Betydelsen av järnvägsförbindelsen mellan Uppsala och Stockholm har redan understrukits. Före 1860-talets mitt bestod kommunikationen mellan stä-derna av ångbåtstrafik på somrarna och diligens på vintrarna. Restiden med de ofta iskalla diligenserna uppgick till mellan åtta och tio timmar. Ångbå-tarna förkortade restiden med ett par timmar, och färdsättet var dessutom betydligt billigare. Så snart Mälaren blev isfri öppnade ångbåtstrafiken, och den första ångbåtens ankomst blev ett populärt vårtecken, som innebar att vinterns relativa isolering var bruten. Det blev tradition att hälsa den första ångbåten med sång och salut från en kanon vid Hagalund. Passagerarantalet
på ångbåtarna Prins Gustaf, Carl von Linné och Upsala, vilka trafikerade sträckan Stockholm–Uppsala, inklusive mellanstationer, uppgick 1862 till hela 30 890 personer.
Järnvägens genombrott under 1850-talet födde nya förhoppningar om att knyta Uppsala närmare Stockholm. Redan när arbetet med den elektriska telegrafen slutfördes uttryckte Upsala-Correspondenten förhoppningen att telegrafen skulle kunna betraktas som ”den säkraste förelöpare till den af alla så lifligt önskade jernwägen, som wisserligen ännu hörer till de aldra-frommaste önskningarne, men icke destomindre bör kunna i en ej alltför aflägsen framtid sättas i werket”. Järnvägsfrågan skulle emellertid bli både komplicerad och utdragen.
Enligt de allra äldsta svenska järnvägsplanerna skulle Sverige endast ha en stambana, vilken skulle ledas från Stockholm – via Uppsala, Sala, Väster-ås, Köping, Örebro – vidare mot Göteborg. Under 1850-talet kom dock ett nytt, och för Uppsalas del förödande, förslag, enligt vilket staden helt skulle sakna kontakt med de två stambanor som man nu planerade. Båda banorna skulle enligt det nya förslaget utgå i nordlig riktning från Stockholm, men skiljas vid Barkarby, där den ena skulle vika av mot Västerås medan den andra skulle fortsätta mot Sala.
I ett reviderat förslag flyttades den tänkta skiljepunkten från Barkarby till Giresta (dagens tätort Örsundsbro). Från Giresta skulle järnvägen sedan passera Uppsala och fortsätta mot Gävle. Från Uppsalas sida ansågs detta vara en onödig förlängning av resvägen till Stockholm. I stället föreslog man att de båda norrgående banorna skulle skiljas redan i Stockholm, varvid en av banorna skulle ledas rakt norrut längs Sigtunafjärdens östra sida mot Upp-sala. Järnvägskommittén ansåg att mycket talade för denna sträckning, men de avvisade den av försvarspolitiska skäl; avståndet till Roslagskusten skulle bli för litet. Förslaget fick emellertid helhjärtat stöd av såväl regeringen som av Nils Ericson, som ledde arbetet med stambanorna.
Propositionen om en nordlig stambana genom Uppsala bordlades över-raskande av 1856 års riksdag. Trots detta bakslag avsatte Henning Taube plats för järnväg i den stadsplan han upprättade året därpå, och järnvägs frågan började snart dryftas på nytt. Nu hade emellertid Girestaförespråkarna åter mobiliserat sina krafter, vilket föranledde en affekterad järnvägsdebatt åren kring 1860. I maj 1863 fick frågan till sist sin lösning, vilken innebar att järn-vägen drogs direkt från Stockholm till Uppsala. Ett halvår senare inleddes byggnadsarbetet med järnvägen i staden, vilket firades med en stor fest på Gillet. Beslutet att draga järnvägens sträckning via Uppsala framstod som stadens andra viktiga seger på kort tid. Bara några år tidigare hade frågan om universitetets eventuella flyttning definitivt skrinlagts.
Järnvägen når Uppsala
Den 19 september 1866 invigdes järnvägen i Uppsala av Carl XV. På programmet stod bland annat en festkonsert i Carolinasalen under Oscar Arpis ledning. I samband med festligheterna höll landshövdingen Adolf Hamilton ett tal, där han underströk järnvägens vetenskapliga betydelse. Nu kunde Sveriges politiska respektive akademiska huvudstad kny-tas närmare till varandra:
Den bana, som i dag inviges, har äfven en storartad betydelse, den rycker icke allenast snart sagdt intill hufvudstadens portar ett af rikets bördigaste landskap och räcker ut handen mot den avlägsna Norden utan, vad som är vida vigtigare, den förenar nära och innerligt med rikets hufvudstad den ort, der Sveriges ungdom i fyra århundraden sökt och funnit sin bildning, den ort, som med rätta kan kallas den svenska bildningens hufvudstad, den ort, hvars namn över hela landet väcker gossens förhoppning, ynglingens glädje och hos den grånade mannen lifvar ungdomens minnen och kommer hjertat att slå med livligaste pulsslag. Den låga, som brinner i vetenskapsmannens lampa, sprider i vår tid sitt ljus i världens doldaste gömslen, den lyser den anspråkslöse odlarens och bergsmannens väg i bergens schakter. Den sprider värma och ljus i den rikes palats och den fattiges koja, den lättar arbetarens möda och sätter fart i industrins stora svänghjul, den visar seglaren väg på oceanen och gör antipoden till vår granne. Därför kan och får nu vetenskapsmannen lika litet skilja sig från verlden, blifva efter sin tid, som ett folk kan och får undandraga sig den vetenskapliga forskningens inflytande, om det skall försvara sin plats inom civilisationen. Genom att öka och befordra detta inflytande, genom att underlätta idéernas vexelverkan skall den industrins stråkväg, som genom denna nya stambana öppnas, mäktigt befordra svenska folkets framåtgående i sann och förädlande bildning.
Från festkonserten för den nya järnvägen i Carolinasalen den 20 september 1866. Träsnitt i Ny Illustrerad Tidning.
Järnvägen invigdes av Carl XV i september 1866, varefter det blev möj-ligt att resa till Stockholm på två och halv timme enkel resa. I samband med järnvägsinvigningen förlängdes Gräsgränd fram till stationsbyggnaden och döptes om till Bangårdsgatan. Den nya gatan var bredare än den gamla grän-den och fick med tigrän-den en tidstypisk boulevardkaraktär med trädplante-ringar. I samband med järnvägens tillkomst bytte Stadsdikesgatan namn till det mer ståtligt klingande Kungsgatan. Det gamla namnet hade dessutom förlorat sin innebörd, eftersom stadsdiket i det närmaste var helt igenfyllt vid mitten av 1860-talet. År 1873 fick Uppsala en andra järnvägssträcka som förband staden med Krylbo. Följande år öppnades järnvägstrafiken mellan Uppsala och Gävle.