Imobilizace chlorhexidinu na křemičitá nanovlákna a hodnocení jeho antibakteriální
účinnosti
Bakalářská práce
Studijní program: B3942 – Nanotechnologie Studijní obor: 3942R002 – Nanomateriály Autor práce: Michal Puchrík
Vedoucí práce: doc. Mgr. Irena Lovětinská-Šlamborová, Ph.D.
Konzultant: prof. Ing. Ivan Stibor, CSc.
Technická univerzita v Liberci
Fakulta mechatroniky, informatiky a mezioborových studií Akademický rok: 2019/2020
ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE
(PROJEKTU, UMĚLECKÉHO DÍLA, UMĚLECKÉHO VÝKONU)
Jméno a příjmení: Michal Puchrík Osobní číslo: M17000115
Studijní program: B3942 Nanotechnologie Studijní obor: Nanomateriály
Název tématu: Imobilizace chlorhexidinu na křemičitá nanovlákna a hodnocení jeho antibakteriální účinnosti
Zadávající katedra: Katedra chemie (KCH)
Zásady pro vypracování:
1. Vypracujte rešerši – chlorhexidin, mechanismus účinku na G+ a G– bakteriální kmeny, mož- nosti jeho ukotvení na různé nosiče, aplikace a současné využití (nejnovější poznatky).
2. S ohledem na strukturu chlorhexidinu navrhněte několik možností funkcionalizace povrchu křemičitých nanovláken s možností následné imobilizace chlorhexidinu.
3. Připravte vzorky nanovláken s imobilizovaným chlorhexidinem.
4. Ověřte jeho funkčnost mikrobiologickými metodami na vybrané patogenní bakteriální kmeny.
Rozsah práce: 40–50 stran Rozsah grafických prací: dle potřeby Forma zpracování bakalářské práce: tištěná Seznam doporučené literatury:
1. SMYTH, H., R. MCMULLAN a P. MCCONAGHY, 2019. Chlorhexidine and peri-operative anaphylaxis: an institute’s approach to improving patient safety. Anaesthesia. 74, 73–73.
ISSN 0003-2409.
2. SRISANG, S., N. WONGSUWAN, A. P. BOONGIRD, M. UNGSURUNGSIE, P. WANASAWAS a N.
NASONGKLA, 2019. Multilayer nanocoating of Foley urinary catheter by chlorhexidine- loaded nanoparticles for prolonged release and anti-infection of urinary tract.
International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials. 1–9.
ISSN 0091-4037. Dostupné z doi: 10.1080/00914037.2019.1655752
3. VEVERKOVÁ, I. a I. LOVĚTINSKÁ-ŠLAMBOROVÁ, 2016. Modified Silica Nanofibers with Antibacterial Activity. Journal of Nanomaterials. 2016, 1–6. ISSN 1687-4110, 1687-4129.
Dostupné z doi: 10.1155/2016/2837197
4. EXNAR, P., I. LOVĚTINSKÁ-ŠLAMBOROVÁ a M. PAPRČKOVÁ, 2017. Solubility tests of silica nanofibers in body fluids as the default information for their application in medicine.
Nanofibers, Applications and Related Technologies. 2017, 121–128.
ISBN 978-80-7494-393-5.
5. ŠLAMBOROVÁ, I., ZAJÍCOVÁ, V., EXNAR, P., STUDNIČKOVÁ, J.: Nanovlákenná struktura s imobilizovaným organickým agens a způsob její výroby. CZ 303 911, 14.8.2012, 9.5.2013;
Nanofiber structure with immobilized organic agens and the method of its preparation.
WO 2014026656. Uděleno 20.2.2014.
Vedoucí bakalářské práce: doc. Mgr. Irena Lovětinská-Šlamborová, Ph.D.
Konzultant: prof. Ing. Ivan Stibor, CSc.
Datum zadání bakalářské práce: 7. října 2019 Termín odevzdání bakalářské práce: 1. června 2020
Prohlášení
Byl jsem seznámen s tím, že na mou bakalářskou práci se plně vztahuje zákon č. 121/2000 Sb.
o právu autorském, zejména § 60 – školní dílo.
Beru na vědomí, že Technická univerzita v Liberci (TUL) nezasahuje do mých autorských práv užitím mé bakalářské práce pro vnitřní potřebu TUL.
Užiji-li bakalářskou práci nebo poskytnu-li licenci k jejímu využití, jsem si vědom povinnosti in- formovat o této skutečnosti TUL; v tomto případě má TUL právo ode mě požadovat úhradu ná- kladů, které vynaložila na vytvoření díla, až do jejich skutečné výše.
Bakalářskou práci jsem vypracoval samostatně s použitím uvedené literatury a na základě kon- zultací s vedoucím bakalářské práce a konzultantem.
Současně čestně prohlašuji, že tištěná verze práce se shoduje s elektronickou verzí, vloženou do IS STAG.
Datum:
Podpis:
Důležité upozornění
Díky mimořádnému stavu, způsobenému pandemií nemoci COVID-19, byl během vypraco- vávání této bakalářské práce znemožněn přístup do školních laboratoří na příliš dlouhou dobu na to, aby mohla být vypracována praktická část. K nahrazení chybějícího obsahu byla proto rozšířena teoretická část práce, aby byl splněn doporučený rozsah. Tato změna však není reflektována v zadání práce, které bylo na základě instrukcí děkana ponecháno v pů- vodní podobě.
Poděkování
Tímto bych chtěl poděkovat paní doc. Mgr. Ireně Šlamborové Ph. D. za odborné vedení při vypracovávání této práce, za její ochotu a trpělivost a za pomoc při řešení nečekané situace, která vyvstala z důvodu zamezení přístupu do laboratoří, způsobeného výjimečným stavem.
Dále chci poděkovat panu prof. Ing. Ivanu Stiborovi CSc. a panu RNDr. Michalu Řezankovi Ph. D. za poskytnutí konzultací, ze kterých jsem si odnesl cenné informace o postupech, kte- rými by bylo možno realizovat praktickou část mé práce. Nakonec si poděkování zaslouží děkan Fakulty mechatroniky, informatiky a mezioborových studií, pan prof. Ing. Zdeněk Plíva, Ph.D., který umožnil úpravu či zjednodušení obsahu závěrečných prací v akademic- kém roce 2019/2020, aby mohli své práce v řádném termínu dokončit i studenti, kterým zavedení výjimečného stavu a bezmála dvouměsíční uzavření univerzity zkomplikovalo práci na jejich závěrečných pracích.
Abstrakt
Obsahem této práce je studium vlastností antiseptické látky chlorhexidinu a křemičitých nanovláken s cílem navrhnout několik možných způsobů imobilizace chlorhexidinu na tento typ nanovláken. Výsledný materiál by mohl nalézt uplatnění v medicíně, např. jako krycí materiál usnadňující hojení ran. Na základě rešerše informací z vědecké činnosti pře- vážně z posledních pěti let, která se zabývala problematikou imobilizace chlorhexidinu na různé nosiče na bázích nanomateriálů byly navrženy tři možné postupy imobilizace – po- mocí cyklodextrinů (cyklické oligosacharidy které ve své centrální kavitě mohou nevazeb- nými interakcemi vázat molekuly), kovalentní vazbou přes organokovový cross-linker a s využitím nanoporézních materiálů, které uvolní svůj obsah v reakci na pH prostředí.
Prozkoumány byly také jiné způsoby imobilizace (např. s využitím nanočástic zlata, žela- tiny nebo jiných než křemičitých polymerních materiálů). Jedním z cílů práce bylo alespoň některé z navržených metod provést v laboratoři, otestovat antibakteriální aktivitu takto vytvořených materiálů a vlastnosti materiálů vzájemně porovnat. Naneštěstí byl v souvis- losti se zavedením nouzového stavu znemožněn přístup do školních laboratoří, což znemož- nilo praktickou část vypracovat v daném časovém rozmezí (některé z navržených syntéz a testování kinetiky uvolňování jsou poměrně časově náročné a nemusejí vést napoprvé k uspokojivým výsledkům). Proto byla místo toho teoretická část rozšířena, zejména o in- formace týkající se křemičitých nanovláken (jakožto nosiče chlorhexidinu, který měl být vy- užit v praktické části), jejich výroby, vlastností a využití. Navržené postupy budou případně vyzkoušeny v rámci diplomové práce, která bude na tuto bakalářskou práci navazovat, po- kud to bude tematicky vhodné vzhledem k jejímu obsahu.
Klíčová slova
chlorhexidin, křemičitá nanovlákna, imobilizace, antibakteriální účinky, drug-delivery systémy
Abstract
This thesis aims at studying the properties of chlorhexidine (an antiseptic) and silica nano- fibers, in order to propose several options of immobilization of chlorhexidine onto this type of nanofibers. The resulting material could potentially find use in medical applications, for example as a wound dressing which promotes the healing process. Based on the infor- mation taken from scientific research in this area, mainly from the last five years, three methods of immobilization were suggested – using cyclodextrins (cyclic oligosaccharides that have the ability to non-covalently bind molecules in their central cavity), via a covalent bond using an organometallic cross-linker and with the use of nanoporous materials which release their contents in response to the pH value of the environment. Other methods of immobilization were also researched (such as those using gold nanoparticles, gelatine or different than silica-based polymer materials). One of the goals of this work was to test at least some of the proposed methods in laboratory conditions, assess the antibacterial activ- ity of synthetized materials and compare the properties of the individual materials. Unfor- tunately, due to a state of emergency being declared, the access to school laboratories was restricted, which caused the work to be impossible to finish in time, because some of the proposed methods of synthesis and the tests of release kinetics are fairly time demanding and are not guaranteed to produce satisfactory results at the first attempt. Because of that, the theoretical part of the thesis was expanded instead and includes information regarding silica nanofibers (which were supposed to be used as the carrier for chlorhexidine), their synthesis, properties, and applications. Proposed methods of immobilization might be tested as a part of author’s master thesis, which is going to further expand the topics pre- sented in this work.
Keywords
chlorhexidine, silica nanofibers, immobilization, antibacterial activity, drug-delivery systems
Obsah
1 Úvod ... 11
2 Chlorhexidin ... 12
2.1 Historie využití ... 12
2.2 Chemická struktura ... 13
2.3 Syntéza ... 14
2.4 Mechanismus účinku... 15
2.5 Toxicita a vedlejší účinky ... 18
2.6 Tradiční způsoby využití ... 19
2.7 Současný výzkum a příklady konkrétních aplikací ... 20
2.7.1 Využití cyklodextrinů k imobilizaci CHX ... 20
2.7.2 Napojení CHX na nanovlákna pomocí organokovového cross-linkeru ... 22
2.7.3 Nanoporézní křemičitany schopné pH-responzivního uvolňování CHX ... 24
2.7.4 Imobilizace CHX na zlaté nanočástice ... 27
2.7.5 Využití želatiny k imobilizaci CHG ... 28
3 Křemičitá nanovlákna ... 31
3.1 Syntéza křemičitých nanovláken ... 31
3.1.1 Princip elektrostatického zvlákňování... 31
3.1.2 Parametry zvlákňovacího procesu a jejich vliv na vyprodukovaný materiál... 32
3.1.3 Příprava solu pro syntézu křemičitých nanovláken ... 33
3.2 Vlastnosti křemičitých nanovláken ... 34
3.3 Biodegradace křemičitých nanovláken a její testování ... 35
3.3 Využití křemičitých nanovláken ... 37
3.3.1 Drug-delivery systémy ... 37
3.3.2 Biologické scaffoldy pro tkáňové inženýrství ... 38
3.3.3 Krycí materiály pro léčbu chronických a jiných ran ... 38
4 Závěr ... 40
Seznam použitých zkratek
AFM mikroskopie atomových sil
APTES 3-aminopropyltriethoxysilan
ATP adenosintrifosfát
BMPM 1,1‘-(methylendi-4,1-fenylen)bismaleinimid
CA acetát celulózy
CD cyklodextrin
CD-MA cyklodextrin-methakrylát CHG (di)glukonát chlorhexidinu
CHX chlorhexidin
CTAB cetyltrimethylammoniumbromid
DMF dimethylformamid
DNA deoxyribonukleová kyselina
FDA Food and Drug Administration – Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (americká organizace)
HBMEC lidské mozkové mikrovaskulární endotelní buňky ICP-AES emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem in vitro v laboratorních podmínkách
MALDI-MS hmotnostní spektrometrie s desorpcí iniciovanou laserovým pa- prskem
NČ nanočástice
PEO polyethylenoxid
PLA kyselina polymléčná
PVA polyvinylalkohol
PVP poly(4-vinylpyridin)
RNA ribonukleová kyselina
TEOS tetraethylorthosilikát TGA termogravimetrická analýza
TTE triethanolamintitanát
UV-Vis UV-viditelná spektrofotometrie
1 Úvod
Antiseptika a dezinfekce, tedy látky, sloužící k likvidaci potenciálně nebezpečných mikroor- ganismů na povrchu lidského těla a předmětů, jsou jedním ze základních pilířů moderní medicíny a nenahraditelné jsou zejména při chirurgických zákrocích.
Skutečnost, že rány je třeba udržovat čisté pro jejich správné hojení si uvědomovali již staří Sumerové (na záznamech z hliněných destiček, pocházejících z období přibližně 2150 př. n. l., byly popsány metody péče o povrchová poranění, které zahrnovaly např. vy- mývání rány horkou vodou a pivem či používání obkladů z usazenin ze dna vinných sudů či z ještěrčích exkrementů) či někteří antičtí lékaři (např. Hippokrates zmiňuje důležitost od- straňování hnisu, pokud se v ráně tvoří), avšak až v 19. století je všeobecně přijata myš- lenka, že mnohé zdravotní komplikace, včetně těch vznikajících při hojení špatně ošetřených ran, jsou způsobovány mikroorganismy, zejména bakteriemi [1].
V roce 1867 byl publikován článek Antiseptic Principle of the Practice of Surgery, jehož auto- rem byl britský lékař a chirurg Joseph Lister. Ten vycházel z poznatků v oblasti mikrobiolo- gie učiněných Louisem Pasteurem a přišel s myšlenkou, že operace je potřeba provádět ve sterilním prostředí, aby se zabránilo vzniku infekce [2]. Jako první antiseptikum byla pou- žívána kyselina karbolová, dnes lépe známá jako fenol. Její použití k dezinfekci operované oblasti výrazně snížilo četnost pooperačních komplikací, které předtím nezřídka končily i smrtí pacienta. Lister díky svému objevu získal velký ohlas a vysloužil si přezdívku „otec moderní chirurgie“ [3].
Od těchto pionýrských krůčků uběhlo již 150 let a za tu dobu vznikla celá řada antiseptic- kých prostředků, vyvinutých s cílem maximalizovat jejich účinnost a omezit nežádoucí ve- dlejší účinky. Jedním z nejpoužívanějších antiseptik a desinfektantů se stal chlorhexidin, který nalézá uplatnění v chirurgii, dentální medicíně a mnoha dalších oblastech. S pomocí moderních technologií, zejména nanotechnologií, jsou otevírány stále nové možnosti využití této látky. Jednou z těchto moderních aplikací, která je zároveň tématem této bakalářské práce, je imobilizace chlorhexidinu na křemičitá nanovlákna, která mohou být aplikována přímo do rány a při jejich postupné degradaci se chlorhexidin průběžně uvolňuje a udržuje ránu sterilní i při déletrvajícím hojení.
Teoretická část této bakalářské práce pojednává o chlorhexidinu, jeho vlastnostech, mož- nostech jeho imobilizace a využití. Cílem praktické části je navrhnout několik způsobů imo- bilizace chlorhexidinu na křemičitá nanovlákna a otestovat antibakteriální účinnost a kinetiku uvolňování takto funkcionalizovaných vláken.
2 Chlorhexidin
Chlorhexidin (anglicky chlorhexidine), obvykle využívaný ve formě glukonátu (chlorhexidine gluconate – CHG), je organická látka, která je využívána jako dezinfekční a antiseptický pro- středek. Následující kapitoly rozeberou chlorhexidin z různých hledisek, od historie využití, přes chemickou strukturu, syntézu a vlastnosti, až po aplikace, a to jak dlouhodobě zažité, tak i zcela nové nebo právě vyvíjené.
2.1 Historie využití
Chlorhexidin je v medicíně využíván již více než 70 let. Za dobu jeho používání byla proká- zána jeho efektivita vůči širokému spektru mikroorganismů a také jeho zdravotní nezávad- nost, která činí použití v naprosté většině případů bezpečným [4]. O jeho významu svědčí fakt, že je dnes zapsán na seznamu Model List of Essential Medicines (Modelový seznam esen- ciálních léčiv) Světové zdravotnické organizace (WHO) [5]. Tento seznam obsahuje léčiva, která jsou považována za natolik efektivní a bezpečná, že jsou v moderním lékařství nena- hraditelná. Ačkoliv je tato látka využívána již poměrně dlouhou dobu, v kombinaci s novými technologiemi (ve velké míře s nanotechnologiemi) jsou nalézány stále nové možnosti jeho využití, nebo zvyšována efektivita těch již používaných.
Chlorhexidin byl objeven v 50. letech 20. století vědci britského konsorcia ICI (Imperial Chemical Industries), ve své době největšího výrobce chemických látek (včetně léčiv) ve Spojeném Království. K objevu došlo během vývoje nových prostředků k léčbě a prevenci malárie [6]. V médiích byla látka poprvé zmíněna v roce 1954, kdy ICI vydaly článek na- zvaný „1:6-Di-4'-Chlorophenyldiguanidohexane ("Hibitane"). Laboratory Investigation of a New Antibacterial Agent of High Potency“, ve kterém pojednávají o slibných vlastnostech chlorhexidinu (tehdy nazývaného Hibitan) a jeho možném využití v medicíně [7]. V roce 1954 se také diglukonát chlorhexidinu poprvé objevil na trhu jakožto dezinfekční a antisep- tický prostředek [8].
V 70. letech se chlorhexidin začal používat i ve Spojených Státech a byl proveden výzkum, který prokázal, že látka likviduje 86 až 92 % bakterií přítomných na lidské kůži [9]. V roce 1976 si lidé poprvé uvědomili potenciál, který má chlorhexidin v zubní medicíně, jelikož se ukázalo, že látka dokáže účinně omezovat tvorbu zubního plaku, a to dokonce lépe než ja- kýkoliv jiný do té doby známý prostředek. Navíc se chlorhexidin vyznačoval i vyšší bezpeč- ností s minimem vedlejších účinků [8].
V roce 1981 byl americkým úřadem FDA (U. S. Food and Drug Administration) schválen k použití první urologický lubrikant s chlorhexidinem. O 11 let později, v roce 1992, se
poprvé objevil cévní katétr, impregnovaný touto látkou (společně se sulfazidinem stříbr- ným). Časem se chlorhexidin začal využívat k dezinfekci i dalších lékařských nástrojů, např.
násad na injekční stříkačky. V roce 2005 se začala využívat k předoperační přípravě paci- entů textilie napuštěná 2% roztokem glukonátu chlorhexidinu [4].
V současnosti je chlorhexidin součástí více než 60 léků a léčebných prostředků a ve většině zemí je dostupný i bez lékařského předpisu. Také se objevuje (v malém množství) v komerč- ních produktech, jako jsou dezinfekční prostředky, deodoranty, zubní pasty, ústní vody [10]
apod. Chlorhexidin samotný má mnoho obchodních názvů, mezi něž patří např. Betasept, Hibistat nebo ChloraPrep [11].
2.2 Chemická struktura
Chlorhexidin je zástupcem tzv. bisbiguanidů, což je skupina chemických látek, které obsa- hují dvě biguanidové funkční skupiny. Bisbiguanidy se obecně vyznačují svými baktericid- ními účinky, kromě chlorhexidinu sem patří například také antimikrobiotika alexidin a oktenidin [12] [13]. Chlorhexidin je z nich však nejdéle používaný a nejrozšířenější.
Obrázek 1: Chemická struktura biguanidu. Bisbiguanidy obsahují dvě tyto struktury, navázané přes koncové -NH2 skupiny.
Struktura samotného chlorhexidinu vychází ze dvou jednotek velmi podobných chlorgu- anidu neboli proguanilu (látka, která slouží k léčbě malárie [14]), které jsou spojeny hexa- methylenovým „můstkem“, viz schémata:
Obrázek 2: Chemická struktura proguanilu. Místo červeně vyznačené izopropylové funkční skup.
se na aminoskupinu váže hexamethylenový můstek, spojující dvě tyto struktury dohromady.
Obrázek 3: Chemická struktura chlorhexidinu. Hexamethylenový můstek je vyznačen modře.
2.3 Syntéza
Standardní postup syntézy chlorhexidinu byl patentován v USA v roce 1954 jako patent US2684924 [15]. Patent zahrnuje dva způsoby syntézy, které se liší pořadím kroků. Při prv- ním mechanismu nejprve reaguje dikyanoazanidový anion s hexamethylendiaminem za vzniku 1,1'-(1,6-hexandiyl)bis(3-kyanoguanidinu). Tato sloučenina poté reaguje se dvěma molekulami 4-chloranilinu za vzniku chlorhexidinu. Reakční schéma je znázorněno níže:
Obrázek 4: První způsob syntézy chlorhexidinu. Vytvořeno podle zdroje [15].
Druhá varianta syntézy obnáší záměnu prvního a druhého kroku. Nejprve se tedy váže 4-chloranilin na dikyanoazanid za vzniku 3-(4-chlorfenyl)-1-kyanoguanidinu a dvě tyto struktury jsou spojeny pomocí hexamethylendiaminu na jednu molekulu chlorhexidinu:
Obrázek 5: Druhý způsob syntézy chlorhexidinu. Vytvořeno podle zdroje [15].
Reakce probíhají za teplot přibližně 150 °C.
Místo čistého chlorhexidinu bývá často používán glukonát (resp. diglukonát) chlorhexidinu, který se označuje zkratkou CHG. Formálně se jedná o sůl kyseliny glukonové, která vzniká z glukózy oxidací jedné z koncových hydroxylových funkčních skupin na karboxylovou.
Chemická struktura CHG vypadá následovně [16] (lze se setkat i se vzorcem, ve kterém je glukonát navázaný přímo na chlorhexidin přes =NH skupinu v biguanidu):
Obrázek 6: Běžně uváděná struktura diglukonátu chlorhexidinu [16].
2.4 Mechanismus účinku
Mechanismus účinku lze stručně shrnout tak, že chlorhexidin je díky svému kladnému ná- boji přitahován k buněčné stěně bakterií, která je obvykle záporně nabitá, a způsobuje její narušení, což má za následek vylití obsahu buňky a její smrt [17]. Kromě bakterií vykazuje CHX aktivitu i proti buňkám plísní i jiných mikroorganismů, a dokonce i proti virům, i když v daleko menší míře.
Účinek chlorhexidinu je silně závislý na pH prostředí, přičemž chlorhexidin samotný je silně zásaditý. Aby se účinek vůbec projevil, musí pH dosahovat hodnoty alespoň 3,5. Při překro- čení této hodnoty se chlorhexidin vyskytuje ve formě dikationtu se dvěma kladnými náboji na koncích jeho centrálního hexamethylenového můstku. Nejvyššího účinku je dosaženo při pH v rozmezí 5,5 – 7, což odpovídá pH běžně přítomnému v lidském těle. Na celém rozmezí účinného pH se chlorhexidin vyskytuje téměř výhradně ve formě kationtu či dikationtu, pH tedy neovlivňuje ani tak chlorhexidin samotný, ale spíše buněčné stěny cílových mikroor- ganismů, na kterých se se stoupajícím pH nachází čím dál více záporně nabitých funkčních skupin a iontové interakce s chlorhexidinem jsou tak silnější.
Účinek také výrazně závisí na cílovém mikroorganismu a na koncentraci chlorhexidinu, obecně však probíhá následujícím mechanismem [17]:
1. Kladně nabitá molekula chlorhexidinu je rapidně přitahována k povrchu bakterie, který nese záporný náboj.
2. Dochází k silné adsorpci na složky buněčné stěny, obsahující fosfáty.
3. Díky efektu pasivní difúze dochází k proniknutí chlorhexidinu skrze buněčnou stěnu.
4. Chlorhexidin je přitahován na cytoplazmatickou membránu, která je tvořena dvojvrst- vou fosfolipidů, obsahuje tedy opět negativně nabité fosfátové skupiny. Dochází k prů- niku chlorhexidinu membránou, což vede k jejímu protržení.
5. Trhliny v cytoplazmatické membráně jsou dostatečně velké na to, aby došlo k odchodu některých nízkomolekulárních látek z nitra bakterie. Jedná se především o draselné (K+) ionty, jejichž koncentrace v cytoplazmě bakterie a mimo ni může být za normálních okolností vyrovnávána pouze osmózou. Poškození membrány rovněž vede k inhibici (potlačení) aktivity některých enzymů, jejichž funkce s cytoplazmatickou membránou souvisí.
6. Chlorhexidin způsobí srážení cytoplazmy, protože vytváří komplexy s fosforylovanými sloučeninami, jako je ATP (adenosintrifosfát) či nukleové kyseliny (RNA a DNA). Trans- portní funkce cytoplazmy je tímto narušena a vysrážené částice se nedostávají na místa, kde jsou potřeba. To vede k závažnému narušení funkce jednotlivých bakteriálních or- ganel (ATP slouží jako zdroj energie díky štěpitelným makroergním vazbám a nukleové kyseliny zastávají nezastupitelnou roli v syntéze bílkovin – základních stavebních slo- žek všech buněk, včetně bakterií), které vede ke smrti bakterie.
Působením kladně nabitého chlorhexidinu se původně negativně nabitá buněčná stěna bak- terií rychle stává neutrální a tím se snižuje síla interakce a tím i míra navazování dalších molekul chlorhexidinu. Z tohoto důvodu také chlorhexidin funguje daleko lépe proti Gram-pozitivním bakteriím, jejichž buněčná stěna má výrazně větší záporný náboj, než u Gram-negativních bakterií.
V závislosti na použité koncentraci je účinek na patogenní kmeny buď bakteriostatický (způsobuje pouze inhibici neboli zastavení množení), nebo baktericidní, tedy vedoucí ke smrti mikroorganismů. Obvykle stačí koncentrace cca 10 μg/ml na inhibici Gram-pozitiv- ních bakterií (např. u kmenu Streptococcus mutans je minimální inhibiční dávka (MIC) do- konce pouze cca 1 μg/ml), nejnižší předepisovaná koncentrace však bývá daleko vyšší, okolo 200 μg/ml. Koncentrace potřebná k inhibici Gram-negativních bakterií je obecně vyšší a daleko více závisí na konkrétním bakteriálním kmenu a druhu, většinou však nepře- kračuje 50 μg/ml. Při inhibiční koncentraci nedochází ke srážení cytoplasmy popsaném v bodě 6, pouze k poškození buněčné stěny a vyplavení iontů. Tímto způsobem může bak- terie ztratit až 50 % svých K+ iontů. Dochází rovněž k uvolňování divalentních iontů, zejména vápenatých (Ca2+). Předpokládá se, že tyto ionty pocházejí z buněčné stěny a jsou uvolňovány, když se chlorhexidin naváže na záporně nabité peptidoglykany. Účinek lze zvrátit odstraněním chlorhexidinu z prostředí, ve kterém se bakterie nacházejí.
Při vyšší koncentraci chlorhexidinu dosahuje poškození buněčné stěny takové míry, že umožňuje i průchod větších molekul (např. nukleotidů) z cytoplazmy do okolního prostředí.
Ztráta více než 15 % nukleotidů vede k nevratnému poškození bakterie. Míra poškození bu- něčné stěny stoupá s koncentrací, dokud není rovna 100-500 mg/l, poté dochází ke srážení cytoplazmy a vzniku vypukliny tvořené sraženinou na povrchu bakterie v místě působení, která ucpe trhliny v cytoplazmě. Rychlost absorpce chlorhexidinu také postupně klesá, pro- tože vhodná cílová plocha na povrchu bakterie se postupně zmenšuje.
Stejným způsobem jako na bakterie působí chlorhexidin i na plísně. Buňky plísní rychle vy- chytávají molekuly chlorhexidinu, což vede k narušení jejich buněčné stěny i cytoplazma- tické membrány (buněčná lýze) a úniku obsahu buňky do okolí, čímž buňka umírá. Při zlikvidování dostatečného počtu buněk umírá celé mycelium plísně.
Složitější situace nastává u biofilmů, mezi něž patří např. zubní plak. Biofilmy jsou různo- rodé shluky (agregáty) mikroorganismů rostoucí na pevném podkladu (substrátu). Uvnitř biofilmu dochází k celé škále interakcí mezi různými organismy, které ho tvoří a na jeho povrchu vznikají polymerní struktury, které chrání jeho vnitřní struktury. Z tohoto důvodu je pro většinu antimikrobiálních látek složitější účinně likvidovat mikroorganismy uvnitř biofilmu. Výjimkou není ani chlorhexidin, jehož efektivita vůči již vytvořenému biofilmu je také nižší, dokáže však ztížit mikroorganismům ulpívání na substrátu, proto ho lze využít jako prevenci vzniku a vývoje biofilmů.
Na rozdíl od většiny antimikrobiálních látek se u chlorhexidinu prokázaly jisté účinky i proti jiným formám mikroorganismů. Sem patří např. bakteriální spory (latentní stav, kdy se bak- terie „zapouzdří“ do odolné schránky v reakci na nepříznivé vnější podmínky) či prvoci (jed- nobuněčné eukaryotní organismy, které mohou vystupovat jako parazité a způsobovat různé závažné choroby – příkladem může být Plasmodia neboli zimnička, která je přenášena komáry rodu Anopheles a u člověka způsobuje malárii). In vitro byla dokonce pozorována aktivita vůči tzv. obaleným virům (skupina virů s fosfolipidickou membránou, kam patří např. herpes simplex, který způsobuje jednoduchý opar, virus HIV nebo koronaviry, způso- bující např. nemoci SARS a Covid-19). Míra účinnosti však není dost vysoká na to, aby se chlorhexidin dal využívat jako spolehlivé antivirotikum či přípravek proti prvokům.
Významný vliv na vysokou účinnost chlorhexidinu coby dezinfekce má jeho unikátní schop- nost vázat se na proteiny přítomné v lidských tkáních, např. na kůži nebo sliznice. Pouze nízký podíl chlorhexidinu je vstřebán do těla, zbytek zůstane vázaný na proteiny a postupně se uvolňuje, což prodlužuje dobu účinnosti. Tento jev se označuje jako substantivita. Bylo prokázáno, že chlorhexidin aplikovaný na kůži má antibakteriální účinky po dobu
minimálně 48 hodin. Na rozdíl od jiných dezinfekcí využívaných v lékařství, např. jodova- nému povidonu, není chlorhexidin ovlivněn přítomností tělních tekutin (např. krve).
Při aplikaci v dentální medicíně a hygieně se chlorhexidin dokáže navázat a postupně uvol- ňovat nejen na tkáně a sliznice ústní dutiny, ale dokonce i na povrch zubů, což značně zvy- šuje jeho efektivitu při prevenci vzniku zubního plaku [17].
2.5 Toxicita a vedlejší účinky
Ke značnému rozšíření chlorhexidinu jako antibiotika a antiseptika přispěla skutečnost, že u většiny pacientů nejsou pozorovány žádné závažné vedlejší účinky. Byly však popsány případy alergických reakcí a podráždění kůže, způsobené přípravky obsahujícími chlorhe- xidin [18]. Použití v dentální medicíně a v ústních vodách může vést ke změně barvy zubů, tento efekt je však méně drastický u novějších ústních vod obsahujících kromě CHX také chelatovaný zinek [19]. Chlorhexidin je ototoxický (způsobuje poškození vnitřních částí ucha, zejména sluchově rovnovážného nervu (nervus vestibulocochlearis) a hlemýždě (cochlea)), proto ho nelze využít při operacích ucha. Při vniknutí do vnitřního ucha (za ušní bubínek) může způsobit až ztrátu sluchu [20].
V současné době se také vedou diskuse o možné karcinogenitě chlorhexidinu při dlouhodo- bém pravidelném užívání, ta však dosud nebyla prokázána. FDA přesto doporučuje nepou- žívat ústní vody s chlorhexidinem po dobu delší než 6 měsíců [21].
Byl zaznamenán případ, kdy vysoká koncentrace chlorhexidinu v plicích vedla ke vzniku syndromu akutní respirační tísně (ARDS – Acute Respiratory Distress Syndrome), což způ- sobilo smrt zasažené osoby. Obětí byla osmdesátiletá seniorka trpící demencí, která nedo- patřením pozřela 200 ml přípravku Maskin, který obsahuje 5 % glukonátu chlorhexidinu.
Při následném dávení/zvracení nejspíše došlo ke vniknutí obsahu žaludku do dýchacího ústrojí, odkud se chlorhexidin vstřebává do těla mnohem snadněji než z trávicího traktu [22]. Jedná se však o ojedinělý incident, díky špatnému vstřebávání obvykle pozření chlorhexidinu nevede k závažným komplikacím.
Jedním ze závažných a nedávno potvrzených problémů je však spojitost chlorhexidinu s anafylaktickým šokem při jeho použití v chirurgii [23]. Anafylaktický šok je akutní forma alergické reakce, která se projevuje svědivou vyrážkou, otoky (které mohou vést až k zablo- kování dýchacích cest a udušení) a nebezpečným snížením krevního tlaku. Obvykle bývá vyvolán potravinami nebo hmyzím štípnutím, mohou ho však způsobit i léky. V současnosti je anafylaktický šok nejčastější příčinou komplikací a úmrtnosti, spojených se samotným průběhem operace. V roce 2019 byly publikovány závěry 6. národního auditu (NAP6)
provedeného britskou lékařskou odbornou organizací The Royal College of Anaesthetists, které prokázaly, že ve Velké Británii je chlorhexidinu během operativního zákroku vysta- veno až 73,5 % pacientů [23]. Alarmující je skutečnost, že chlorhexidin se ukázal být třetí nejčastější příčinou perioperativního (objevujícího se přímo během operace) anafylaktic- kého šoku, přičemž jen ve velmi malém procentu případů lékaři dokázali správně identifi- kovat chlorhexidin jako příčinu komplikací. Průzkum provedený během auditu, kterého se zúčastnilo 34 anesteziologů s různou mírou profesních zkušeností, prokázal, že přes 20 % respondentů považuje chlorhexidin za vzácnou příčinu perioperativního anafylaktického šoku a pouze 6 % z nich dokázalo správně identifikovat příznaky zvýšené citlivosti pacienta na chlorhexidin. Povědomí o spektru lékařských přípravků obsahujících chlorhexidin také nebylo uspokojivé, přestože jich audit na lékařských pracovištích identifikoval celou řadu.
Závěry auditu byly použity k proškolení lékařských pracovníků o rizikách spojených s chlorhexidinem a byl sestaven seznam lékařských přípravků, které je bezpečné použít pro pacienty se zvýšenou citlivostí na tuto látku.
Poznámka autora: Závěry tohoto výzkumu potvrdily význam přesně cílených nosičů chlorhexidinu na bázi nanočástic a nanovláken, jelikož při jejich použití je možné výrazně snížit nepotřebný kontakt této látky s organismem a tím i riziko vzniku alergické reakce.
2.6 Tradiční způsoby využití
Tato kapitola zahrnuje aplikace chlorhexidinu známé a používané již delší dobu, při kterých navíc látka obvykle není vázaná na žádný speciální nosič (např. na nanočástice nebo nano- vlákna) ale používá se ve formě roztoku, prášku nebo jako součást léčebného přípravku.
Chlorhexidin je tradičně využíván zejména k ošetření kůže pacienta před operací, k dezin- fekci rukou lékaře provádějícího zákrok nebo ke sterilizaci lékařských nástrojů [24]. Speci- fické využití má chlorhexidin v zubní medicíně, kde slouží k ošetření otevřených ran v dutině ústní (např. po extrakci zubu) a někdy se také využívá k prevenci vzniku zubního plaku a k léčbě kvasinkových infekcí v ústech [25]. Kromě toho lze prostřednictvím chlorhe- xidinu (někdy využívajícího nanomateriálové nosiče) zabránit infekci při zavádění katetru do močové trubice při proceduře zvané cévkování (anglicky urinary catheterization) a udr- žovat ho průchozí [26].
Chlorhexidin je používán i ve veterinární medicíně. Zde slouží například k léčbě kožních onemocnění. U psů se používá jednak při onemocnění dásní a také k periodickému čištění ušní dutiny u plemen, která mají dlouhé svěšené ušní boltce. Důvodem je, že tento tvar ome- zuje cirkulaci vzduchu okolo ušního otvoru a činí vnitřek ucha vlhkým, temným prostorem, ideálním k množení bakterií [27].
Chlorhexidin měl význam i při epidemii ptačí chřipky v prvním desetiletí 21. století, způso- bované virem H5N1. Klinické studie společnosti Skinvisible prokázaly, že dezinfekce na ruce s touto látkou dokáže deaktivovat či přímo zlikvidovat virus H5N1 po významně delší dobu po aplikaci než jiné dezinfekční prostředky, např. na bázi alkoholu [28]. Chlorhexidin byl také zmíněn jako možný přípravek pro ošetření drůbeže s cílem zamezit šíření této nákazy [27].
V posledních letech roste význam chlorhexidinu v rozvojových zemích se špatnou zdravotní péčí. V Nepálu se v jako první zemi na světě začal chlorhexidin využívat k ošetřování ran po přerušení pupeční šňůry u novorozených dětí. Posouzení provedené v roce 2015 britskou organizací Cochrane prokázalo, že tato praktika vedla ke snížení výskytu novorozenecké omfalitidy (zánětu pahýlu po pupeční šňůře) o 50 % a celkově se zasloužila o snížení úmrt- nosti nepálských novorozenců o 12 % [29].
2.7 Současný výzkum a příklady konkrétních aplikací
Tato kapitola obsahuje příklady využití chlorhexidinu, která jsou předmětem aktuálního nebo nedávného výzkumu a většina informací je přebraná z článků z vědeckých časopisů.
Obvykle je využíváno speciálních nosičů, nezřídka na bázi nanotechnologií, která umožňují přípravek efektivně dopravit do cílového místa a omezit kontakt s okolní tkání a možné ne- žádoucí účinky s ním spojené nebo ho průběžně uvolňovat a tím zajistit dlouhotrvající anti- bakteriální efekt, např. během hojení pooperačních ran.
2.7.1 Využití cyklodextrinů k imobilizaci CHX
V roce 2016 tým pod vedením doktora Markuse J. Kettela z německého Leibniz Institute for Interactive Materials e. V. and Textile and Macromolecular Chemistry připravil nanogel na bázi PMMA (polymethylmethakrylátu) obsahující chlorhexidin, který může sloužit jako an- timikrobiální povlak k ošetření povrchů [30]. K imobilizaci chlorhexidinu byl použit cyk- lodextrin, což je cyklický oligosacharid, sestávající z různého počtu (obvykle 6-8) glukózových jednotek. α-, β- a γ-cyklodextrin (o počtu 6,7 a 8 glukózových jednotek) byl převeden na cyklodextrin-methakrylát (CD-MA) reakcí cyklodextrinu s methakryloylchlo- ridem v dusíkové atmosféře s využitím takzvané Schlenkovy aparatury, která umožňuje provádět reakce sloučenin citlivých na vzdušnou vlhkost [31]. Vzniklý CD-MA posloužil spolu s methylmethakrylátem (MMA) a N,N-methylen-bisakrylamidem, (který sloužil jako cross-linker) k přípravě nanogelu. Byla využita heterogenní polymerizace, produkt byl tedy nerozpustný v roztoku monomerů a během polymerizace se srážel v reakční směsi. Jako ini- ciátor posloužil azobisizobutyronitril (AIBN). Připraveno bylo několik vzorků, které se lišily typem a zastoupením navázaného cyklodextrinu. K připravenému nanogelu byl přidán
roztok chlorhexidinu v acetonu o hmotnostní koncentraci 2,08 g/l. Směs byla promíchávána 24 hodin, během kterých došlo k odpaření rozpouštědla. Po vysrážení a odfiltrování neza- komplexovaného CHX bylo množství imobilizovaného chlorhexidinu vyhodnoceno spektro- fotometricky. Následovaly testy uvolňování chlorhexidinu z nanogelu. Pro tyto účely byl gel nanesen na skleněné destičky o ploše 225 mm2. Testováno bylo uvolňování do destilované vody a do izotonického roztoku pufru o pH 7,4, který simuloval podmínky panující v krev- ním řečišti. V intervalu 30 minut byla koncentrace uvolněného CHX vyhodnocována foto- metricky. Stejné vzorky na skleněném podkladu byly také umístěny do Petriho misek s koloniemi zlatého stafylokoka (Staphylococcus aureus) pro otestování antibakteriální ak- tivity nanogelu.
Výsledky ukázaly, že nejlépe komplexovat chlorhexidin dokáže nanogel nesoucí β-cyklode- xtrin (7 glukózových jednotek). Ve vodném prostředí bylo uvolňování rychlejší než v roz- toku pufru a do 240 minut se ze všech vzorků uvolnilo téměř 100 % původního množství.
V roztoku pufru bylo uvolňování pomalejší, do 240 minut se uvolnilo pouze okolo 60 % na- vázaného CHX z gelu s β-cyklodextrinem, okolo 40 % z gelu s α-cyklodextrinem a méně než 30 % z gelu s γ-cyklodextrinem a uvolňování v čase dále poměrně stabilně pokračovalo v řádu jednotek mikrogramů CHX na 1 ml kapaliny během 30 minut. Všechny tři typy vzorků byly také schopné potlačit růst bakteriálních kolonií zlatého stafylokoka, čímž byla proká- zána jejich antibakteriální účinnost. Experiment prokázal, že imobilizace chlorhexidinu po- mocí cyklodextrinu může být dobrou cestou k přípravě materiálů s kontrolovaným dlouhodobým uvolňováním tohoto antibiotika [30].
Pozitivem použití cyklodextrinů je skutečnost, že jsou kompatibilní se širokou škálou cross- linkerů a je tak možné je připojit na mnoho různých nosičů. Jednou z možností je i využití křemičitých nanovláken, která mají tu výhodu, že jsou biokompatibilní a v organismu se ča- sem vstřebávají (podrobněji viz kapitola 3 – Křemičitá nanovlákna). K připojení cyklodex- trinu na křemičitá nanovlákna je nutné ho nejprve modifikovat pomocí p-toluensulfonylchloridu (také známého pod názvem tosylchlorid). Tato sloučenina může reagovat s hydroxylovou skupinou na cyklodextrinu a za odštěpení HCl se na něj návazat.
Tosylát je dobře odstupující funkční skupina a k připojení takto modifikovaného cyklodex- trinu na nosič lze tak využít substituci nukleofilní [32]. Vhodným cross-linkerem pro tuto funkcionalizaci je tzv. APTES neboli (3-aminopropyl)triethoxysilan. Ten je svou strukturou podobný tetraethylorthosilikátu (TEOS) který se využívá k syntéze křemičitých nanostruk- tur, jedna z ethoxylových skupin je však nahrazena propylenovým řetězcem nesoucím na svém konci –NH2 skupinu. Díky své podobnosti s TEOS lze APTES zakomponovat do struk- tury křemičitých nanočástic nebo nanovláken, čímž na jejich povrch zaneseme uhlíkaté
řetězce zakončené aminoskupinou. K optimalizaci vznikající povrchové struktury je vhodné reakci křemičitého povrchu s APTES provádět při teplotě okolo 70 °C [33]. Substituční re- akcí, ve které aminoskupina vystupuje jako nukleofil, lze poté připojit cyklodextrin modifi- kovaný tosylátem na konec těchto uhlíkových řetězců. Popsaný proces znázorňuje schéma níže:
Obrázek 7: Schéma postupu připojení cyklodextrinu (CD) na křemičité nanostruktury („Silika“
značí křemičitý nanomateriál, který je funkcionalizován). Vytvořeno podle zdrojů [30],[32],[33].
2.7.2 Napojení CHX na nanovlákna pomocí organokovového cross-linkeru
Vědci z Massachusetts Institute of Technology (MIT) vyrobili metodou elektrostatického zvlákňování vlákna o tloušťce v řádu desítek až stovek nm, která na sobě nesou navázaný CHX připojený pomocí cross-linkeru [34]. Jako rozpouštědlo pro zvlákňovaný roztok byl zvolen dimethylformamid (DMF), protože dokáže dobře rozpouštět jak acetát celulózy, tak práškový CHX. Roztok CA v DMF obvykle postrádá elasticitu potřebnou ke zformování stej- noměrných vláken a pokus o elektrostatické zvláknění v takovém případě místo toho vede ke vzniku kapek. Tento problém byl vyřešen na základě výzkumu jiného vědeckého týmu, který přišel na to, že přidání malého množství vysokomolekulárního polyethylenoxidu (PEO) vede k výraznému zvýšení elasticity a umožňuje správné zformování vláken během zvlákňování [35]. Bylo připraveno několik roztoků o různé koncentraci PEO a jejich vlast- nosti byly otestovány rheometrem k nalezení možných souvislostí mezi vlastnostmi roz- toků a z nich vzniklých vláken.
K připojení CHX k CA vláknům byl použit cross-linker Tyzor®
TE, což je organický triethanolamintitanát (TTE), který se ob- vykle používá při výrobě pojiv, ropných produktů a textilu [36].
Roztok TTE byl smíchán s práškovým CHX ve hmotnostním po- měru 8:1, výsledkem byla nažloutlá homogenní suspenze.
Obrázek 8: Struktura cross- linkeru TTE. Vytvořeno
podle zdroje [34].
Přidáním malého množství vody a ohřevem směsi na 70 °C bylo urychleno vázání CHX na TTE, což se navenek projevilo změnou barvy nejprve na čirou a poté na narůžovělou spolu s výrazným nárůstem viskozity – produkt měl pastovitou konzistenci. Formálně se jedná o transesterifikační reakci mezi jednou z aminoskupin na CHX a TTE. Za podobných podmí- nek je možné připojit TTE na jednu z hydroxylových skupin, nacházejících se na povrchu acetátu celulózy. Pomocí TTE lze tedy vytvořit kovalentní spoj mezi strukturními jednot- kami obsahujícími hydroxylové skupiny a molekulou chlorhexidinu. To je možné provést před zvlákňováním, nebo lze tímto způsobem ošetřit již připravená CA vlákna.
Následné testy na bakteriálních koloniích kultivovaných na agaru (použity byly bakteriální kmeny Escherichia coli a Staphylococcus epidermidis) ukázaly, že pokud nejsou vlákna před použitím promyta vodou, obsahují nezanedbatelné množství nenavázaného CHX, který se díky difúzi uvolní a způsobí vznik inhibiční zóny (prstenec, ve kterém je díky antibiotiku zamezen růst bakteriální kolonie) okolo vzorku. Pokud je volný CHX odstraněn, vznik inhi- biční zóny není pozorován, bakterie v přímém kontaktu se vzorkem jsou však usmrceny CHX navázaným přes cross-linker. Vzorky obsahující 8,1 hm. % navázaného CHX dokázaly za 1 hodinu usmrtit 99,1 % bakterií E. coli a až 99,9 % bakterií S. epidermidis, které s nimi přišly do kontaktu. Z toho plyne, že CA vlákna s navázaným CHX mají baktericidní účinky, které mohou přetrvávat i dlouho po uvolnění nenavázaného CHX z jejich struktury [34].
Postup použitý v tomto experimentu by teoreticky mělo být možné opakovat i s jinými na- novlákny nesoucími na svém povrchu hydroxylové (-OH) funkční skupiny, včetně křemiči- tých nanovláken.
Obrázek 9: Schéma připojení CHX na CA vlákna pomocí TTE. CA v kroužku znázorňuje průřez po- lymerního vlákna, Ti(OR)4 je TTE. Vytvořeno podle zdroje [34].
2.7.3 Nanoporézní křemičitany schopné pH-responzivního uvolňování CHX
Vědecký tým sestávající z pracovníků dvou různých univerzit v Hannoveru vytvořil pH-re- sponzivní systém uvolňování chlorhexidinu z křemičitých nanoporézních nanočástic pro aplikaci ve stomatologii. Myšlenka spočívá v tom, že bakterie v počínajícím zánětu produ- kují metabolity, které snižují pH prostředí a pH-responzivní systém by tak uvolnil antibio- tikum pouze, je-li to skutečně potřeba [37].
Postupem založeným na proceduře navržené A. Neumannem a jeho spolupracovníky byly syntetizovány nanoporézní křemičité nanočástice s nízkou polydisperzitou se středním průměrem cca 40 nm [38]. Průměr pórů dosahoval velikosti přibližně 3,6 nm a celkový ob- jem pórů byl 1,1 cm3 na 1 g nanočástic. Již ze syntézy na povrchu tyto nanočástice nesly aminopropylové skupiny, na které byl následně navázán bismaleinimidový cross-linker BMPM. Přes druhý konec cross-linkeru byl připojen poly(4-vinylpyridin) (PVP), což je po- lymer citlivý na pH prostředí.
Obrázek 10: Modifikace nanoporézních částic (NČ) pomocí cross-linkeru BMPM a pH-senzitiv- ního polymeru PVP. Vytvořeno podle zdroje [37].
Takto modifikované nanočástice byly umístěny do vody a do zředěné kyseliny chlorovodí- kové, aby byla otestována reakce na různé hodnoty pH. V neutrálním vodném prostředí byl naměřen průměr modifikovaných nanočástic cca 100 nm s lehce zvýšenou polydisperzitou v porovnání s nemodifikovanými částicemi. Ve zředěné kyselině chlorovodíkové (prostředí s pH = ~4) byl pozorován výrazný nárůst velikosti, průměr částic dosahoval až 250 nm.
Tento jev byl připsán napřímení řetězců PVP díky naprotonování jejich pyridinových jed- notek (těch, které nebyly vázané cross-linkerem k nanočástici) způsobenému kyselým pro- středím a elektrostatickému odpuzování, díky kterému se zároveň snížila míra shlukování (aglomerace) částic. Napřímení polymerních řetězců také znamená otevření pórů v nano- částici, což umožňuje uvolnění léčiva v nich neseného, což byl v tomto případě právě chlorhexidin.
Obrázek 11: Schéma mechanismu pH-responzivního uvolňování CHX z funkcionalizovaných na- nočástic. Šedomodře je znázorněna nanoporézní částice, zeleně molekuly CHX a červeně povr-
chové řetězce PVP. Vytvořeno podle zdroje [37].
Ke vpravení chlorhexidinu do nanoporézních částic posloužil vysoce koncentrovaný roztok diglukonátu chlorhexidinu (c = 118 mmol/l), který je dobře rozpustný ve vodě. Aby byl umožněn přechod chlorhexidinu z roztoku do pórů, bylo nutné je otevřít snížením pH.
K tomu posloužil přídavek kyseliny D-glukonové, pomocí které bylo pH upraveno na hod- notu 3. Částice byly v roztoku ponechány 3 dny. Termogravimetrickou analýzou (TGA) bylo poté určeno, že částice obsahují 24 hm. % CHX. Stejný proces byl vyzkoušen s dichloridem chlorhexidinu, ovšem s daleko méně uspokojivými výsledky (přesné hodnoty autoři neuvá- dějí).
Při testování kinetiky uvolňování při pH = 7,4 (hodnota přibližně odpovídající pH krve) se během prvních pár hodin uvolnilo cca 220 μg CHX na mg částic (tzv. burst release) a poté se uvolňování téměř zastavilo. V kyselém pH (okolo hodnoty 4,0) bylo skokově uvolněné
počáteční množství zvýšeno na přibližně 260 μg CHX na mg částic, ale celkový průběh uvol- ňování byl plynulejší a malé množství antibiotika bylo z částic uvolňováno i po několika dnech. Skokově vyšší uvolňování na počátku experimentu bylo připsáno uvolnění molekul CHX, které nebyly zachyceny uvnitř pórů, ale adsorbovány na povrchu částic a polymerního obalu. Před dalšími experimenty proto byly částice důkladně promývány.
Celkově se tedy ukázalo, že uvolňování antibiotika za fyziologického pH je velmi pomalé, ovšem rychlost výrazně narůstá při snížení pH, které může být jedním z důsledků bakteri- ální infekce. Další experiment prokázal, že pokud se později pH vrátí zpátky na hodnotu okolo 7,4, rychlost uvolňování se opět výrazně sníží, proces je tedy reverzibilní a po odstra- nění infekce tak není organismus zatěžován zbytečným uvolňování dalšího chlorhexidinu.
Další test se zabýval cytokompatibilitou vytvořeného drug-delivery sytému. Bylo zjištěno, že samotné křemičité nanočástice nijak výrazně neomezují metabolickou aktivitu buněk (konkrétně byl testován efekt na gingivální fibroblasty, tedy buňky tvořící tkáně dásní), ovšem nanočástice obsahující chlorhexidin (avšak bez povrchové polymerní úpravy) akti- vitu výrazně omezují (což značí poškození buněk) při koncentraci vyšší než 25 μg/ml. Čás- tice s pH-senzitivní polymerní úpravou, které navíc byly týden promývány v roztoku pufru o pH 7,4 výrazně nepoškozovaly buňky až do koncentrace 200 μg/ml. Při zkrácení doby promývání na 8 hodin byla maximální akceptovatelná koncentrace 50 μg/ml.
Pro test antibakteriální aktivity byly vybrány kmeny Streptococcus mutans (který způsobuje zubní kaz a je acidogenní, tedy jeho metabolismus produkuje kyseliny snižující pH pro- středí) a Staphylococcus aureus (který často způsobuje infekce po náhradě zubu implantá- tem, ale oproti S. mutans není výrazně acidogenní). Ukázalo se, že nanoporézní částice s polymerní úpravou nesoucí CHX dokážou již při koncentraci 5 μg/ml téměř dokonale inhi- bovat bakterie v tvořícím se biofilmu (proti plně vyzrálému biofilmu však byly neúčinné, což se dalo očekávat, jelikož vyvinuté biofilmy jsou velmi odolné vůči antiseptickým lát- kám), snižujíce jejich metabolickou aktivitu až o 95 %. Po promytí k odstranění CHX adsor- bovaného na povrchu sice znatelně klesla účinnost při koncentracích 5–10 μg/ml, při koncentraci 20 μg/ml a vyšší však zůstala téměř nezměněna a tyto hodnoty jsou stále hlu- boko pod maximální koncentrací snesitelnou buňkami dásně (viz výše). K inhibici však při všech testech docházelo u obou bakteriálních kmenů, přestože S. aureus není acidogenní a pH prostředí při experimentu nekleslo pod hodnotu 6. Toto zjištění naznačuje, že CHX se z nanočástic pravděpodobně do značné míry uvolňuje i když jsou póry „zavřené“ (možným zdrojem jsou i molekuly adsorbované na povrchu polymeru) a strukturu polymerního obalu je tak potřeba zdokonalit. Dalším potenciálním problémem může být skutečnost, že efekti- vita chlorhexidinu se snižuje s klesajícím pH (viz Mechanismus účinku), což by mohlo vést
k nutnosti použít vyšších koncentrací k dosažení požadovaného účinku. Základní princip to- hoto drug-delivery systému je však funkční a použité materiály a metody jsou snadno do- stupné, proto je očekáván další výzkum v této oblasti [37].
2.7.4 Imobilizace CHX na zlaté nanočástice
Doposud zmíněné metody imobilizace chlorhexidinu většinou využívaly jako nosič nějakou formu polymeru nebo křemičitany. Zcela jiným materiálem, který rovněž může posloužit jako nosič chlorhexidinu, jsou zlaté nanočástice. Mezinárodní tým amerických, malajských a pákistánských vědců prozkoumal potenciál nanočástic kovů konjugovaných s chlorhexidi- nem jako možný prostředek pro léčbu keratitidy (zánětu rohovky) způsobené měňavkovi- tým prvokem rodu Acanthamoeba [39]. Tato nemoc bývá spojena s nevhodným používáním kontaktních čoček (nedostatečně častá výměna, špatná hygiena apod.) a může vést až k osle- pnutí. Glukonát chlorhexidinu se ukázal být vhodným prostředkem pro léčbu tohoto one- mocnění, jeho aplikace běžným způsobem však vyžaduje použití koncentrací potenciálně fatálních i pro buňky, na kterých měňavka parazituje [40]. Vědci se proto obrátili na zlaté nanočástice jako na vhodný nosič léčiva, zvyšující jeho účinnost.
K syntéze zlatých nanočástic byl využit roztok chloridu zlatitého (AuCl3), který byl smíchán s roztokem chlorhexidinu o stejné koncentraci a umístěn na třepačku. Po 10 minutách byl přidán tetrahydridoboritan sodný (NaBH4), čímž došlo k vyredukování zlata z chloridu. Re- akce se projevila změnou barvy roztoku na sytě červenou, což obvykle značí vznik zlatých nanočástic o průměru několika desítek nm. Roztok byl další 2 hodiny promícháván.
Pomocí UV-viditelné spektrofotometrie (UV-Vis) bylo potvrzeno, že produktem syntézy jsou skutečně nanočástice zlata. Dále byla využita hmotnostní spektrometrie využívající de- sorpci iniciovanou laserovým paprskem (MALDI-MS) která identifikovala produkt jako komplex chlorhexidinu konjugovaného se zlatem. Pomocí mikroskopie atomových sil (AFM) byla změřena velikost nanočástic tohoto komplexu, která se pohybovala v rozmezí 20 až 100 nm.
K otestování amébocidního účinku byly využity měňavky druhu Acanthamoeba castellanii.
Několik vzorků 0,5 ml roztoku, z nichž každý obsahoval přibližně 106 měňavek, bylo inku- bováno s různou koncentrací zlatých nanočástic konjugovaných s CHX (koncentrace se po- hybovala od 1 μM až po 20 μM). Pro porovnání byla jedna kultura inkubována také s čistým nekonjugovaným chlorhexidinem. Poslední vzorek byl kontrolní a neobsahoval žádné na- nočástice ani antibiotikum. Inkubace probíhala při teplotě 37 °C (přibližně teplota lidského těla) po dobu 48 hodin. Množství měňavek v jednotlivých vzorkách bylo poté určeno pomocí hemocytometru.
Podobná sada testů zopakována s kulturou lidských mozkových mikrovaskulárních endo- telních buněk (HBMEC), naočkovaných měňavkami stejného druhu jako v předchozím testu. Inkubace tentokrát probíhala po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého. Negativní kontrolní vzorek obsahoval pouze kulturu HBMEC, kontrolní vzorek představující 100% buněčnou smrt byl vytvořen pomocí přípravku Triton X-100, kterým byla provedena buněčná lýze. Cílem tohoto testu bylo porovnat, jak velký podíl bu- něčné populace měňavky zlikvidují svými cytotoxickými účinky bez aplikace antibiotika, při aplikaci nekonjugovaného CHX a při aplikaci zlatých NČ s konjugovaným CHX.
Testy prokázaly, že zlaté částice nesoucí CHX mají poměrně silné amébocidní účinky. Kon- centrace 5 μM stačila k inhibici růstu a množení měňavek a značně zredukovala jejich množ- ství – po 48hodinové inkubaci se ve vzorku nacházelo již pouze 40 % původního množství.
Nekonjugovaný chlorhexidin o stejné koncentraci neměl tento inhibiční účinek a po 48 ho- dinách ve vzorku přežilo celých 60 % původního množství měňavek, o 20 % více než u zla- tých nanočástic konjugovaných s CHX. Koncentrace 7,5 μM nanočástic stačila ke snížení populace měňavek na pouhých 10 %, zatímco samotný CHX o stejné koncentraci ji zreduko- val pouze na 25 %. Ukázalo se také, že při aplikaci nanočástic s CHX přežije po 18 hodinách okolo 80 % buněk vystavených měňavkám, ale pouze 40 % buněk ošetřených samotným chlorhexidinem (pro porovnání: bez jakéhokoliv ošetření přežilo po stejné době pouze 10 % buněk).
Na základě výsledků testů lze říct, že amébocidní účinky chlorhexidinu stoupnou, pokud je konjugovaný se zlatými nanočásticemi. To vede k účinnějšímu potlačení populace měňavek, což umožňuje přežít daleko většímu podílu hostitelských buněk. Zlaté nanočástice jsou v moderní době slibným kandidátem pro využití jako nosiče léčiv, což je dané jejich nízkou cytotoxicitou a schopností zvýšit účinnost jimi nesených látek, ať již díky jejich přesnějšímu zacílení, nebo jejich chemické stabilizaci, která jim umožní zůstat déle aktivní.
2.7.5 Využití želatiny k imobilizaci CHG
Jinou možností k vytvoření systému kontrolovaného uvolňování chlorhexidinu je využití že- latiny, kterou tvoří zejména hydrolyzovaný kolagen (fibrilární bílkovina). Touto metodou se zabýval jihoamerický tým pod vedením N. Ricarda a F. G. de Souzy, složený ze zástupců tří brazilských univerzit. Imobilizace diglukonátu chlorhexidinu na želatinu byl první krok v návrhu drug-release systému založeného na hydrofobním nosiči, který by mohl umožnit pomalejší a dlouhodobější uvolňování chlorhexidinu než běžně využívané hydrofilní nosiče.
Systém by mohl usnadnit léčbu periodontitidy, pokročilého zánětu dásní bakteriálního pů- vodu, který může vést až ke ztrátě zubů a ústupu gingivální (dásňové) tkáně. Proti
podobným zánětlivým onemocněním se chlorhexidin již řadu let využívá, forma jeho apli- kace a zajištění dlouhodobého postupného uvolňování však stále zůstávají problematic- kými, obzvláště v ústní dutině, kde je antimikrobiotikum neustále vystaveno působení slin a díky polykacímu reflexu, konzumaci potravin a mluvení může rychle docházet k rapid- nímu poklesu jeho koncentrace [41].
Na trhu již existují prostředky využívající želatinové hmoty k imobilizaci chlorhexidinu a jeho lokálnímu uvolňování. Jedním z nich je PerioChip®, biodegradabilní přípravek vklá- daný na postižené místo, který obsahuje 2,5 mg chlorhexidinu zakomponovaného do žela- tinového nosiče. Tento přípravek však není bez svých nedostatků. Jedním z nich je skutečnost, že okolo 40 % neseného chlorhexidinu, který není pevněji navázán v želatinové hmotě, je uvolněno během prvních 48 hodin po aplikaci (tzv. burst release, tento jev byl již zmíněn v kapitole 2.7.2) [42]. Potenciál ke zlepšení této technologie nabízejí polyestery, které v organismu podléhají pomalé biodegradaci, vykazují vysokou permeabilitu pro mnoho léčiv a nízkou toxicitu. Proběhlo již několik pokusů k zapouzdření chlorhexidinu do podobných polymerních nosičů s využitím emulze, problém však vyvstává s nekompatibili- tou velmi hydrofilního chlorhexidinu se spíše hydrofobními polyestery [43] [44]. Popiso- vaná metoda brazilského týmu navrhuje využít želatinu k imobilizaci chlorhexidinu a získaný želatinovo-chlorhexidinový prášek zakomponovat do jiného polymerního (např.
polyesterového) nosiče prostým vmícháním do taveniny (tzv. melt blending či melt mixing).
To by představovalo poměrně levný a jednoduchý způsob výroby systému schopného po- malého uvolňování chlorhexidinu po delší časový interval než při využití samotné želatiny.
K testování byly připraveny tři vzorky s různým obsahem CHG. Základ každého z nich tvo- řilo 10 g želatinového prášku, který byl rozpuštěn ve vodě a doplněn na 50 ml. Do prvního vzorku bylo přidáno 15 ml roztoku 20% CHG (přibližně odpovídá 3 gramům čistého CHX a 23,1 obj. % vzniklého roztoku), do druhého bylo přidáno 25 ml roztoku CHG (5 g CHX, 33,3 obj. %) a do třetího 50 ml roztoku CHG (10 g CHX, 50 obj. %). Roztoky byly umístěny na 24 hodin do lednice, poté prošly lázní s tekutým dusíkem, a nakonec byly lyofilizovány k odstranění přebytečné vody (doba lyofilizace závisela na obsahu CHX ve vzorku – 30 h pro vzorek s 3 gramy CHX, 24 h pro vzorek s 5 g CHX a 18 h pro vzorek s 10 g CHX. Výsledný materiál byl rozdrcen a prosíván sítem o průměru oka 100 μm, čímž byl získán jemný prášek želatiny s imobilizovaným CHX.
Pomocí TGA bylo následně zjištěno, že želatinový prášek s imobilizovaným CHX je stabilní až do teploty přibližně 130 °C. Tato informace je důležitá pro případnou inkorporaci do ji- ného polymeru pomocí melt blending metody (pro porovnání, čistý CHX je stabilní do tep- loty cca 160 °C). Pomocí FTIR (Infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací)
bylo také dokázáno, že vzorky skutečně obsahují navázaný chlorhexidin pomocí charakte- ristické transmitance N-H vazby.
Následně byly se všemi třemi vzorky provedeny antibakteriální testy na bakteriálních kolo- niích na agaru. K testům byly vybrány bakterie Aggregatibacter actynomicetemcomitans a Porphyromonas gingivalis, které patří mezi nejčastější původce periodontických onemoc- nění. Všechny tři vzorky způsobily formaci inhibiční zóny, což značí antibakteriální aktivitu, přičemž účinnější byly přípravky proti bakterii P. gingivalis. Experiment dokázal, že želatinu lze použít jako prostředek schopný imobilizovat a následně uvolňovat CHX a lze očekávat další výzkum, který se bude zabývat zakomponováním vytvořeného želatinového prášku do jiného polymeru a studiem kinetiky uvolňování CHX z takto vytvořeného systému.
Vyzkoušená imobilizace CHX na želatinu je poměrně levná a snadno proveditelná metoda, která navíc nevyžaduje využití organických rozpouštědel, jejichž rezidua by se mohly z ma- teriálu uvolňovat a působit nepříznivě na organismus.
Poznámka:
Informace uvedené v této kapitole a jejích podkapitolách představují pouze průřez součas- ným výzkumem, který se zabývá imobilizací chlorhexidinu na různé nanomateriálové no- siče a využitím takto funkcionalizovaných materiálů k různým medicínským aplikacím.
Vybírány byly přednostně metody navzájem se co nejvíce lišící povahou nosiče nebo způso- bem imobilizace CHX a bylo bráno v potaz i to, zda by je bylo možné modifikovat k využití křemičitých nanovláken nebo jiných křemičitých materiálů jako nosiče.
3 Křemičitá nanovlákna
Křemičitá nanovlákna (anglicky silica nanofibers, kde termín silica obecně označuje che- mické struktury a minerály založené na oxidu křemičitém (SiO2) s minimálním obsahem vody [45]) jsou jednodimenzionální nanostruktury (mají jeden makroskopický rozměr, ostatní jsou v řádu nanometrů), které mají širokou škálu potenciálních využití, zejména v medicíně a tkáňovém inženýrství. K tomu je předurčuje jejich biokompatibilita a schop- nost degradace v organismu bez vzniku zdraví škodlivých produktů [46]. Tyto výhodné vlastnosti také vedly k výběru křemičitých nanovláken jako vhodného nosiče chlorhexidinu pro tuto práci.
3.1 Syntéza křemičitých nanovláken
3.1.1 Princip elektrostatického zvlákňování
Nejběžnější metodou syntézy křemičitých nanovláken je tzv. elektrostatické zvlákňování (v angličtině známé jako electrospinning). Jedná se o metodu, při které vznikají vlákna z proudu polymerního roztoku usměrňovaného elektrickým polem. Jako výchozí materiál běžně slouží roztok nebo tavenina polymeru. Princip elektrostatického zvlákňování je po- měrně jednoduchý, přesto se jedná o metodu umožňující vyprodukovat velmi jemná vlákna (mikro- nebo nanovlákna) s velkým specifickým povrchem a různou velikostí pórů [46]
[47].
Obrázek 12: Schéma typické aparatury pro elektrostatické zvlákňování. Vytvořeno na základě zdroje [48].
Roztok nebo tavenina zvlákňovaného polymeru je vytlačován(a) skrze trysku, na jejímž konci se vlivem elektrického pole z kapaliny vytváří tzv. Taylorův kužel. Při překročení ur- čitého (prahového, nebo také kritického) napětí z jeho špičky vytryskne proud nabitého ma- teriálu, který je dále elektrickým polem usměrňován na kolektor. Během letu prostorem polymer tuhne a elektrický náboj se hromadí na jeho povrchu. V drobných záhybech a ne- stabilitách proudu materiálu je poté vlivem elektrostatického odpuzování iniciován proces dloužení neboli „bičování“ (anglicky whipping), při kterém dochází k prodlužování a zten- čování vznikajícího vlákna, které je nakonec zachyceno na uzemněný kolektor [49].
V praxi lze zařízení na elektrostatické zvlákňování realizovat různými způsoby. Taylorův kužel nemusí vznikat pouze na vrcholu kapiláry/trysky, ale i z tenké vrstvy roztoku poly- meru. Toho využívá zařízení Nanospider, jehož novější generace využívá pohyblivé hlavice, natírající polymerním roztokem kovovou strunu, která slouží jako jedna z elektrod. Z vrstvy polymeru na struně vznikají mnohačetná ohniska Taylorových kuželů a vznikající vlákna jsou zachytávána na podklad (např. vrstvu spunbondové textilie nebo folii), která prochází zařízením v prostoru mezi elektrodou a protielektrodou a postupně se pohybuje [50]. Zaří- zení Nanospider využívá k syntéze křemičitých nanovláken i Technická univerzita v Liberci.
3.1.2 Parametry zvlákňovacího procesu a jejich vliv na vyprodukovaný materiál Morfologii vznikajících nanovláken či to, zda elektrostatické zvlákňování vůbec úspěšně za- počne lze ovlivnit celou řadou parametrů. Jedním z nejdůležitějších faktorů je viskozita roz- toku. Roztok o příliš nízké viskozitě není schopný dostatečné soudržnosti (kohezní síly jsou příliš malé) a proud polymerního roztoku se tak rozpadá na kapky – místo zvlákňování do- chází k takzvanému electrosprayingu, jehož produktem jsou částice namísto vláken. Na- proti tomu příliš vysoká viskozita vede ke vzniku tlustších vláken (někdy až v řádu mikrometrů) a zvyšuje riziko vzniku defektů. Extrémně vysoká viskozita zcela zabrání vzniku Taylorových kuželů a proces zvlákňování tak nemůže ani začít. Viskozitu lze ovlivnit koncentrací roztoku (tedy poměrem zvlákňovaného polymeru a rozpouštědla), přídavkem tzv. pomocného (auxiliary) polymeru, např. PVA [51], a také závisí na teplotě, při které zvlákňování probíhá. Roli hraje také povrchové napětí roztoku, které nesmí být příliš vy- soké, což by opět bránilo vzniku Taylorových kuželů. Pro zvlákňování jsou obecně vhodnější delší molekuly (s vyšší molekulovou hmotností), nesmí být však příliš rozvětvené [52].
Elektrostatická povaha procesu je příčinou toho, že dalším důležitým parametrem je vodi- vost roztoku. Vodivost je primárně ovlivněna typem zvlákňovaného polymeru a použitého rozpouštědla, lze ji však také ovlivnit přídavkem iontů soli. Vyšší hodnoty vodivosti napo- máhají ke vzniku homogenních vláken a omezují riziko vzniku defektů [53].
