnV FLEX/HRP Wash buffer Wash buffer DI vatten Wash buffer EnV FLEX Substrate Working Solution Wash buffer DI vatten Wash buffer 2:40 minuter 20 minuter 20 minuter 2 minuter 3 minuter 2 minuter 10 minuter 2 minuter 10 minuter 2 minuter 20 minuter 2 minuter 2 minuter 31 sekunder 2 minuter 5 minuter 2 minuter 31 sekunder 2 minuter 2 10 10 10 10 10 10 1 10 10 1 10 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Motfärgning Motfärgning Tvätt Tvätt Dako Hematoxylin DI vatten Wash buffer 3 minuter 2 minuter 2 minuter 10 10 X X X X X X